Спосіб кріоконсервування суспензії фетальних нервових клітин

Спосіб кріоконсервування суспензії фетальних нервових клітин, що включає інкубацію клітин в розчині Хенкса, що містить 10 % ембріональної 3 В основу корисної моделі поставлена задача створити такий спосіб кріоконсервування суспензії ФНК, у якому б, шляхом зміни складу кріозахисного середовища та режиму заморожування, забезпечувалася можливість підвищення життєздатності клітин та їх функціонального потенціалу. Ця задача вирішується тим, що в способі кріоконсервування суспензії ФНК, який включає інкубацію клітин в розчині Хенкса, що містить 10% ETC, глюкозу, кріопротектор ДМСО, і поетапне заморожування до температури рідкого азоту, відповідно до корисної моделі, в розчин Хенкса додатково вводять 0,2 Ед/мл інсуліну, глюкозу беруть в концентрації 0,6%, ДМСО - в концентрації 10%, а заморожування здійснюють в чотири етапи, при цьому, на І етапі суспензію ФНК заморожують зі швидкістю 1 °С/хв до -9 °С з наступною стабілізацією протягом 10 хв, на II етапі - зі швидкістю 1 °С/хв до -25 °С, на III етапі - 10 °С/хв до -60 °С і на IV етапі занурюють у рідкий азот. Оптимізація процесу заморожування забезпечує баланс між процесами зневоднення клітин і утворенням кристалів льоду та зняття переохолодження. Додавання інсуліну у кріозахисний розчин забезпечує підвищення внутриклітинної концентрації Mg, К, Са, що сприяє захисту клітин від пагубного впливу гіперконцентрацій солей у процесі заморожування-відтаювання. Підвищення концентрації глюкози та кріопротектору сприяє нормалізації осмотичного градієнту. Це дозволяє підвищити життєздатність клітин до 82% та їх функціональний потенціал. Спосіб пояснюється наступними прикладами. Приклад 1. Суспензію ФНК отримували методом механічної дисоціації фрагментів мозку щурів 11 діб гестації на розчині Хенкса з додаванням 10% ЭТС, 0,6% глюкози, 0,2 Ед/мл інсуліну. До суспензії клітин по краплям додавали розчин кріопротектору ДМСО до кінцевої концентрації 10%. Отримання суспензії клітин, додавання кріопротектору та інкубацію протягом 10 хв здійснювали на льоду. Заморожували суспензію ФНК за чотирьохетапною програмою: на І етапі охолоджували зі швидкістю 1°С/хв до -9 °С з наступною стабілізацією протягом 10 хв, на II етапі -1 °С/хв до -25 °С, на III етапі 10°С/хв до -60 °С, на IV етапі занурювали у рідкий 59206 4 азот. Відігрівали на водяній бані при 41 °С впродовж 50-60 сек до зникнення твердої фази. Життєздатність розморожених клітин визначали методом проточної цитофлюориметрії з використанням пропідію йодиду та суправітального забарвлення трипановим синім. Вона склала 82,7±1,9% (за пропідієм йодидом) та 81,3±3,3% (за трипановим синім). Приклад 2. Суспензію ФНК отримували методом механічної дисоціації фрагментів мозку щурів 11 діб гестації на розчині Хенкса. Кріоконсервування проводили заявленим способом та за найближчим аналогом. Розподіл субпопуляційного складу кріоконсервованих ФНК визначали методом проточної цитофлуориметрії з використанням моноклональних антитіл до nestin (маркер нейральних стволових/прогеніторних клітин), GFAP (маркер гліального диференціювання), -tubulin (маркер раннього нейронального диференціювання). В суспензії ФНК, кріоконсервованій заявленим способом, у порівнянні з ФНК, кріоконсервованими способом за прототипом на фоні загального концентраційного підвищення досліджуваних субпопуляцій (Таблиця), достовірно не змінювалася концентрація + nestin клітин, але в 2 раза збільшувався відсоток + + GFAP клітин і в 4,9 раза - -tubulin клітин. Саме ці клітини формують мієлінову обкладину нервових волокон, яка руйнується при нейродегенеративних захворюваннях. Тому підвищення їх концентрації свідчить про збільшення функціонального потенціалу ФНК, який перевіряли в системі in vivo. Для цього щурам з експериментальним алергійним енцефаломієлітом, що є однією з форм аутоімунної патології нейродегенеративної природи, вводили кріоконсервовані ФНК. Розвиток патології після введення ФНК, кріоконсервованих за прототипом знизився на 44±2,3 %, а після введення ФНК, кріоконсервованих заявленим способом - на 57±2,2 % . Висока життєздатність та високий функціональний потенціал кріоконсервованих заявленим способом ФНК забезпечують можливість їх використання для отримування лікувальних препаратів. Таблиця Субпопуляційний склад фетальних нервових клітин після кріоконсервування Субпопуляційний маркер + Nestin клітини, % + GFAP клітини, % + B-tubulin клітини, % Джерела інформації: 1. Сукач А.Н. Петренко А.Ю. Плачинта М.С. Криоконсервирование эмбриональных нервных клеток крысы с использованием ДМСО // Проблемы криобиологии - 2001.- №3.- С. 61-62. Спосіб кріоконсервування ФНК прототип заявлений 21,85±2,31 17,81±1,77 4,62±0,32 8,18±0,78 14,34±1,24 70,01±5,3 2. Хиеа Т., Weib L., Zhengc R. et al. Effect of cryopreservation on proliferative features of neural progenitor cells derived from olfactory bulb of embryonic rat // Int. Journ. of pediatric otorhinolaryngology - 2009. -Vol. 73, №7.-P. 969-973. 5 59206 3. Цымбалюк В.И., Кочин О.В. Сравнительная оценка результатов трансплантации криоконсервированных эмбриональных нервных клеток и клеток стромы костного мозга, индуцированых в нейробласты, в область экспериментального эпилептического очага// Український нейрохірургічний журнал - 2005.- №4 - С.85-89. Комп’ютерна верстка Мацело М. 6 4. Грищенко В.І., Гольцев A.M., Гуріна Т.М., Бабенко Н.М. Спосіб кріоконсевування суспензії клітин ембріональної нервової тканини Патент 7 №4523 Україна, МПК , A01N1/02, Заявлено 24.05.2004. Опубл. 17.01.2005.-Бюл. №1, 2005, с 3.12 Підписне Тираж 24 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601