Спосіб кріоконсервування ядровмісних клітин пуповинної/плацентарної крові

Спосіб кріоконсервування ядровмісних клітин пуповинної/плацентарної крові, що включає фрак 3 Задача корисної моделі - підвищення життєздатності концентрату ЯВК пуповинної/плацентарної крові в умовах кріоконсервування з ДМСО та ГЕК. Вирішення задачі полягає у застосуванні послідовних стадій обробки і заморожування пуповинної/плацентарної крові, що включає фракціонування за допомогою розчину високомолекулярного ГЕК (6%-вий розчин з формулою 450/0,7), видалення більшості еритроцитів, концентрації ЯВК, приготування суспензії клітин для кріоконсервування за допомогою додавання половинного об'єму кріоконсерванта на основі ДМСО (кінцева концентрація 5%) і розчину середньомолекулярного ГЕК (6%-вий розчин з формулою 200/0,5) завдяки використанню готових ГЕК-вміщуючих розчинів "Стабізол" і "Рефортан" (виробництва компаній Берлін-Хемі АГ або Берлін-Фарма, ЗАО). Заявлений спосіб виконується наступним чином. Фракціонування пуповинної/плацентарної крові проводять з використанням градієнту густини 6%-ого колоїдного розчину ГЕК ("Стабізол", Берлін-Хемі АГ, що має молекулярну масу (М) полімерів глюкози 450000 Da і ступінь заміщення (DS) (частка молекул глюкози, де гідроксильні групи заміщені гідроксіетильними) - 0,7. Видалення еритроцитів та концентрацію ЯВК проводять за допомогою центрифугування. Приготування суспензії ядровмісних клітин до кріоконсервування здійснюють шляхом видалення 2/3 об'єму надосадової рідини, додавання до концентрату ЯВК 20% розчину кріопротектора ДМСО (у 6%-му розчині "Рефортан" виробництва Берлін-Хемі АГ з наступними характеристиками: М-200000 Da, DS - 0,5) у співвідношенні 2:1 (кінцева концентрація ДМСО 5%). Суміш ретельно ресуспендують і після перенесення в кріоконтейнери або кріоампули (процедура перенесення проводиться в гіпотермічних умовах і займає до 20 хвилин) піддають програмному заморожуванню. Приклад 1 Пуповинну/плацентарну кров за найближчим аналогом змішували з розчином "Стабізол" (6% вий розчин з формулою 450/0,7) у співвідношенні 1 частина розчину на 2 частини стабілізованої крові. Відстоювали 40 хвилин при кімнатній температурі. Вільний від еритроцитів надосад з ЯВК центрифугували протягом 10 хвилин зі швидкістю 1200 об/хв. Видаляли дві третини надосаду, отриманий концентрат клітин ресуспендували в залишку надосадової рідини. До приготовленої суспензії ЯВК додавали кріоконсервант, що вміщує водний 16%вий розчин низькомолекулярного ПВП, глюкозу (10%) та лактозу (4%) (у співвідношенні компонентів розчину), у співвідношенні 1:1 (об/об). Проводили обережне ресуспендування клітин у кріоконсерванті. Отриману клітинну завись з кріоконсервантом розливали у кріопробірки та заморожували у відповідності до загальноприйнятого програмного заморожування для об'єктів під захистом кріопротектора ПВП. Розморожування проводили на водяній бані при температурі 39±0,5°С протягом 35±5 сек. 56992 4 Після розморожування проводили оцінку збереженості ядровмісних клітин методами суправітального забарвлення 0,1% розчином трипанового синього та підрахунку кількості ядровмісних і мононуклеарних клітин. Приклад 2 Пуповинну/плацентарну кров за способом, що заявляється, змішували з розчином "Стабізол" (6% -вий розчин з формулою 450/0,7) у співвідношенні 1 частина розчину на 2 частини стабілізованої крові. Відстоювали 40 хвилин при кімнатній температурі. Вільний від еритроцитів надосад з ЯВК центрифугували протягом 10 хвилин зі швидкістю 1200 об/хв. Видаляли дві третини надосаду, отриманий концентрат клітин ресуспендували в залишку надосадової рідини. До приготовленої суспензії ЯВК додавали кріоконсервант, що вміщує 20% ДМСО у розчині "Рефортан" (6%-вий розчин з формулою 200/0,5), у співвідношенні 2:1 (об/об). Проводили обережне ресуспендування клітин у кріоконсерванті. Отриману клітинну завись з кріоконсервантом розливали у кріопробірки та заморожували у відповідності до загальноприйнятого програмного заморожування для об'єктів під захистом кріопротектора ДМСО. Розморожування проводили на водяній бані при температурі 39±0,5 °С протягом 35±5 сек. Після розморожування проводили оцінку збереженості ядровмісних клітин методами суправітального забарвлення 0,1% розчином трипанового синього та підрахунку кількості ядровмісних і мононуклеарних клітин. Відтворення процедур за прикладом 1 і прикладом 2 проводили паралельно. Отримані результати представлені в таблиці 1. Представлені в таблиці дані свідчать про наявність суттєвої різниці в результатах, отриманих при застосування двох способів. При застосуванні способу, що заявляється, суттєво збільшується вихід ядровмісних і мононуклеарних клітин після розморожування, а також їх життєздатність, що підтверджується значно більшою збереженістю мембран клітин порівняно з найближчим аналогом. Таким чином, спосіб, що заявляється, дозволяє підвищити життєздатність кріоконсервованих ядровмісних і мононуклеарних клітин пуповинної/плацентарної крові в умовах кріоконсервування з кріопротектором діметилсульфоксид в 5% концентрації та в присутності колоїдних розчинів високомолекулярного та середньомолекулярного гідроксіетилкрохмалю. При цьому усувається негативна дія ДМСО (за рахунок його низької концентрації) і спрощується технологія за рахунок виключення операцій щодо видалення кріоконсервуючого середовища зі складу розмороженого клінічного зразка та їх ресуспендування перед введенням в організм реципієнта. Фізіологічність трансфузійного засобу з пуповинної/плацентарної крові забезпечується використанням готових інфузійних препаратів. 5 56992 6 Таблиця 1 Показник № досліду 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Приклад* 2 I II I II I II I II I II I II I II I II I II I II Збереженість цитоплазма- Кількість ядровмісних клі- Кількість мононуклеарів, . тичних мембран, % тин, .106/мл 106/мл 3 81 92 84 93 83 92 85 94 87 96 85 92 84 95 86 94 88 95 89 95 4 22,05 23,60 35,33 36,75 42,65 44,15 24,15 25,55 34,85 35,90 28,70 28,90 18,15 19,50 23,50 24,25 22,70 23,60 41,50 42,75 5 7,06 7,55 9,54 9,92 10,24 10,60 7,49 7,92 11,85 12,21 10,91 10,69 3,99 4,10 5,64 6,55 7,26 7,32 16,60 16,67 *Примітка: І - найближчий аналог; II - спосіб, що заявляється. Джерела інформації: 1. Nagler A., Peacock M., Fantoco M. et al. Separation of hematopoietic progenitor cells from human umbilical cord blood // J. Hematother. - 1993. №2. - P. 243. 2. Davey S., Armitage S., Rocha V., Gamier F., Brown J., et al. The London Cord Blood Bank: Analysis of banking and transplantation outcome// Br J Haematol. - 2004. - Vol. 125. - P. 358-365. 3. Buldt J. Fluid choice for resuscitation of the trauma patient: a review of the physiological, pharmacological, and clinical evidence // Can. J. Anaesth. - 2004. - V. 51, №5. - P. 500-513. Комп’ютерна верстка А. Рябко 4. Беляев А.В. Выбор препарата для коррекции гиповолемии: кристаллоидно-коллоидная и коллоидно-кколлоидная дилемма// Мистецтво лікування. - 2004. - №7 (13). - С. 53-58. 5. Патент №42599А UA A01N1/00, 1/02, А61К35/14 (Перехрестенко П.М., Глухенька Г.Т., Калиниченко Т.О., Алгазінова М.К., Настенко. О.П. /ІГТ АМНУ/ Спосіб кріоконсервування та підготовки до трансфузії гемопоетичних кітин кордової крові) З. №2001042650, Заявл. 19.042001. Опубл. 15.10.2001. Бюл. №9. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601