Спосіб експрес-діагностики резистентності мікобактерій до ізоніазиду

Спосіб експрес-діагностики резистентності мікобактерій до ізоніазиду, що оснований на моле 3 Усі проби старанно перемішували на вортексі та центрифугували для видалення капель з кришок пробірок. Усі пробірки прогрівали 5 хв. при 65 °С. У кожну пробірку додавали 25 мкл сорбенту універсального. Перемішували на вортексі та залишали у штативі на 2 хв. Ще раз перемішували та залишали на 5 хв. Проби центрифугували при 5 тис. об/хв.. протягом 30 с. Видаляли надосадну рідину, додавали по 300 мкл розчину для відмивання 1, перемішували на вортексі до повного ресуспендування сорбенту універсального, знову центрифугували при 5 тис. об/хв.. протягом 30 с і видаляли надосадну рідину. Додавали по 500 мкл розчину для відмивання 2, перемішували на вортексі до повного ресуспендування сорбенту універсального. Центрифугували при 10 тис. об/хв.. протягом 30 с. Видаляли надосадну рідину. Поміщали пробірки з відкритими кришками до термостату на 5-10 хв. при 65 °С, додавали по 50 мкл ТЕ-буферу для елюції ДНК. Перемішували на вортексі. Поміщали в термостат на 5 хв. при 65 °С, періодично струшуючи на вортексі. Центрифугували при 16 тис. об/хв. протягом 1 хв. Надосадна рідина містила очищену ДНК і була готова для постановки ПЛР. Другим етапом визначали мутантні послідовності в кодоні 315 гена katG M.tuberculosis за допомогою мультриплексної алель-специфічної полімеразно ланцюгової реакції (МАС-ПЛР). Для цього використовуються три праймери. Внутрішній зворотний праймер katg5R розташовується так, що його 3'-кінець приєднується до другого нуклеотиду (G) кодона 315 дикого типу алелі (AGC). У випадку відсутності мутації ампліфікується фрагмент з молекулярною вагою 292п.н. за допомогою зовнішнього прямого праймеру katg0F та внутрішнього зворотного праймеру katg5R. Якщо мутація (AGCАСС) має місце - внутрішній праймер katg5R не приєднується і фрагмент з молекулярною вагою 292п.н. не ампліфікується. Замість цього два зовнішніх праймери katg0F та katg4R фланкують весь регіон гену katG, що досліджується. У цьому випадку ампліфікується фрагмент з молекулярною вагою 435п.н. Таким чином, фрагмент 435п.н. ампліфікується тільки у штамів з fortGмутаціями та є обраним як індикатор медикаментозної резистентності збудника туберкульозу до ізоніазиду [2]. На фіг. 1 зображено результати електрофорезу за умов використання запропонованого способу. Утворення фрагмента, що, згідно маркерів молекулярної ваги, складається з 292 пар 56690 4 нуклеотидів, свідчить про відсутність у цих доріжках мутації у кодоні 315 гену katG, тобто вони є чутливими до дії ізоніазиду. Ампліфікація фрагмента, що, згідно маркерів молекулярної ваги, складається з 435 пар нуклеотидів, свідчило про наявність мутації у кодоні 315 гену katG, тобто вони є нечутливими до дії ізоніазиду. Було проведено дослідження 30 зразків мокротиння. З них 24 зразка містили ДНК М. tuberculosis. Серед 24 зразків 13 (54,2 %) мали мутацію в кодоні 315 гена katG, тобто були ізоніазид-резистентними, а 11 зразків (45,8 %) не мали мутації, тобто були ізоніазид-чутливими. Серед ізолятів, що мали мутацію кодону 315 гена katG, 84,6 % (або 11 зразків) були резистентними до ізоніазиду, згідно даних стандартного культурального методу. Серед 15 культур з резистентністю до ізоніазиду, згідно даних стандартного культурального методу, 86,7 % мали мутацію в кодоні 315 гена katG. Отже, специфічність заявленого способу визначення резистентності до ізоніазиду склала 84,6 %, чутливість - 86,7 %. В порівнянні з прототипом, запропонований спосіб експрес діагностики резистентності до ізоніазиду за рахунок виділення ДНК збудника туберкульозу безпосередньо з мокротиння хворих, скорочує час, потрібний для діагностики медикаментозної резистентності М. tuberculosis, з 1-1,5 місяців до 6-8 годин, що робить цей метод вкрай важливим і ефективним для своєчасної адекватної протитуберкульозної терапії. Джерела інформації: 1. Anti-tuberculosis drug resistance in the world, 4th Global Report The WHO/IUATLD Global Project on Anti-tuberculosis Drug Resistance Surveillance 2002-2007., Geneva, 2007. 2. Mokrousov I., Otten Т., Filipenko M., Vyazovaya A. and all. Detection of Izoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by a multiplex allele-specific PCR assay targeting katG codon 315 variation // J Clin Microbiol. - 2002. - Vol. 40, № 7. - P. 2509-2512. 3. Пат. 29211 Україна, МПК (2006) A61K 31/00, C12Q 1/68, C12R 1/32 Склад реактивної суміші для діагностики резистентності до ізоніазиду збудника туберкульозу / Антоненко К. О., Кресюн, В. Й, Антоненко П. Б. (Україна).; заявник і патентовласник Одес. держ. мед. ун-т. - № u200708746 ; заявл. 30.07.2007; опубл. 10.01.2008, Бюл. № 1. - 4 с. 5 Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков 56690 6 Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601