Спосіб визначення ракових клітин в ексудативній рідині серозних порожнин

Изобретение относится к области онкологии и клинической цитологии и может использоваться для выявления метастазов рака в серозные полости организма. В последние 10-15 лет в иммуногистохимических исследованиях стали использоваться пектины - белки не иммунного происхождения, способные определять углеводные детерминанты гликопротеидов и гликолипидов клеток. Нами был предложен способ определения рецепторов лектинов на мембранах лимфоидных клеток, который выбран нами в качестве прототипа. Способ-прототип заключается в следующем: осаждают клеточные элементы из всего объема взятой для исследования экссудативной жидкости, дважды отмывают их ЗФР (физиологический раствор, забуференный фосфа тным буфером, рН 7,2-7,4) путем центрифугирования в течение 5 мин при 200 g, разводят суспензию ЗФР до концентрации клеток 2 х 10 /мл, готовят цитологические препараты (мазки). Фиксируют мазки в растворе формол-ацетона, рН 6,6-6,8 в течение 45 с, промывают ЗФР, проводят блокирование альдегидных групп поверхностных мембран клеток, инкубируя мазки в 0,1 М растворе NH 4CI 30 мин при 4°С, промывают ЗФР, обрабатывают раствором нейраминидазы для удаления сиаловых кислот (1 мл 0,02 М ацетатного буфера, рН 5,6, 1 мМ Ca++, 0,02 UE нейраминидазы) в течение 30 мин при 37°С, промывают ЗФР, инкубируют с лектинами, конъюгированными с пероксидазой хрена, в разведении 1:1000 в течение 3 час при 4°С. Все этапы инкубации проводят во влажной камере. Затем мазки промывают ЗФР, высушивают, фиксируют в парах 10 %-ного нейтрального формалина в течение 3 мин, определяют цитохимически активность пероксидазы, докрашивают ядра клеток 2-ным раствором метилового зеленого в течение 1 мин. В исследованиях применяются общедоступные лектины: арахиса (PNA), сои (SBA), виноградной улитки (HPL), клещевины (RCA) и другие (М.Д.Луцик, Львовский филиал института биохимии им. В.А.Палладина АН Украины). Клетки, содержащие рецепторы пектинов, выявляются при просмотре мазков в световой микроскоп как имеющие цитоплазматическое или мембранное окрашивание коричневого цвета. При изучении способом-прототипом экссудативной жидкости обнаружено, что мезотелиальные клетки не имеют рецепторов использованных пектинов; гистиоциты и макрофаги отличаются ярким диффузным окрашиванием цитоплазмы при определении рецепторов PNA, HPL. SBA и RCA; раковые клетки экспрессируют рецепторы пектинов преимущественно на поверхностных мембранах и в меньшей степени - в цитоплазме клеток. В группе обследованных нами 32 онкологических больных на раковых клетках в экссудативной жидкости обнаружены рецепторы RCA (у 100 % больных), SBA (88 %), HPL (88 %), PNA (70 %). (Показана независимость нового класса маркеров от наличия на клетках опухолеассоциированных антигенов, таких как раково-эмбриональный (РЭА), антиген эпителиальных мембран (ЕМА), гликопрртеид с м.м. 90 кД, Х-гаптен, и цитохимических особенностей раковых клеток (содержания PASположительных ве ществ, активность фермента щелочной фосфатазы). Недостатком способа при применении его именно для изучения клеточных элементов экссудативной жидкости является сложность отличия ярко диффузно окрашенных гистиоцитов и макрофагов от раковых клеток, окрашенных преимущественно по мембране, особенно если содержание раковых клеток невелико, а основным клеточным элементом экссудативной жидкости являются активированные клетки гистиоцитарно-макрофагальной природы. Задачей изобретения является создание способа определения раковых клеток в цитологических препаратах из экссудативной жидкости серозных полостей, при котором исключаются этапы обработки мазков нейраминмдазой и сокращается время инкубации их с конъюгатами пектинов, что создает условия для изучения рецепторов пектинов на поверхностных мембранах, раковых клеток. Наличие рецепторов в к лектинам выявляют по ободку коричневого цвета по краю цитоплазмы клеток, что облегчает дифференциальный диагноз между раковыми клетками и гистиоцитами/макрофагами. Таким образом повышается специфичность и чувствительность способа с одной стороны, и достигается простота и доступность выполнения с другой. Поставленная задача решается тем, что в способе выявления раковых клеток в экссудатах из серозных полостей с помощью пектинов, конъюгированных с пероксидазой хрена путем приготовления цитологического препарата, его фиксации, блокады альдегидных групп, инкубации с конъюгатами пектинов, согласно изобретению, инкубацию с конъюгатами пектинов проводят непосредственно после блокады альдегидных групп и время ее сокращают до 30-60 мин. Заявляемый способ выявления раковых клеток в экссудатах из серозных полостей осуществляют следующим образом: осаждают клеточные элементы из всего объема взятой для исследования экссудативной жидкости, дважды отмывают их ЗФР п утем центрифугирования в течение 5 мин при 200 g, разводят суспензию ЗФР до концентрации клеток 2 х 106 мл, готовят цитологические препараты - мазки. Фиксируют мазки в растворе формол-ацетона, рН 6,6-6,8 в течение 45 с, промывают ЗФР, проводят блокирование альдегидных групп поверхностных мембран клеток, инкубируя мазки в 0,1 М растворе МН4Сl 30 мин при 4°С, промывают ЗФР, инкубируют с пектинами, конъюгированными с пероксидазой хрена, в разведении 1:1000 в течение 30-60 мин при 4°С. Все этапы инкубации проводят во влажной камере. Затем мазки промывают ЗФР, высушивают, фиксируют в парах 10 %-ного нейтрального формалина в течение 3 мин, определяют цитохимически активность пероксидазы, докрашивают ядра клеток 2 %-ным раствором метиленового зеленого в течение 1 мин. Низкая сиализация раковых клеток в экссудатах, позволяет исключить этап обработки клеток нейраминидазой поскольку сиаловые кислоты не экранируют углеводные остатки на поверхностных мембранах раковых клеток в отличие от лимфоидных и други х неопухолевых клеток. Значительно большее количество рецепторов лектинов на поверхности раковых клеток в экссудатах позволяет определять злокачественные клетки после краткосрочной инкубации с лектинами. Сущность заявляемого нами изобретения более подробно раскрывают следующие примеры. Пример 1. Исследовали экссудативную жидкость больного П. (диагноз: рак легкого. Метастазы в плевральную полость?). Осаждали клеточные элементы из всего объема взятой для исследования жидкости (400 мл), дважды отмыли ЗФР путем центрифугирования при 200 g в течение 5 мин, разводили ЗФР до концентрации клеток 2 х 106/мл, готовили мазки. Фиксировали мазки в растворе формол-ацетона рН 6,6 в течение 45 с, промывали ЗФР, инкубировали мазки в 0.1 М растворе NH4CI в течение 30 мин во влажной камере при 4°С. В дальнейшем исследование осуществляли по способу-прототипу и по заявляемому способу. По способу прототипу: после блокады альдегидных групп мазки промывали ЗФР, обрабатывали раствором нейраминидазы в течение 30 мин во влажной камере при 37°С, промывали ЗФР и инкубировали с лектинами РСА, HPL, РМА, SВА, коньюгированными с пероксидазой хрена, в разведении 1:1000 в течение 3 час при 4° С во влажной камере. Затем мазки промывали ЗФР, высушивали, фиксировали в парах 10 %-ного нейтрального формалина в течение 3 мин., определяли активность пероксидазы цитохимически, докрашивали ядра клеток 2 %-ным раствором метиленового зеленого в течение 1 мин. При просмотре препаратов в световой микроскоп выявлено большое содержание в экссудативной жидкости активированных гистиоцитов/макрофагов, имеющих значительное количество рецепторов пектинов PNA, HPL,SBA и RCA в цитоплазме. Идентифицировать на их фоне раковые клетки не представилось возможным. По заявляемому способу: после блокады альдегидных групп мазки промывали ЗФР, инкубировали с конъюгатами лектинов PNA, HPL, SBA и RCA в разведении 1:1000 в течение 60 мин во влажной камере при 4°С. Затем мазки промывали ЗФР. высушивали, фиксировали в парах 10 %-ного нейтрального формалина в течение 3 мин, определяли активность пероксидазы, докрашивали ядра клеток 2 %-ным раствором метиленового зеленого. При просмотре препаратов на фойе неокрашенных клеток гистиоцитарно/макрофагальной природы обнаружены единичные изолированные крупные клетки с ярким ободком коричневого цвета по краю цитоплазмы при определении рецепторов лектинов PNA, HPL, SBA, что позволило поставить диагноз: метастазы рака в плевральную полость. Одновременно проводимое иммуно-цитохимическое определение экспрессии опухолеассоциированных антигенов РЭА, ЕМА, гликопротеида с м.м. 90 кД ПАП-методом (17) подтвердило поставленный диагноз. В то же время при определении рецепторов пектина RCA обнаружено окрашивание не только раковых, но частично и гистиоцитарных клеток. Таким образом, в тех случаях, когда основными клетками экссудативной жидкости являются активированные гистиоциты и макрофаги, выявление единичных раковых клеток по способу прототипу затруднено, а с помощью заявляемого способа становится возможным. Пример 2. Исследовали экссудативную жидкость больной Я. (диагноз - рак молочной железы, состояние после мастэктемии, метастазы в плевральную полость?). Выделяли клетки экссудативной жидкости путем центрифугирования и отмывок ЗФР, разводили ЗФР до концентрации 2 х 106/мл, готовили мазки, фиксировали их в растворе формол-ацетона, рН 6,7 в течение 45 с. В дальнейшем исследование веди по способу-прототипу и по заявляемому способу. По способу-прототипу: провели блокирование альдегидных групп поверхностных мембран клеток путём инкубации мазков 8 0,1 М растворе МН4СІ в течение 30 мин при 4°С во влажной камере, промыли ЗФР, инкубировали мазки с раствором нейраминидазы в течение 30 мин при 37°С во влажной камере, промыли ЗФР. инкубировали с конъюгатами пектинов HPL, PNA,SBA, RC A в течение 3 ч во влажной камере при 4°С. Затем мазки высуши вали, фиксировали в парах 10 %-ного нейтрального формалина, цитохимически определяли активность пероксидазы, докрашивали ядра клеток 2 %-ным раствором метиленового зеленого. При просмотре мазков раковые клетки выделялись на фоне доброкачественных клеток экссудативной жидкости ярким окрашиванием поверхностных мембран при определении рецепторов лектинов PNA, SBA, HPL, RCA, однако отмечалось и диффузное окрашивание гистиоцитов/макрофагов. По заявляемому способу: после фиксации мазки промывали ЗФР, инкубировали в 0,1 М растворе NH 4CI в течение 30 мин при 4°С во влажной камере, промывали ЗФР и инкубировали с конъюгатами лектинов PNA, HPL, SBA, RCA во влажной камере при 4°С в течение 30 мин. Затем мазки высушивали, фиксировали в парах 10 %ного нейтрального формалина, определяли активность пероксидазы, докрашивали ядра клеток 2 %-ным раствором метиленового зеленого. При просмотре мазков окраски доброкачественных клеток экссудативной жидкости при определении рецепторов лектинов PNA, SBA, HPL не наблюдалось, при определении рецепторов пектина RCA - окраска гистиоцитарных клеток была очень слабая. Раковые клетки четко идентифицировались среди остальных клеток экссудата, окраска их мембран была интенсивной при выявлении рецепторов лектинов HPL и RCA, умеренной - при определении рецепторов SBA и PN A. Одновременно проводимое иммуноцитохимическое определение антигенов поверхностных мембран с помощью мкАТ к РЭА и ЕМА подтвердило наличие раковых клеток в исследуемой экссудативной жидкости. Таким образом, в те х случаях, когда при применении способа-прототипа можно выделить раковые клетки среди остальных клеток экссудата, проводя дифференциацию различных типов окраски, с помощью заявляемого способа обнаружение раковых клеток проводится значительно легче, так как они единственные имеют цитохимическое окрашивание. Пример 3. Исследовали экссудативную жидкость больной А. (диагноз - метастазы рака яичника в плевральную полость). Выделяли клетки из всего объема взятой для исследования жидкости (250 мл), отмывали ЗФР, разводили до концентрации 2 х 106/мл, готовили мазки, фиксировали их в растворе формол-ацетона, рН 6,6 в течение 45 с, промывали ЗФР, инкубировали в растворе 0,1 М NH4CI в течение 30 мин во влажной камере при 4°С. Затем мазки инкубировали с конъюгатами лектинов PNA, HPL, SBA, RC A в разведении 1:1000 во влажной камере при 4°С в течение 15, 30, 60 мин и 2, 3 ч. После этого мазки промывают ЗФР, высушивали, фиксировали в парах 10 %-ного нейтрального формалина в течение 3 мин, определяли активность пероксидазы, докрашивали ядра клеток 2 %-ным раствором метиленового зеленого в течение 1 мин. Результаты исследования следующие: - при инкубации с конъюгатами лектинов в течение 15 мин наблюдается очень слабое окрашивание раковых клеток пектинами HPL и РСА; - при инкубации с конъюгатами лектинов в течение 30 мин наблюдается яркое окрашивание мембран раковых клеток пектинами HPL и RCA, и умеренное - лектинами SBA и PN A; - при инкубации с конъюгатами пектинов в течение 60 мин наблюдается интенсивное окрашивание раковых клеток всеми использованными пектинами. Окраски гистиоцитов/макрофагов, как и при времени инкубации с пектинами 15 и 30 мин, не отмечено, за исключением слабого окрашивания гистиоцитов пектином RCA; - при инкубации с конъюгатами лектинов в течение 2 ч окрашивание раковых клеток всеми пектинами интенсивное, однако отмечается умеренно выраженное окрашивание цитоплазмы гистиоцитов/макрофагов; - при инкубации с конъюгатами пектинов в течение 3 ч наряду с интенсивным окрашиванием раковых клеток наблюдается выраженное окрашивание цитоплазмы гистиоцитов, что затрудняет дифференциацию этих двух типов клеток. Таким образом, результаты исследования показали, что оптимальным временем инкубации с конъюгатами лектинов является 30-60 мин. При этом положительная окраска обнаруживается только по мембране раковых клеток, а остальные клеточные Элементы экссудата остаются не окрашенными. Удлинение времени инкубации с конъюгатами лектинов до 2-3 ч приводит к появлению диффузного окрашивания гистиоцитов и макрофагов. Укорочение времени инкубации до 15 мин недостаточно для взаимодействия лектинов с соответствующими клеточными рецепторами. Упрощение способа заключается в том, что в ходе постановки реакции исключается этап обработки мазков нейраминидазой и сокращается время инкубации мазков с конъюгатами лектинов. Благодаря этому почти на 50 % сокращается время проведения исследований по выявлению раковых клеток в экссудативной жидкости заявляемым способом (2-2,5 ч) по сравнению с прототипом (5-5,5 ч), удешевляется стоимость анализа за счет экономии нейраминидазы. Подобное упрощение способа необходимо для изучения рецепторов лектинов на поверхностных мембранах не лимфоидных, а раковых клеток. Сущность данного упрощения заключается в создании условий, при которых выявление рецепторов лектинов лимфоцитов, гистиоцитов и макрофагов становится невозможным, а мембраны раковых клеток, метастазировавших в серозные полости организма, сохраняют способность взаимодействовать с пектинами. Для изучения же рецепторов лектинов на поверхности гемопоэтйческих клеток (лимфоцитов и гистиоцитов/макрофагов) заявляемый способ не пригоден, и оптимальным остается способ-прототип. Повышение информативности заявляемого способа заключается в том, что по сравнению с прототипом облегчается дифференциальный диагноз между раковыми клетками и гистиоцитами/макрофагами, поскольку рецепторы пектинов выявляются только на поверхности раковых клеток, а цитоплазма гистиоцитов/макрофагов (а также лимфоидных и мезотелиальных клеток) остается неокрашенной. Таким образом, если при применении способа-прототипа нужно дифференцировать между собой два типа различно окрашенных клеток - раковые и гистиоцитарные, то при использовании заявляемого способа на фоне невзаимодействующих с пектинами доброкачественных клеток экссудата окрашенными видны лишь раковые клетки (выявляются как имеющие ободок коричневого цвета по краю цитоплазмы). Следовательно, повышается специфичность и чувствительность способа. Особенно очевидным подобное преимущество становится при исследовании экссудатов. богатых активированными гистиоцитами/макрофагами, в которых раковые клетки встречаются в незначительном количестве, не в виде комплексов или железисто-подобных структур, а изолированных клеток. В подобных ситуациях способ-прототип не позволяет обнаружить раковые клетки и поставить правильный диагноз. При применении заявляемого способа это возможно. В целом, при применении заявляемого способа значительно облегчена постановка правильного диагноза, сокращается время просмотра мазков в свето вой микроскоп. Заявляемый способ не требует столь высокой квалификации и большого опыта исследователя, как прототип, и, следовательно, более доступен. Благодаря высокой специфичности, чувствительности и достаточной простоте выполнения, заявляемый нами способ может быть использован в диагностических исследованиях в клинических и цитологических лабораториях. Среди апробированных нами лектинов для осуществления способа пригодны пектины арахиса, улитки, сои, клещевины. Мы применяли также и другие лектины: чечевицы, вики, коры бобовника анагиролистного. Хотя они и не взаимодействовали с доброкачественными элементами экссудата при использовании заявляемого способа, частота выявления с их помощью раковых клеток низка, и они имеют вспомогательное значение. Заявляемый способ пригоден для выявления раковых клеток различного происхождения: метастазов рака легкого, молочной железы, яичника, желудка, что проверено нами. Особенно эффективно его применение возможно в комплексе с известными способами, основанными на других принципах выявления раковых клеток, к примеру, в комбинации с определением экспрессии онкофетальных и опухолеассоциированных антигенов с помощью мкАТ и иммуноферментных методов, с изучением активности внутриклеточных ферментов.