Спосіб визначення впливу кардіотрилу та його метаболіту на метаболізм оксиду азоту в міокарді щурів при гіпоксії, викликаній натрію фторидом

Спосіб визначення впливу кардіотрилу та його метаболіту на метаболізм оксиду азоту в міокарді 3 52940 ність NO-синтази (NOS), вміст нітратів, рівень сумарних SH-груп і активності глутатіонредуктази (ГР), отримані результати порівнюють з контролем і при зміні показників визначають вплив цих препаратів на метаболізм оксиду азоту в міокарді щурів при гіпоксії, викликаній натрію фторидом. Спосіб здійснюється наступним чином: Досліди проведені на 30 білих безпородних щурах лінії Wistar обох статей масою 210,0-250,0, що отримані з віварію Запорізького державного медичного університету. Всі експерименти виконані згідно «Методичних рекомендацій ДФЦ МОЗ України» [6]. Фторид натрію вводили внутрішньоочеревинно в дозі 10 мг/мл. Досліджувані препарати вводили внутрішньоочеревинно за 30 хвилин до введення фториду в дозах - кардіотрил - 5 мг/кг, МТ - 5 мг/кг, АТФ-лонг - 10 мг/кг. Експозиція 60 хвилин. Метаболізм NO оцінювали по активності NO-синтази (NOS), вмісту нітратів, рівню сумарних SH-груп і активності глутатіонредуктази (ГР). Стабільні метаболіти NO визначали по рівню нітратів в реакції Грісса, активність NOS - по різниці між швидкістю окислення NADPH, реєстрували флюорометричним методом [5, 12]. Вміст сумарних SHгруп визначали спектрофотометричним методом по реакції з 5,5 - дитіобіс - 7-нітробензойною кислотою. Концентрацію білка оцінювали за методом Бредфорда. Нітротирозин визначали в гомогенаті серця твердофазним імуносорбентним методом по набору фірми ELISA (№ 4513К19). Статистичну обробку результатів проводили з використанням tкритерію Стьюдента [10]. Вперше про роль ендотелію в регуляції судинного тонусу було висвітлено в 1980 році. Реалізація функції ендотелію відбувається завдяки речовині, що виділяється ендотеліальними клітинами. Речовину названо ендотелій-залежним релаксуючим фактором (ЕЗРФ), індентифікованим як оксид азоту (NO). Ускладнення, що пов’язані з дефіцитом даної сполуки є: гострий інфаркт міокарду, нестабільна стенокардія, фібриляція передсердь, тромбогенні захворювання судин, тромболітична мікроангіопатія, тромботична тромбоцитопенічна пурпура, прееклампсія, тромбемболічні цереброваскулярні захворювання. В організмі NO синтезу 4 ється клітинами із амінокислоти L-аргінін. Цей процес представляє собою комплексну окислювальну реакцію, що каталізується ферментом NOсинтазою (NOS). Крім NO утворюється одночасно сполука L-цитролін, що знову рециклюється, поповнюючи внутрішньоклітинні запаси аргініну. Синтезувати NO здатні більшість клітин організму людини. Найбільш вивчені три основні ізоформи NOS: нейрональна, макрофагальна та ендотеліальна. Нейрональна і ендотеліальна ізоформи ферменту постійно присутні в клітині та називаються конститутивними (інгредієнтними), а макрофагальна - є індуцибельна і синтезується у відповідь на зовнішню дію на клітину. Індуцибельна ізоформа NOS проявляє активність після зовнішньої дії на клітину, як правило, через 6-8 годин - час необхідний для активації генів і початку синтезу ферментів та здатна продукувати в 100-1000 раз більше NO, ніж конститутивні ізоформи. На відміну від класичних медіаторів, NO не депонується в клітині, а вільно і швидко транспортується із місць утворення. Будучи ліпофільним, NO вільно та швидко переходить через поверхневі мембрани в гладком’язеві клітини судин, здійснюючи необхідну міжклітинну комунікацію та регуляцію в тканинах. Як видно з таблиці - фторид натрію призводить до порушень в системі метаболізму ендогенного NO міокарду. Даний блокатор гліколізу пригнічує активність NO-синтази (з 37,8±3,0 мкм/мг/хв до 8,2±1,1 мкм/мг/хв.), підвищує рівень маркеру нітрозуючого стресу - нітротирозину (з 16,2±0,9 нмоль/г до 34,5±3,8 нмоль/г), що характерно для розвитку гіпоксії. Паралельно реєструвалось зниження основних показників тіол-дисульфідної системи - відновлених тіолів (з 154,3±10,3 мкм/г до 31,2±5,0 мкм/г) і активність глутатіонредуктази (з 31,2±2,0 мкм/мг/хв до 8,1±1,3 мкм/мг/хв) в міокарді. Фторид натрію призводить до розвитку гіпоксії в міокарді внаслідок чого в активному центрі NOсинтази відбувається окислювальна модифікація NO і його дериватів. В результаті стресу, викликаного фторидом натрію, реалізувалося окислення, нітрозування відновлених тіолів і пригнічення активності глутатіонредуктази [11]. Таблиця Вплив похідних триазолу та аденілових нуклеотидів на метаболізм NO в міокарді щурів при інтоксикації фторидом натрію (ФН) Показники Інтактні тварини Активність NO-синтази, 37,8±3,0 мкм/мг/хв Нітротирозин, нмол/г 16,2±0,9 Відновленні SH-групи, 154,3±10,3 мкм/г ГР, мкм/мг/хв 31,2±2,0 ФН (контроль) ФН + кардіотрил ФН + МТ ФН + АТФ-лонг 8,2±1,1 15,2±2,0* 25,4±3,4** 8,5±1,3 34,5±3,8 21,2±2,6* 18,5±2,1** 31,6±2,0 31,2±5,0 58,8±6,3* 86,7±3,2** 33,1±4,2 8,1±1,3 11,3±0,95* 17,5±1,6** 9,2±1,7 Примітка: * - р≤0,05 по відношенню до контролю; ** - р≤0,05 по відношенню до кардіотрилу та АТФ-лонгу Отримані результати свідчать, що протекторна дія АТФ-лонг не реалізується внаслідок позитивно го впливу на зміни в системі NO і тіолдисульфідної системи, а обумовлена підвищенням 5 52940 ресурсів в міокарді, нормалізацією показників прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу та активності іонтранспортних систем. Кардіотрил та його метаболіт обмежували стресорну дію фторида натрію. Про це свідчить зниження рівня маркеру нітрозуючого стресу - нітротирозину (кардіотрил - з 34,5±3,8 нмоль/г до 21,2±2,6 нмоль/г, метаболіт - з 34,5±3,8 нмоль/г до 18,5±2,1 нмоль/г) на фоні поліпшення показників тіол-дисульфідної системи: відновленні тіоли (кардіотрил - з 31,2±5,0 мкм/г до 58,8±6,3 мкм/г, метаболіт - з 31,2±5,0 мкм/г до 86,7±3,2 мкм/г) та активність глутатіонредуктази (кардіотрил - з 8,1±1,3 мкм/мг/хв до 11,3±0,95 мкм/мг/хв, метаболіт - з 8,1±1,3 мкм/мг/хв до 17,5±1,6 мкм/мг/хв) в групах тварин, що отримували похідні тріазолу. Препарати викликали активуючий ефект по відношенню NO - синтази (кардіотрил - з 8,2±1,1 мкм/мг/хв до 15,2±2,0 мкм/мг/хв., метаболіт - з 8,2±1,1 мкм/мг/хв до 25,4±3,4 мкм/мг/хв.), кардіопротекторна дія реалізується завдяки пригнічення оксидативного стресу та усунення мітохондріальної дисфунуції. Отримані дані констатують наявність у похідних тріазолу - кардіотрилу та його метаболіту, кардіопротекторної дії при блокаді гліколізу та розвитку гіпоксії, викликаної фторидом натрію. Необхідні подальші дослідження з вивчення механізмів захисної дії АТФ-лонг, кардіотрилу та його метаболіту при різних видах гіпоксії. Фторид натрію призводить до пригнічення активністі NO-синтази на 20 %, підвищення нітротирозину на 20 %. Блокатор гліколізу знижує основні показники тіол-дисульфідної системи - відновлених тіолів на 20 % і активність глутатіонредуктази на 25 % в міокарді щурів. Кардіотрил та його метаболіт обмежували стресорну дію фторида натрію завдяки пригніченню оксидативного стресу та усунення мітохондріальної дисфункції. Література: 1. Галенко А.С., Шуленин С.Н. Способы немедикаментозной и фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции. //«ФАРМиндексПрактик». - 2006. - № 10. - С. 2-10. Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко 6 2. Георгиевский Г.В., Куликов А.Ю. Определение примесей в отечественных субстанциях - производных 1,2,4-триазола методом ОФ ВЭЖХ //Фармаком. - 2009. - №2. - С. 87-98. 3. Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А. Нарушения биоэнергетических процессов. Общие механизмы токсического действия. - Л.: Наука, 1986. - 289 с. 4. Головацкий И.Д., Ивасик Б.Д. Влияние внутривенного введения натрия фторида на гликолиз и пентозный цикл в крови //Докл. АН УССР. - 1963. - № 1. - С. 504-507. 5. Горбунов Н.В. Активация образования окиси азота, опосредованная метаботропными глутаматными рецепторами в первичных культурах клеток-зерен мозжечка //Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1995. - №7. - С. 40-48. 6. Доклинические исследования лекарственных средств. Методические рекомендации. //Под ред. член-кор. АМН Украины А.В. Стефанова Киев: Авицена, 2002. - 568 с. 7. Кава Т.В., Клименко О.В., Чекман І.С. Клініко - фармакологічні властивості АТФ і АТФ-лонг //Фітотерапія. - 2007. - № 1. - С. 3-14. 8. Клименко О.В., Чекман І.С., Горчакова Н.О. Антитоксичні властивості препарату АТФ-лонг //Ліки. - 2005. - №3-4 - С. 4-11. 9. Коваленко В.М. Стан здоров’я народу України у зв'язку із хворобами системи кровообігу та можливі шляхи його покращення: Аналітичностатистичний посібник для лікарів-кардіологів, ревматологів, терапевтів загальної практики. - Київ, 2008. - 124 с. 10. Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н. Статистика в науке и бизнесе. - Киев.: Изд-во «Морион». - 2002. - 639 с. 11. Лук'янчук В.Д., Савченкова Л.В., Немятих О.Д., Радионов В.М. Пошук і експериментальне вивчення потенційних протигіпоксичних засобів. Медичні рекомендації. - К., 2002. - 27 с. 12. Патент № 13132 (Україна), МПК J01N33/48.- (UA). - № 200509119 /Колесник Ю.М., Беленічев І.Ф., Абрамов А.В., Павлов СВ. /Спосіб визначення активності ферменту NO-синтетази в гомогенатах тканин. - Заявл. 27.09.2005. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601