Спосіб виготовлення камери для культивування клітин

Союз Советских Социалистически); Республик [п)821484 К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22)Заявлено 040478 . Кл.3 (21) 2599541/28-13 с присоединением заявки № Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий (23) Приоритет Опубликовано 15,04j8l. Бюллетень N9 14 Дата опубликования описания (72) Авторы изобретения (71) Заявители С 12 К 1/00 И.П. Билько, В.Г. Войцеховский, и Н.М. Клишина 15.0 4J31 (53)УДК 616-093. 571, .683(088.8} В.В. Гашинский Киевский ордена Трудового Красного Знамени медицинский институт им. акад. А.А. Богомольца и Киевский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови (54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ КАМЕРЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК 1 Изобретение относится к микробиологическим и гематологическим видам исследований, связанных с выращиванием клеток in vitro и in vivo, и может быть исследовано в микробиологических, гематологических, иммунологических и других исследованиях при создании камер для закономерностей роста и развития клеток (микроорганизмов, тканевых клеток) и опре- 10 деления влияния на них различных факторов. Наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ t5 изготовления камеры для культивирования клеток, заключающийся в том» что формируют стенки и днище с образованием полости для взвеси клеток, закрывают крышкой и герметизируют. Стенки камеры по известному способу изготавливают из пластмассовых колец, а крышку изготавливают из миллипоровых фильтров путем нанесения на фильтр насечек, стерилизации 25 и вырезания затем кружков. Полученные кружки тщательно приклеивают к кольцам клеем^ полученным путем растворения фильтров в ацетоне' так, чтобы матовая сторона их была обращена к клеткам (она считается менее ток- 30 сичной). Затем каморы в разобранном виде помещают в чашки Петри и стерилизуют под лучами бактерицидной лампы. В последующем кольца с Фильтрами помещают на увлажненные средой 199 стерильные марлевые салфетки. В кольца вносят среду 199 для проверки качества фильтра и герметичности камеры, В стерильных условиях на фильтры в кольца помещают исследуемую суспензию клеток. Ожидают, пока культуральная срб'Да просочится через фильтры и на них останутся только клетки. Потом накладывают кольца , друг на друга (меньшее в большее), придавливают сверху лопаткой для с о поставления и герметизируют, проклеивая щель между ними клеем. Полученные таким образом камеры имплантируют в организм животного [ 1 ] . К недостаткам известного способа относятся сложность и трудоемкость изготовления большого количества камер, а также т о , что полученные камеры, хотя и позволяют выращивать клетки I n v i v o и i n v i t r o , однако они выполнены из 'оптически непрозрачных материалов, что не позволяет осуществлять наблюдение за одними и теми же отдельными клетками я 821484 динамике их роста и развития непосредственно в камере; для изучения исследуемых клеток камера, в которой они выращивались, должна быть демонтирована, клетки извлечены и перенесены на предметное стекло, что нарушает первоначальное взаиморасположение клеток, их форму и размеры. Часть клеток может разрушаться. Камера не позволяет осуществлять непосредственное наблюдение за ростом, размножением и дифференцировкой исследуемых клеток под контролем микроскопа в состоянии их развития. Камера имеет жесткую структуру, что отрицательно влияет на организм животного при имплантации. Методика не позволяет получать одновременно необходимое количество камер, так как каждая из них готовится отдельно. 10 15 Цель изобретения - упрощение, удешевление способа и возмсжность иссле- 20 дования клеток в камере на разных этапах их развития. Для достижения этой цели стенки днища и крышку выполняют из полиакриламидного геля, при этом стенки и 25 днище формируют, заливай рабочий раст' вор в "пространство между двумя параллельными пластинами, верхняя из которых имеет выступы для образования полостей в нижней пластине, полиме30 ризуют смесь до образования геля и снимают верхнюю пластину, а' герметизацию камеры проводят путем наложения сверху листового материала с образованием зазора между ним и крышкой, заливают рабочий раствор и поли- 35 мериэуют до образования геля, снимают листовой материал и выштамловывают камеру. На фиг.1 изображена камера для 40 культивирования клеток, общий вид; на фиг.2 - формирование полосы для размещеьСля клеток; на фиг.З - приготовление плоской гелевой пластины; на фиг.4 - введение в полости суспензии клеток и накладывание крышек; на фиг-5 - герметизация камер путем закрепления крышек в гелевой массе; на фиг.6 - вырезание камер. Камера готовится следующим образом. 50 Берут четыре плексигласовые пластины 1 - 4. На поверхность пластины 1 в шахматном порядке на расстоянии примерно 15-20 мм приклеивают водостойким клеем предварительно выре55 занные из пластика или медицинской резины плоские кружки 5 диаметром 6 мм и толщиной 1-2 мм (фиг.2а). Пластины стерилизуют кипячением. Пластину 1 накладывают на прямоугольные плексигласовые подставки б толщиной 2-3 мм, расположенные по бокам пластины 2 таким образом, чтобы плоскость с приклеенными кружками 5 пластины 1 была обращена к пластине 2 (фиг.2а,б). Пластину 3 накладывают на прямоугольные плексигласовые подставки 7 толщиной 1-2 мм, расположенные по бокам пластины А (фиг.За,б). Профильтрованные через бактериальные фильтры рабочие растворы для получения полиакриламидного геля смешивают (стерильно) и заливают в пространство между пластинами 1 и 2 (фиг.26) и 3 и 4 (фиг.36). При этом капиллярные силы удерживают жидкость между пластинами, смесь растворов полимериэуют через 1520 мин (в зависимости от режима полимеризации) . После этого пластины 1 и 2 снимают с подставок. На пластине 2 остается гелевая пластина с полостями 8 (фиг.2в), а на пластине 4 плоская гелевая пластина (фиг.Зв). Из плоской гелевой пластины сверлами для пробок вырезают кружки, выполняющие функцию крышек 9, диаметр которых на 2-3 мм больше диаметра полостей 8. В полости 8 вносят исследуемые клетки (фиг.4а). Сверху полости 8 покрывают крышками 9. При исследовании в камере неприкрепляющих клеток (например,подвижных микроорганизмов) последние прижимают ко дну луночки гелевым кружком , диаметр которого соответствует диаметру луночки. При этом камера будет без внутренней полости. Герметизацию камеры осуществляют следующим образом. По бокам плексигласовой пластины 2 устанавливают подставки 10 таких размеров, что после положения на них листового материала или пластины 3 образуется зазор в 1-2 мм между этим материалом (пластиной) и крышкой 9. В образовавшееся пространство заливают смесь рабочих растворов, которая, полимеризуясь, соединяет пластины между собой (фиг.56). Листовой материал (плексигласовую пластину 3) снимают с подставок 10. Сверлами для пробок диаметром 1215 мм вырезают камеры. Изготовленные камеры отмывают в физиологическом растворе NaCI растворе Хенкса, среде 199 в зависимости от того, какие клетки подлежат исследованию. В дальнейшем камеры имплантируют в организм животного или помещают в питательную среду при культивировании in vitro. Методика предусматривает изготовление одновременно камеры различных размеров и в необходимом количестве в зависимости от целей исследования. Камеры, изготовленные по предлагаемому способу из полиакриламидного геля, обеспечивают возможность изучения одних и тех же отдельных клеток в динамике их роста и развития. Для этого клетки подвергают микроскопированию непосредственно в камере. Для облегчения нахождения клеток в камеру совместно с клетками при их Союз Советских Социалистических Республик ИЗО СА [ЇІ)821 К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 040478 (21) 2599541/28-13 . Кл.л с присоединением заявки № Государственный комитет СССР оо делам изобретений н открытий С 12 К 1/00 (23) Приоритет Опубликовано 15р4£1. Бюллетень № 14 Дата опубликования описания 15.0 4£ 1 ( 5 3 ) У Д К 6 1 6 - 0 9 3 . 57