Спосіб визначення енергомодулюючої дії препаратів різних хімічних структур при кардіотоксичній дії натрію нітропрусиду у щурів

Спосіб визначення енергомодуюючої дії препаратів різних хімічних структур при кардіотоксич 3 52938 падінням НАДН при 340нм, лактату - за методом Хохорту за підвищенням НАДН при 340нм. Активність КФК-цт та КФК-мх в міокарді визначали після хроматографічного розділення за оптичним тестом Варбурга. Активність малатдегідрогенази визначали спектрофотометрично із застосуванням оптичного тесту Васбурга. Для визначення функції мітохондрій встановили відкриття мітохондріальної пори (поглинання 540нм) та мембранний потенціал заряду. Статистичну обробку результатів проводили методами математичної статистики з застосуванням пакетів прикладних програм «Біостатика для Windows, версія 4.03» та «Microsoft Excel 2002». Отриману різницю співставляємих величин оцінювали з застосуванням t-критерію Стьюденту [7]. Натрію нітропрусид призводить до зниження активності мітохондрій міокарду щурів, про що свідчить відкриття мітохондріальної пори (погли 4 нання 540нм - знизилось з 137,4 5,2 до 48,7 1,8), зниження мембранного потенціалу заряду ( ) з 58,2 4,1 до 15,4 1,1, а також гальмування транспорту і утилізації енергії (зниження активності креатинфосфокінази мітохондріальної (мх-КФК) з 0,787 0,05мкм/мг/хв до 0,418 0,01мкм/мг/хв і креатинфосфокінази цитозольної (цт-КФК) з 1,147 0,02мкм/мг/хв до 0,900 0,01мкм/мг/хв. Токсичний ефект натрію нітропрусиду характеризується дискоординацією циклу Кребса (зниження рівня малату з 0,72 0,02мкм/г до 0,35 0,01мкм/г, ізоцитрату з 0,546 0,03мкм/г до 0,330 0,01мкм/г, активності мітохондріальної малатдегідрогенази (МДГ) з 7,54 0,38мкм/г/хв до 3,10 0,18мкм/г/хв.), а також змінами показників гліколізу: рівня пірувату з 0,15 0,02мкм/г до 0,10 0,01мкм/г і підвищенням рівня лактату з 2,56 0,20мкм/г до 5,45 0,12мкм/г в міокарді. Таблиця Вплив АТФ-лонг, кардіотрилу та метаболіту на показники енергетичного обміну міокарду при інтоксикації натрію нітропрусидом (НН) Досліджувані показни- Інтактні тварики ни Лактат, мкм/г 2,56 0,20 Піруват,мкм/г 0,15 0,02 Ізоцитрат, мкм/г 0,546 0,03 Малат, мкм/г 0,72 0,02 МДГ-мх, мкм/г/хв. 7,54 0,38 КФК-цт, мкм/мг/хв. 1,147 0,02 КФК-мх, мкм/мг/хв 0,787 0,05 Відкриття мітохондріальної пори (поглин., 137,4 5,2 540 нм) Мембранний потенці58,2 4,1 ал заряду ( ) НН НН + кардіотрил НН+МТ НН + АТФ-лонг 5,45 0,12* 0,10 0,01* 0,330 0,01* 0,35 0,01* 3,10 0,18* 0,900 0,01* 0,418 0,01* 3,68 0,21** 0,14 0,02** 0,581 0,01** 0,68 0,02** 7,68 0,41** 1,068 0,01** 0,521 0,01** 3,88 0,11** 0,15 0,01** 0,538 0,01** 0,81 0,01** 8,58 0,22** 1,288 0,03** 0,675 0,01** 3,68 0,11** 0,12 0,01** 0,489 0,01** 0,42 0,01** 4,23 0,31** 1,008 0,01** 0,480 0,01** 48,7 1,8* 95,1 1,5** 115,4 2,1** 56,5 1,3** 15,4 1,1* 30,4 3,1** 43,7 1,8** 16,3 1,4** Примітка: * - р 0,05 по відношенню до інтактних тварин ** - р 0,05 по відношенню до НН Ішемія міокарду характеризується недостатнім постачанням тканини киснем, виснаженням запасу АТФ і креатинфосфату в клітині, «переключенням» гліколізу з аеробного на анаеробний шлях для компенсаторної продукції макроергів в мітохондріях, посиленням внутріклітинного ацидозу, виникненням дисфункції іонних каналів, підвищенням рівня натрію, кальцію і зниженням калію в цитоплазмі кардіоміоцитів [12]. Гліколіз відбувається в різних тканинах, його значення для різних тканин різне. Цей головний і унікальний шлях утилізації кисню протікає як в присутності кисню - аеробні умови, так і при його відсутності - анаеробні умови. Для утворення АТФ шляхом гліколізу в анаеробних умовах (ішемія, гіпоксія) необхідна більша кількість глюкози, ніж в аеробних умовах. Цей процес здійснюється в результаті окислювального фосфорилювання в піруватдегідрогеназному циклі трикарбонових кислот, внаслідок якого утворюється піруват, що призводить до синтезу незначної (менше 10%) кількості АТФ в кардіоміоцитах. Конверсія пірувату в ацетил-коензим А відбувається в мітохондріях за допомогою ферменту піруватдегідрогенази. Подальше окислення двох моль пірувату в загальних шляхах катаболізму супроводжується синтезом 30 моль АТФ. Аеробний гліколіз є більш продуктивним глюкозним метаболізмом з погляду кількості енергії, що синтезується. Анаеробний розпад включає реакції розпаду глюкози до пірувату, але з подальшим перетворенням пірувату в лактат (молочну кислоту). Особливо важливою стає роль гліколізу в утворенні АТФ у відсутності кисню. Тканини з підвищенною гліколітичною активністю здатні зберігати активність і в період кисневого голодування, тому в умовах ішемії активація гліколітичних шляхів утворення АТФ має першочергове значення. Під час енергодефіцитного стану кардіоміоцити починають використовувати глюкозу з ендогенного глікогену, оскільки вона вже фосфорильована (на відміну від екзогенної глюкози, що транспортуєть 5 ся в клітину), і її утилізація не вимагає витрат АТФ для початкової активації. Проте запаси глікогену в кардіоміоцитах виснажуються достатньо швидко, тому виникає необхідність активації резервних шляхів утворення АТФ. Для короткочасної підтримки енергетичного стану серця, в умовах обмеженого постачання кисню, має значення реакція розпаду однієї молекули глюкози до двох молекул пірувату за допомогою фосфогліцераткіназної і піруваткіназної реакцій, в результаті яких АДФ фосфорилюється до АТФ. Активність піруватдегідрогенази вважається головним чинником в гліколітичному шляху утворення енергії. З однієї молекули глюкози при трансформації в піруват утворюються дві молекули АТФ, а при подальшому окисленні пірувату в циклі трикарбонових кислот – 34 молекули АТФ. При посиленні ішемії єдино можливим механізмом синтезу АТФ стає анаеробний гліколіз з утворення АТФ і лактату. Утворення молочної кислоти не є кінцевим продуктом обміну речовин. Під дією лактатдегідрогенази молочна кислота може окислюватись знову, утворюючи піруват, який і бере участь в подальших перетвореннях. Надлишок молочної кислоти формує тканинний лактатацидоз, який роз'єднує окислювальне фосфорилування і викликає перевантаження кардіоміоцитів Са2+. В результаті формується гіпоксичний тип метаболізму. Тому зниження вмісту внутріклітинного лактату за рахунок трансформації його в піруват є ключовим моментом метаболічної терапії. В патологічній дії окислених білків на клітину, є їх властивість знижувати функцію білків в ланцюзі переносників електронів, активності АТФ-ази, вибірковості дії транспортних пір [4]. Зміна Red/Ox потенціалу мітохондріальної мембрани відображається на дисфункції каскаду дихального ланцюга, порушуючи метаболізм кардіоміоциту. Це призводить до порушення окислювального метаболізму в клітині, а також до розвитку мітохондріальної дисфункції [2]. При дії на клітину різних токсичних агентів мітохондріальна дисфункція супроводжується зміною проникності внутрішньої мембрани, яка пов'язана з відкриттям мітохондріальної пори (МП) (mitochondrial permeability transition pore, MPTP) мультибілкового мегаканалу неспецифічної проникності. Індукція МП є провідною ланкою патогенезу такого стану як ішемічна хвороба серця. Серед причин розвитку МП-залежної мітохондріальної дисфункції розрізняють порушення біосинтезу оксиду азоту (NO) та виникнення дефіциту енергетичних запасів клітини. Введення експериментальним групам тварин кардіотрилу, його метаболіту та АТФ-лонгу в різному ступені проявляє енергомодулюючу дію. АТФ-лонг (10мг/кг) в меншій мірі не призводить до вірогідних змін відносно відкриття мітохондріальної пори, мембранного потенціалу заряду мітохондрій, транспорту енергії, окиснення в циклі Кребсу, активності гліколізу. Кардіотрил і його активний метаболіт на фоні інтоксикації натрію нітропрусидом мали більш виражений порівнянно з АТФ-лонг енергомодулюючий ефект. В групах тварин одержуючих ці препарати реєстрували зниження прояву мітохондріальної дисфункції - гальмування 52938 6 відкриття мітохондріальної пори, збільшення заряду мітохондрій, збільшення макроергічних фосфатів в мітохондріях міокарду, підвищення активності КФК-мх і КФК-цт. Кардіотрил і його метаболіт призводять до вірогідної активації гліколізу та циклу трикарбонових кислот, а саме збільшення продукції ізоцитрату і малату і підвищення активності МДГ-мх. Внаслідок цього можна стверджувати, що енерготропна дія МТ і кардіотрилу реалізується через активуючий вплив на компенсаторний малатаспартатний шунт. Отримані результати, свідчать, що енерготропна замісна терапія призводить до зменшення проявів мітохондріальної дисфунції, викликаної натрію нітропрусидом. Перспективним можна вважати використання метаболітних препаратів, що впливають на ланки формування мітохондріальної дисфункції і активації компенсаторних шунтів енергії в мітохондріях. Натрію нітропрусид знижує в міокарді рівень пірувату на 33 %, ізоцитрат на 40 %, малату - на 51 %, активність МДГ-мх - в 2,4 рази, КФК-цт - на 21 %, КФК-мх - на 47 %. Спостерігалось відкриття мітохондріальної пори і при цьому зменшувалось поглинання в 2,8 рази, мембранний потенціал заряду в 3,8 рази та підвищення рівня лактату в 2,1 рази. Кардіотрил та його метаболіт в більшому ступеню, а також АТФ-лонг, що були введені за 30 хвилин до натрію нітропрусиду запобігали змінам показників енергопродукуючої функції міокарду щурів при введенні натрію нітропрусиду. Література: 1. Амосова Е.Н. Метаболическая терапия повреждений миокарда, обусловленного ишемией, новый подход в лечении ишемической болезни сердца и сердечной недостаточности //Укр. кардиол. журн. - 2000. - № 4. - С. 86-92. 2. Беленичев И.Ф., Колесник Ю.М., Павлов СВ. и др. Митохондриальная дисфункция при церебральной патологии. Нейропротекция цереброкурином. //Международный неврологический журнал. - 2008. - № 4 (20). - С. 20-26. 3. Галенко-Ярошевский П.А., Чекман И.С., Горчакова Н.А. Очерки фармакологии средств метаболической терапии. - М.: Медицина, 2001. - 240 с. 4. Губский Ю.И., Беленичев И.Ф., Павлов С.В. и др. Токсикологические последствия окислительной модификации белков при различных патологических состояниях (обзор литературы) //Совр. пробл. токсикол. - 2005. - № 3. – С. 20-26. 5. Доклинические испытания лекарственных средств. Методические рекомендации под ред. член-кор. АМН Украины А.В. Стефанова //Киев: Авиценна, 2002. - 568 с. 6. Коваленко В.М. Стан здоров'я народу України у зв'язку із хворобами системи кровообігу та можливі шляхи його покращення: Аналітичностатистичний посібник для лікарів-кардіологів, ревматологів, терапевтів загальної практики. - Київ, 2008. - 124 с. 7. Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н. Статистика в науке и бизнесе. - Киев: Изд-во «Морион», 2002. - 639 с. 7 52938 8. Лутай М.И. Медикаментозное лечение стабильной стенокардии: доказательная эффективность и нерешенные проблемы //Доказова медицина та огляд консенсусів в лікуванні хвороб органів кровообігу: Вибрані лекції Української кардіологічної школи ім. М.Д. Стражеска. - К.: Максимов, 2003. - С. 138-168. 9. Мазур И.А., Волошин Н.А., Чекман И.С и др. Тиотриазолин: фармакологические аспекты и клиническое применение - Запорожье, 2006. - 154 с. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 8 10. Мазур И.А., Чекман И.С, Беленичев И.Ф. и др. Метаболитотропные препараты. - Запорожье, 2007. - 309 с. 11. Пархоменко А.Н. Метаболические подходы к лечению острых и хронических форм ишемической болезни сердца и сердечной недостаточности //Журн. практ. Врача. - 1999. - № 1. - С. 22-25. 12. Чекман И.С., Горчакова И.О., Французова СБ., Минцер В.О. Кардиопротекторы - клиникофармакологические аспекты //Український мед. часопис. - 2003. - № 6 (38). - С. 18-25. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601