Спосіб виявлення рнк тешовірусів методом зворотно-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції
Номер патенту: 51560
Опубліковано: 26.07.2010
Автори: Бова Тетяна Олександрівна, Головко Анатолій Миколайович, Сорока Віктор Іванович, Кацимон Вадим Васильович, Дерев'янко Станіслав Васильович
Формула / Реферат
Спосіб виявлення РНК тешовірусів методом зворотно-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції, що включає виділення РНК з досліджуваних проб, ампліфікування специфічної ділянки кДНК інфекційного агента за допомогою зворотно-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції з використанням двох штучно синтезованих оригінальних праймерів, який відрізняється тим, що використані праймери мають наступні послідовності:
Sense Primer: TeschoF51 - 5'-CCAGCAGCCTCTGTTCAGAAAG,
Antisense Primer: TeschoR51 - 5'-GC(A/G)TACTTGTATGAGGCCCATC.
Текст
Спосіб виявлення РНК тешовірусів методом зворотно-транскриптазної полімеразної ланцюго 3 51560 4 Таблиця 1 Температурні і часові параметри ампліфікації специфічної ділянки кДНК тешовірусів № циклу 1 2 3 4 5 Температура 95°С 94°С 58°С 74°С 94°С 58°С 73°С 72°С У результаті отримують продукт ампліфікації розміром 650 нуклеотидних пар. Після закінчення ампліфікації проби досліджують стандартним методом електрофорезу в агарозному гелі (креслення). На кресленні наведена електрофореграма продуктів ампліфікації ЗТ ПЛР: М - маркери розмірів, пари нуклеотидів; 140, 141, 143, 145-149, 150-152, 154 - штами тешовірусів свиней; 142 - штам ентеровірусу свиней А; 144, 153 - штами ентеровірусу свиней В; 155 - культура клітин СНЕВ. На кресленні наведена електрофореграма продуктів ампліфікації ДНК, де відображено результати досліджень 16 зразків, з яких 15 - матеріал, інфікований штамами тешо-, ентеровірусів свиней, 1 - суспензія культури клітин СНЕВ. У 12 зразках виявлено РНК тешовірусів свиней. Отже, розроблено спосіб виявлення РНК тешовірусів на основі зворотно-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції з використанням оригінальних штучно синтезованих олигонуклеотидних праймерів. Спосіб виявлення РНК тешовірусів на основі ЗТ ПЛР демонструється таким прикладом. Приклад. Пробу інфікованого матеріалу об'ємом 100мкл вносимо у пластикову пробірку ємністю 1,5см3 після чого виділяємо РНК набором реагентів для виділення РНК. У результаті отримуємо зразок рибонуклеїнової кислоти для постановки Комп’ютерна верстка М. Ломалова Час 5 хв. 1 хв. 1 хв. 1 хв. 0,5 хв. 0,5 хв. 0,5 хв. 5 хв. Зберігання Кількість циклів 1 5 35 1 реакції зворотньої транскрипції. Отриману в реакції зворотньої транскрипції кДНК використовуємо для наступної постановки полімеразної ланцюгової реакції. Отриману кДНК (10мкл) поміщуємо у пробірку ємністю 0,5см3 і додаємо 15мкл ПЛР-буфера, 2,5мкл dNTP, по 2,5мкл праймерів, 0,25мкл Tagполімерази та 1 краплю мінерального масла. Вміст пробірки струшуємо і центрифугуємо, а потім поміщуємо в ампліфікатор "Терцик", якому задаємо вищевказану програму. Детекцію продуктів реакції проводили за допомогою електрофорезу у 1,5% агарозному гелі (забарвленому бромідом етидію) з використанням трис-боратного буфера при градієнті напруги 10В/см. Результати оцінювали при перегляді гелю після електрофорезу на трансілюмінаторі під УФсвітлом по наявності (або відсутності) червонопомаранчевих фрагментів ДНК розміром 650 пар нуклеотидів. Наявність описаного фрагменту доводить присутність РНК тешовірусів у досліджуваному зразку. Література 1. Рекомендації з діагностики, профілактики та ліквідації тешо-, ентеровірусних енцефаломієлітів свиней / Сорока В.І., Бокун А.О., Дерев'янко С.В. та інш. - Чернігів: ЦНТЕІ, 2006. - 28 с. 2. Detection of porcine enteroviruses by nRTPCR: differetion of CPE groups I-III specific primer sets / Zell R., Krumbholz A., Henke A. et al. // J. Virol. Methods. - 2000. - Vol. 88, №2. - P. 205-218. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюMethod for detection of rna of teshovirus by means of reverse transcriptase polymerase chain reaction
Автори англійськоюDerevianko Stanislav Vasyliovych, Holovko Anatolii Mykolaiovych, Katsymon Vadym Vasyliovych, Bova Tetiana Oleksandrivna, Soroka Viktor Ivanovych
Назва патенту російськоюСпособ обнаружения рнк тешовирусов методом обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции
Автори російськоюДеревьянко Станислав Васильевич, Головко Анатолий Николаевич, Кацимон Вадим Васильевич, Бова Татьяна Александровна, Сорока Виктор Иванович
МПК / Мітки
МПК: C12N 15/11
Мітки: спосіб, тешовірусів, рнк, виявлення, полімеразної, реакції, зворотно-транскриптазної, ланцюгової, методом
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/2-51560-sposib-viyavlennya-rnk-teshovirusiv-metodom-zvorotno-transkriptazno-polimerazno-lancyugovo-reakci.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб виявлення рнк тешовірусів методом зворотно-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції</a>