Спосіб діагностики стану місцевого імунітету ротової порожнини

Спосіб діагностики стану місцевого імунітету ротової порожнини, що передбачає проведення імуногістохімічних досліджень слини, який відрізняється тим, що з відібраних зразків слини отримують лейкоцитарний концентрат, готують мазки, в отриманих мазках визначають вміст субпопуляцій імунокомпетентних клітин CD4, CD11, CD16 та при збільшенні вмісту останніх на 10 % та більше судять про порушення клітинної та гуморальної ланок місцевого імунітету ротової порожнини. (19) (21) u201005915 (22) 17.05.2010 (24) 25.10.2010 (46) 25.10.2010, Бюл.№ 20, 2010 р. (72) ГОЖЕНКО АНАТОЛІЙ ІВАНОВИЧ, БОГДАНОВА ОЛЕКСАНДРА ВІКТОРІВНА, ДЕГТЯРЕНКО ТЕТЯНА ВОЛОДИМИРІВНА (73) ГОЖЕНКО АНАТОЛІЙ ІВАНОВИЧ, БОГДАНОВА ОЛЕКСАНДРА ВІКТОРІВНА, ДЕГТЯРЕНКО ТЕТЯНА ВОЛОДИМИРІВНА 3 5. Просушують їх протягом 2 годин при кімнатній температурі, потім фіксують в парах 10% нейтрального формаліну (3 хв.); 6. Промивають мазки лейкоконцентрату в забуферному фізіологічному розчині (ЗФР, 5 хв.). Обробляють 10 % розчином Н2O2 (10 хв.) та інгібують ендогенну пероксидазу; 7. Розміщують мазки у вологій камері, наносять 20 мкл первинних мкАТ на 2 години так, щоб реагент був рівномірно розподілений по всій площі зони реакції; 8. Промивають мазки в ЗФР (5 хв.), розміщують у вологій камері, наносять 20 мкл кролячої сироватки проти імуноглобуліну миші на 1 годину; 9. Промивають мазки в ЗФР (5 хв.), розміщують у вологій камері, наносять 20 мкл ПАПкомплексу (комплекс пероксидаза - антипероксидаза) на 1 годину; 10. Обробляють 3,3 - діамінобенззідіном тетрахлориду (10 хв.), фарбують 1% розчином метилового зеленого. Наводимо приклади конкретного виконання способу. Приклад 1. Хворий А. звернувся до лікаря стоматолога зі скаргами на біль у ротової порожнини при прийомі їжі. При огляді: гіперемія слизової оболонки ротової порожнини, висипання на внутрішній поверхні щік і губ розміром з шпилькову голівку. Пацієнт переніс ГРВ. Попередній діагноз лікаря - гінгівіт. Пацієнту призначено полоскання рота. Наступного дня хворий А. знову звернувся за медичною допомогою. Протягом ночі кількість висипань значно збільшилася, з'явилися гнійні виділення, виникли печія, сильний біль в ротовій порожнині. При огляді відзначена гіперемія (температура 37,5°С), головний біль. Для діагностики та оптимізації лікування хворому запропоновано провести дослідження МІ. При обстеженні пацієнта А. медичним персоналом були вжиті заходи, спрямовані на забезпечення безпеки пацієнта. При обстеженні персонал дотримувався морально-етичних норм, відповідно до принципів Гельсінської декларації прав людини, Конвенції Ради Європи про права людини та біомедицину, відповідних законів України. Хворий А. здав біологічний матеріал добровільно, персонал лабораторії не чинив тиску на хворого. Основні етапи проведення аналізу: 1) хворий А. шляхом спльовування заповнив дві пластикові пробірки слиною (кількість слини приблизно 4-5 мл), 2) проведено очистку слини від харчових домішок шляхом центрифугування 15 хв. при 2500 об/хв., 3) отриманий осад, що містить лейкоконцентрат, відмили у фізіологічному розчині - 10 хв. при 1200 об/хв., 4) з отриманого лейкоконцентрата приготували мазки, 5) мазки просушили 2 години при кімнатній температурі, потім мазки зафіксували в парах 10% нейтрального формаліну (час 3 хвилини), 6) мазки з лейкоконцентрата промивали в забуференому фізіологічному розчині 5 хв., інгібува 54172 4 ли ендогенну пероксидазу за допомогою обробки 10% розчином перекису водню (10 хв.), 7) мазки розміщували у вологій камері, завдавали 20 мкл первинних моноклональних антитіл так, щоб реагент був рівномірно розподілений по всій площі зони реакції; 8) промивали мазки в ЗФР (5 хв.) завдавали 20 мкл кролячій сироватки проти імуноглобулінів миші (час інкубації - 1 год.); 9) мазки промивали в ЗФР (5 хв.) завдавали 20 мкл ПАП - комплексу ( інкубація - 1 год.); 10) обробляли мазки 3,3 - діамінобензідіном гідрохлориду (інкубація -10 хв.), фарбували 1% розтином метилового зеленого 10 хв. Результати дослідження місцевого імунітету хворого А. - CD4-26%, CD11-36%, CD16-22%. Дані аналізу (підвищення вмісту, експресія лейкоцитів - нейтрофілів, макрофагів, гранулоцитів в ротовій порожнині ) дозволили лікарю підтвердити діагноз (гнійний стоматит), оптимізувати лікування хворого А. Приклад 2. Доброволець М. висловив бажання здати аналіз слини для діагностики місцевого імунітету ротової порожнини. На момент здачі аналізу він не висував жодних скарг на стан свого здоров'я. Медичний персонал лабораторії не чинив тиску на М. Здача слини була здійснена добровільно, без примусу. При обстеженні медичний персонал дотримувався морально-етичних норм, відповідно до принципів, опублікованих у Гельсінській декларації прав людини, Конвенції Ради Європи про права людини та біомедицину, відповідних законів України. Основи етапи проведення аналізу: 1) здоровий доброволець М. шляхом спльовування заповнив дві пластикові пробірки слиною (кількість слини приблизно 4-5 мл), 2) проведено очистку слини від харчових домішок шляхом центрифугування 15 хв. при 2500 об/хв, 3) отриманий осад, що містить лейкоконцентрат, відмили у фізіологічному розчині - 10 хв. при 1200 об/хв., 4) з отриманого лейкоконцентрата приготували мазки, 5) мазки просушили 2 години при кімнатній температурі, потім мазки зафіксували в парах 10% нейтрального формаліну (час 3 хвилини), 6) мазки з лейкоконцентрата промивали в забуференому фізіологічному розчині 5 хв., інгібувати ендогенну пероксидазу за допомогою обробки 10 % розчином перекису водню (10 хв.), 7) мазки розміщували у вологій камері, завдавали 20 мкл первинних моноклональних антитіл так, щоб реагент був рівномірно розподілений по всій площі зони реакції, 8) промивали мазки в ЗФР (5 хв.) завдавали 20 мкл кролячій сироватки проти імуноглобулінів миші (час інкубації - 1 год.), 9) мазки промивали в ЗФР (5 хв.) завдавали 20 мкл ПАП - комплексу (інкубація - 1 год.) 10) обробляли мазки 3,3 - діамінобензідіном гідрохлориду (інкубація -10 хв.), фарбували 1% розтином метилового зеленого 10 хв. 5 54172 Результати дослідження місцевого імунітету соматично здорового пацієнта М.-CD4-4%, CD118%, CD16-14%. Приклади, що наведені, виявляють значні відмінності в стані місцевого імунітету хворого А. та соматично здорового М. Даний спосіб був застосований у 18 пацієнтів з ураженнями ротової порожнини бактеріального ґенезу та 6 здорових осіб. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська 6 Імуногістохімічним методом з використанням МкАТ в слині були визначені субпопуляції імунокомпетентних клітин, а саме CD4, CD11, CD16 та їх зміни, які корелювали зі станом місцевого імунітету ротової порожнини та загальним станом здоров'я обстежених осіб. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601