Сухе живильне середовище для виділення мікобактерій

Сухе живильне середовище для виділення мікобактерій, яке містить калій фосфорнокислий однозаміщений, магній сірчанокислий, натрій лимоннокислий, гліцерин, яєчну масу, 2%-ний водяний розчин малахітового зеленого і воду, яке відрізняється тим, що воно додатково містить харчову 29901 Аналіз відомих щільних живильних середовищ для культивування і виділення мікобактерій показав, що введення до складу середовища харчової яблучного кислоти і янтарної кислоти застосовується у відомих синтетичних середовищах. Однак, використання їх у цих середовищах у поєднанні з іншими компонентами не забезпечує середовищам таких властивостей, котрі вони проявляють у пропонованому рішенні, а саме покращення ростових властивостей у епізоотичних культур мікобактерій при виключенні із складу компоненту натрію глутамінового. Порівняльний аналіз пропонованого щільного живильного середовища і прототипу показує, що даний склад живильного середовища відрізняється від відомого заміною глікоколу і введенням нових компонентів, а саме харчової яблучної кислоти і янтарної кислоти. Таким чином, новий склад компонентів надає середовищу більш високих ростових властивостей, збільшує кількість бактеріальної маси і знижує процент росту неспецифічної мікрофлори. Живильне середовище готують так. Наважки солей розчиняють у дистильованій воді в указаній послідовності, потім додають гліцерин, змішують і підлуговують аміаком до рН - 7,0-7,2, фільтрують через паперовий фільтр, розливають у флакони і автоклавують при 1,5 атм на протязі 30 хвилин. Виготовлений сольовий розчин зберігають при 4°С не більше двох тижнів. Яєчну масу готують із свіжих курячих яєць, які ретельно миють щіткою з милом, протирають тампоном, змоченим в 70° спирті, розбивають, вміст яєць поміщають в стерильну колбу з бусами і гомогенізують до одержання однорідної маси, фільтрують через два шари марлі, додають сольовий розчин і 2%-ний стерильний розчин малахітового зеленого, ретельно перемішують і розливають в стерильні 500 см 3 флакони по 200 см 3, які закривають стерильними гумовими пробками і піддають пристінковому заморожуванню в апараті НЗ-12:50 при температурі мінус 30-35°С протягом 1520 хвилин. Після цього флакони перезакривають марлевими салфетками і поміщають з касети, які витримують 12 годин в холодильній камері НС-700:502 при температурі мінус 45-50°С. Потім флакони з касетами поміщають в охолоджений до мінус 60°С апарат для ліофільної сушки ЛЗ-45:27 і висушують від 0 до 4 годин при температурі конденсора 45-50°С, вакуумі 10-12 Па, а від 4 до 24 годин при режимі мінус 60-65°С, вакуумі 1-3 Па. Через 24 години Флакони з сухим живильним середовищем витягають із апарата ЛЗ-45:27 і в стерильних умовах закривають гумовими пробками, обкатують алюмінієвими ковпачками. Готове сухе живильне середовище зберігають при 4°С на протязі двох років. Для висівання культур середовище готують так: у флакон із сухим живильним середовищем зносять 200 см 3 стерильної дистильованої води і витримують у термостаті при 37°С 3 години. Після рівномірного змішування середовище розливають у стерильні бактеріологічні пробірки по 4-4,5 см 3 і в нахиленому положенні коагулюють при 90°С протягом однієї години в апараті АСІС (апарат інактивації сироватки крові). Виготовлене щільне живильне середовище зберігають в холодильнику при 4°С не більше 30 днів. Приклад 1. Живильне середовище готують, як указано вище, при такому співвідношенні компонентів, мас. %. Харчова яблучна кислота 0,4 Калій фосфорнокислий однозаміщений 0,3 Магній сірчанокислий 0,02 Натрій лимоннокислий 0,02 Янтарна кислота 0,001 Гліцерин 0,3 Яєчна маса 61,0 2%-ний водяний розчин малахітового зеленого 1,5 Вода дистильована 36,459 рН 7,0-7,2 Приклад 2. Теж, що в прикладі 1, при такому співвідношенні компонентів, мас. %. Харчова яблучна кислота 0,5 Калій фосфорнокислий однозаміщений 0,4 Магній сірчанокислий 0,03 Натрій лимоннокислий 0,03 Янтарна кислота 0,002 Гліцерин 0,4 Яєчна маса 61,0 2%-ний водяний розчин малахітового зеленого 1,8 Вода дистильована 35,838 рН 7,0-7,2 Приклад 3. Теж, що в прикладах 1, 2, при такому співвідношенні компонентів, мас.%. Харчова яблучна кислота 0,6 Калій фосфорнокислий однозаміщений 0,5 Магній сірчанокислий 0,04 Янтарна кислота 0,003 Гліцерин 0,5 Яєчна маса 61,0 2%-ний водяний розчин малахітового зеленого 2,0 Вода дистильована 35,317 рН 7,0-7,2 Елективні властивості середовища визначають шляхом висіву 0,1 см 3 водяної наважки мікобактерій туберкульозу (концентрація бактеріальних клітин у фізіологічному розчині 10-5 у см 3) бичачого (шт Валле), людського (Н37 Rv), пташиного (шт. Авіум-780), а також проб патологічного матеріалу від хворих туберкульозом корів. Пробірки з висівами парафінують, поміщають в термостат при температурі 37°С та інкубують протягом 60 днів. Врахування росту колоній проводять черев кожні 7-10 днів після висіву. Результати проведених досліджень наведені в таблиці. З неї видно, що ріст первинних колоній референтних штамів збудників туберкульозу бичачого, людського і пташиного видів на пропонованому середовищі був раніше на 1-2 дні, а з патологічного матеріалу - 3-5 днів. При цьому інтенсивність росту і накопичення бактеріальної маси за період культивування (90 днів) була вищою у шт. Валле - на 15,0 мг, шт. 2 29901 H37Rv - 12,4, шт. Авіум-780 - 15 мг із патологічного матеріалу на 3-4 мг у порівнянні з базовим живильним середовищем. Крім того, вона у 5,5 разів дешевше від відомої, не потребує для виготовлення імпортних компонентів, а кількість бактеріальної маси, яка виросла, достатня для проведення культурально-морфологічних, біохімічних і біологі чних властивостей у епізоотичних культур мікобактерій, що дозволяв скоротити строки визначення видової приналежності у первинно виділених культур мікобактерій і тим самим скоротити строки постановки первинного діагнозу на туберкульоз, а також зменшити собівартість бактеріологічних досліджень на туберкульоз. 3 4 ІV 60,0 63,5 15 І 64,4 16 ІІ 63,0 10 ІІІ Приклад 2 26,0-32,8 16-21 ІV 59,4 21 І 61,1 62,6 18 ІІІ Приклад 3 19 ІІ Примітка: І – шт. Валле; ІІ – шт. Н; ІІІ – шт. Авіум-780; ІV – патматеріал від хворих туберкульозом корів. 54,0 21,0-28,0 55,0 12 ІІІ 3. Вихід біомаси на середовищі, мг 16 ІІ 19-30 18 І Приклад 1 2. Поява первинних колоній збудника туберкульозу із патологічного матеріалу 1. Поява первинного росту колній тест культури, дні Показники Пропоноване Живильне середовище Порівняльні показники з елективності живильних середовищ 23,0-28,0 18-25 ІV 55,6 16 І 52,0 17 ІІ 48,0 12 ІІІ Базове 22,0-28,0 19-26 ІV Таблиця 29901 29901 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 35 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 5