Сухе живильне середовище для прискореного культивування мікобактерій

Сухе живильне середовище для прискореного культивування мікобактерій, що містить калій фосфорнокислий однозаміщений, магній сірчанокислий, гліцерин, яєчну масу, 2 % водний розчин малахітового зеленого, воду дистильовану, яке відрізняється тим, що воно додатково містить глікокол, лимонну кислоту і сірчанокислий цинк та картопляний відвар при такому співвідношенні компонентів, мас % Глікокол (амінооцтова кислота) 0,4-0,6 Калій фосфорнокислий 0,3-0,5 двозаміщений Магній сірчанокислий 0,02 - 0,04 Лимонна кислота 0,3-0,5 Цинк сірчанокислий 0,01 -0,03 Гліцерин 2,0-3,0 Яєчна маса 54,0-61,0 Картопляний відвар 20,3 - 20,4 2 %-ний водяний розчин 1,8-2,0 малахітового зеленого Вода дистильована рН - до 7,0±0,2 (доводиться 10 12,87-11,93 % розчином аміаку) Винахід відноситься до мікробіологи, стосується виготовлення живильних середовищ для прискореного виділення культур мікобактерій з патологічного матеріалу та може бути застосований в ветеринарних та медичних лабораторіях для бактеріологічної діагностики туберкульозу Відоме живильне середовище ЛевенштейнаІєнсена, що містить калій фосфорнокислий однозаміщений, магній сульфат, натрію цитрат, Ласпарапн, гліцерин, яєчну масу та малахітовий зелений (В кн "Туберкульоз тварин і заходи боротьби з ним», К «Урожай», 1990), Існує також живильне середовище Фінн-2, яке містить магній сульфат, натрію цитрат, квасці залізоаміачні, калій фосфат однозаміщений, амоній цитрат однозаміщений, натрію глутамшат однозаміщений, гліцерин, яєчну масу і 2% водний розчин малахітового зеленого (В кн " Туберкулез сельскохозяйственных животных и меры борьбы с ним", под редакцией В П Шишкова и В П Урбана - М ВО "Агропромиздат", 1991) Недоліками вказаних середовищ є недостатні ростові властивості та висока собівартість Найбільш близьким за технічною суттю до заявляемого об'єкту є "Сухе живильне середовище для культивування мікобактерій " (ТУУ 46 15 063-95), що містить калій фосфорнокислий однозаміщений, магній сірчанокислий, натрій лимоннокислий, янтарну кислоту, харчову яблучну кислоту, гліцерин, яєчну масу, 2% водяний розчин малахітового зеленого Недоліком цього середовища є повільний ріст на ньому культур збудників туберкульозу (первинний ріст референтних штамів з розведень 10 мг/см3 при ВИСІВІ 0,1мл мікробної суспензії через 10-21 добу, з патологічного матеріалу - на 16-21 добу інкубації при температурі 37°С±1°) В основу винаходу, що передбачається поставлено завдання виготовити сухе живильне середовище для присореного культивування мікобактерій, що містить калій фосфорнокислий однозаміщений, магній сірчанокислий, гліцерин, яєчну масу, 2% водний розчин малахітового зеленого, воду дистильовану, та ще додатково містить глікокол, лимонну кислоту і сірчанокислий цинк та картопляний відвар, при такому співвідношенні компонентів, мас % Глікокол (аміноацетова кислота) 0,4-0,6 Калій фосфорнокислий двозаміщений 0,3-0,5 Магній сірчанокислий 0,02-0,04 СО о Ю 54203 Лимонна кислота 0,3-0,5 Цинк сірчанокислий 0,01-0,03 Гліцерин 2,0-3,0 Яєчна маса 54,0-61,0 Картопляний відвар 20,3-20,4 2%-ний водяний розчин малахітового зеленого 1,8-2,0 Вода дистильована 12,87-11,93 рН - до 7,0±0,2 (доводиться 10% розчином аміаку) для підвищення ростових властивостей, зокрема прискорити ріст мікобактерій туберкульозу з патологічного матеріалу та накопичення їх бактерійної маси Аналіз складу відомих щільних живильних середовищ для культивування мікобактерій показав, що при їх виготовлені використовують глікокол, лимонну кислоту, сірчанокислий цинк та картопляний відвар у сполуці з іншими компонентами та в інших пропорціях Однак використання перелічених інгредієнтів у відомих живильних середовищах в поєднанні з іншими компонентами та в інших пропорціях не дозволяє підвищити ростові властивості цих середовищ, зокрема прискорити ріст збудників туберкульозу та накопичення бактерійної маси, а також зменшити собівартість середовища Порівняльний аналіз щільного живильного середовища, що пропонується, із прототипом доводить, що заявлений склад відрізняється від відомого заміною у складі сухого живильного середовища для культивування мікобактерій харчової яблучної кислоти на глікокол, янтарної кислоти на сірчанокислий цинк, натрію лимоннокислого на лимонну кислоту та введенням до його складу картопляного відвару Новий склад компонентів дозволяє знизити собівартість, підвищити ростові властивості середовища, що пропонується, та підвищити діагностичну ефективність культурального методу діагностики за рахунок прискорення росту культур збудника туберкульозу й накопичення бактерійної маси мікобактерій Живильне середовище готували таким чином Наважки солей розчиняли у дистильованій воді в наведеній вище ПОСЛІДОВНОСТІ, ПОТІМ додавали гліцерин, картопляний відвар, ретельно змішували і 10% розчином аміаку доводили рН до 7,0±0,2, фільтрували через паперовий фільтр, розливали у флакони і стерилізували при 1,5атм протягом ЗО хвилин Окремо готували яєчну масу із свіжих курячих яєць, які мили щіткою з милом, протирали тампоном, змоченим у 70° спирті, шкарлупеи яєць розбивали стерильним шпателем, вмістиме яєць зливали в стерильну колбу з бусами і гомогенізували до одержання однорідної маси, додавали сольовий розчин і 2%-вий стерильний розчин малахітового зеленого та картопляний відвар, перемішували і розливали в стерильні флакони ємкістю 500см по 200см3 Флакони закривали стерильними марлевими салфетками і піддавали люфілізацм Готове сухе живильне середовище за умов зберігання при 4°С придатне до використання протягом двох років Для вирощування ліофільне середовище культур мікобактерій розчиняли у 200см3 стерильної дистильованої води і витримували в термостаті при 37°С три години Після розчинення рН середовища доводили до 7,0±0,2 Середовище розливали у стерильні бактеріологічні пробірки по 4-4,5см3 і в нахиленому положенні коагулювали при 90°С протягом однієї години в апараті для інактивації сироватки крові Готове до використання живильне середовище зберігали в холодильнику при 4°С ЗО діб Приклад 1 Живильне середовище готують за наведеною схемою при наступному співвідношенні компонентів, мас % Глікокол 0,4 Калій фосфорнокислий однозаміщений 0,3 Магній сірчанокислий 0,02 Лимонна кислота 0,3 Цинк сірчанокислий 0,01 Гліцерин 3,0 Яєчна маса 61,0 2%-ний водяний розчин малахітового зеленого 1,8 Картопляний відвар 20,0 Вода дистильована 13,17 рН - до 7,0±0,2 (доводиться 10% розчином аміаку) Приклад 2 Теж, що в прикладі 1, при наступному співвідношенні компонентів, мас % Глікокол 0,5 Калій фосфорнокислий одноміщений 0,4 Магній сірчанокислий 0,03 Лимонна кислота 0,4 Цинк сірчанокислий 0,02 Гліцерин 3,0 Яєчна маса 61,0 2 %-ний водяний розчин малахітового зеленого 1,9 Картопляний відвар 20,2 Вода дистильована 12,55 рН - до 7,0±0,2 (доводиться 10% розчином аміаку) Приклад 3 Теж, що в прикладі 1 та 2 при наступному співвідношенні компонентів, мас % Глікокол 0,6 Калій фосфорнокислий однозаміщений 0,5 Магній сірчанокислий 0,04 Лимонна кислота 0,5 Цинк сірчанокислий 0,03 Гліцерин 3,0 Яєчна маса 61,0 2%-ний водяний розчин малахітового зеленого 2,0 Картопляний відвар 20,4 Вода дистильована 11,93 Ростові властивості середовища визначали шляхом висіву 0,1см3 мікробної суспензії збудника туберкульозу бичачого (штам Valle), людського (штам H37RV) та пташиного (штам Avium-780) видів з розведення 105мг/см , а також 6 проб патологічного матеріалу від хворих на туберкульоз тварин Пробірки з посівами закривали ватномарлевими пробками змоченими в кип'ячий 54203 парафін або стерильними гумовими пробками і інкубували в термостаті при 37°С протягом 60 діб Облік росту колоній проводили через кожні 710 діб після висіву протягом 60 діб Результати проведених досліджень наведені в таблиці Матеріали таблиці свідчать про те, що ріст первинних колоній референтних штамів збудників туберкульозу на запропонованому середовищі починався раніше бичачого виду на 3-8 днів, людського - на 10-12 днів, пташиного - на 3-5 днів, а з патологічного матеріалу - на 3-18 діб (приклади 1-3) При цьому, кращі характеристики живильного середовища щодо термінів початку росту на ньому збудників туберкульозу як при ВИСІВІ культур, так і з патологічного матеріалу відзначали у прикладі З (початок росту при ВИСІВІ культур у порівнянні з базовим середовищем раніше на 8, 12 та 5 днів ВІДПОВІДНО, а з патологічного матеріалу - на 9-18 днів В прикладі 3 інтенсивність росту і накопичення бактеріальної маси за період культивування (60 діб) була вищою у мікобактерій бичачого виду на 7,9 мг, людського - на 16,4мг, пташиного - на 11,0мг у порівнянні з базовим живильним середовищем, що дозволяє в подальшому провести вивчення, тінкторіально-морфолопчних, біохімічних та біологічних властивостей у виділених культур мікобактерій, скоротити термін визначення видової належності у первинно виділених культур, скоротити встановлення діагнозу на туберкульоз, вивчити чутливість до антибактершних препаратів та інше Таким чином оптимальним є склад живильного середовища для культивування мікобактерій, наведений у прикладі З Для виготовлення живильного середовища, що пропонується, не потрібна імпортна сировина, що дозволяє зменшити собівартість бактеріологічних досліджень на туберкульоз Порівняльні показники з елективності живильних середовищ Показники 1 Поява первинного росту 5,0 колоній тест культури, дні 2 Поява первинних колоній збудника туберкульозу з патологічного матеріалу 3 Вихід бактеріальної маси 5,0 на середовищі, мг Примітка корів Живильне середовище Пропоноване Приклад 2 Приклад 3 II І V І Приклад 1 І V 3,0 2,0 6,0 4,0 1,0 8-25 4,0 0,0 1,09,4 28,0 3,0 2,0 2,6 6,032,8 V 0,0 9-21 1,1 Базове І 1,0 V 4,0 5,0 3-21 3,5 4,4 3,0 6,05,6 32,0 2-39 8,0 2,0 2,028,0 - штам Valle, II - штам H37RV, III - штам Avium-M, IV - патматеріал від хворих на туберкульоз ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24