Спосіб кріоконсервування суспензії клітин сім’яників ссавців

Спосіб кріоконсервування суспензії клітин сім'яників, що включає поєднання суспензії клітин з розчином кріопротектора ДМСО в середовищі DMEM/F12 з додаванням 20 мМ Hepes і програмне заморожування від 20...22 °С до -70 °С з наступним зануренням у рідкий азот, який відрізняється тим, що ДМСО беруть у концентрації 10 %, а програмне заморожування проводять від температури 20...22 °С до температури початку кристалізації зі швидкістю 1 °С/хв., далі проводять програмне зняття переохолодження, після чого збільшують швидкість охолодження до 15...20 °С/хв. і охолоджують до температури -40 °С, а в діапазоні температур від -40 °С до -70 °С охолоджують зі швидкістю 20...25 °С/хв. (19) UA (11) (21) a200903525 (22) 13.04.2009 (24) 25.08.2010 (46) 25.08.2010, Бюл.№ 16, 2010 р. (72) ГУРІНА ТЕТЯНА МИХАЙЛІВНА, ПАХОМОВ ОЛЕКСАНДР ВІТАЛІЙОВИЧ, БОЖОК ГАЛИНА АНАТОЛІЇВНА, БОНДАРЕНКО ТЕТЯНА ПЕТРІВНА (73) ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ (56) Chen G.R., Ge R.S., Lin H., Sottas СМ., Hardy M.P. Development of a cryo preservation protocol for Leydig cells // Human Reproduction.-2007.-Vol. 22, № 8.- P. 2160-2168. Tai J., Tze W.J., Johnson H.W. Cryopreservation of rat Leydig cell for in vitro and in vivo studies // Horm Metab Res.- 1994.- Vol. 26, №3.-P. 145-147 (abstract). UA 80497 C2, 25.09.07. UA 4523 U, 17.01.05. US 20080057040 A1, 06.03.08. RU 2257710 C2, 10.08.05. Polge C. Low-Temperature Storage of Mammalian Spermatozoa. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences, Volume 147, Issue 929, pp. 498-508 (ABSTRACT). Firooz Jannat Alipoor ET AL.: Achieving high survival rate following cryopreservation after isolation of prepubertal mouse spermatogonial cells. Journal of C2 2 91787 1 3 91787 4 Після 3-годинної інкубації зі стимулюючим агентом 10%, а програмне заморожування проводять до рівень базального тестостерону знижується у 6 температури початку кристалізації зі швидкістю разів по відношенню до стимульованого гонадот1°С/хв, далі здійснюють програмне зняття переоропним гормоном. холодження, після чого збільшують швидкість охоНедоліком цього способу кріоконсервування є лодження до 15...20°С/хв і охолоджують до -40°С, те, що для його здійснення необхідна висока (15%) а в діапазоні температур від -40°С до -70°С охолоконцентрація кріопротектору. А, як відомо [2], джують зі швидкістю 20...25°С/хв. ДМСО у такій концентрації виявляє токсичну дію Введення процесу зняття переохолодження і на клітини, що знижує життєздатність клітин після зміни швидкості охолодження в певних температукріоконсервування. Це спонукає шукати шляхи для рних інтервалах дозволяє знизити концентрацію зниження його концентрації у кріозахисних розчикріопротектору і нівелювати пошкодження клітин, нах. Окрім того, для заморожування зразків викопов'язані з фізичними перетвореннями у цих інтеристовують неконтрольовані швидкості охолорвалах. Це забезпечує підвищення показників сходження. Це знижує безпосередньо показники ронності та функціональної активності деконсерсхоронності і функціональної активності клітин, а вованого біоматеріалу. Окрім цього, спосіб також імовірність отримання однакових результадозволяє кріоконсервувати цільну суспензію клітин тів після процесу заморожування-нагріву. тестісів, а не окремі клітини Лейдіга, що надає моНайбільш близьким до заявленого є спосіб жливості отримувати більш повноцінний матеріал консервування суспензії клітин Лейдіга половозрідля трансплантації. лих щурів [3], згідно з яким суспензію клітин замоСпосіб здійснюють таким чином. рожують у присутності 15% ДМСО, виготовленого До суспензії клітин тестісів додають розчин на живильному середовищі DMEM/F12, від 20кріопротектору ДМСО, виготовлений на живиль22°С до -70°С з постійною швидкістю 1°С/хв, після ному середовищі DMEM/F12 з додаванням 20мМ чого зразки занурюють у рідкий азот. Нагрів здійсHepes до отримання кінцевої концентрації кріопронюють на водяній бані при температурі 37°С. Після тектору 10%. Заморожування проводять від темнагрівання життєздатність клітин Лейдіга, оцінена ператури 20...22°С до температури початку крисза методом суправітального забарвлення клітин талізації зразків зі швидкістю 1°С/хв, далі тріпановим синім, становить 75% від загальної проводять програмне зняття переохолодження, кількості клітин у розмороженому зразку. Показник після чого збільшують швидкість охолодження до базального рівню тестостерону нижче у 9 разів по 15...20°С/хв і охолоджують до -40°С, а в діапазоні відношенню до стимульованого гонадотропним температур від -40°С до -70°С охолоджують зі гормоном. швидкістю 20...25°С/хв, після чого зразки занурюГоловними недоліками цього способу є викоють у рідкий азот (-196°С). ристання високої концентрації кріопротектору, яка Нагрів здійснюють на водяній бані при темпеє токсичною для клітин, і те, що заморожування до ратурі 32-34°С. Далі зразки відмивають від ДМСО -70°С проводять з постійною контрольованою шляхом поступового зниження його концентрації у швидкістю охолодження 1°С/хв. Відомо, що у темживильному середовищі DMEM/F12. пературному інтервалі від 0°С до -70°С відбуваСпосіб пояснюється прикладами. ється ряд фізичних перетворень (фазовий перехід Приклад 1. Суспензію клітин тестісів половозвода-лід для основної маси рідкої фракції, кристарілих щурів отримували таким чином. Після екстлізація кріопротекторного розчину евтектичної рипації тестіси звільняли від оболонок. Тканину концентрації, рекристалізаційні процеси на етапі подрібнювали на фрагменти і далі проводили м'янагріву, утворення мікрокристалів льоду із аморфку обробку колагеназою (4мг/мл) на живильному ної фракції, що розскловалася). Кожен з цих просередовищі DMEM/F12 з 20мМ Hepes (pH=7,2-7,4) цесів може впливати на показники кінцевої схопри 32-34°С та безперервному помішуванням на ронності деконсервованого біоматеріалу і тому протязі 15 хв. Перед розведенням отриманої супотребує зміни швидкості охолодження зразків в спензії клітин у градієнті сахарози проводили перпевних температурних інтервалах для зменшення винне осадження тубулярних структур. Після розїх ушкоджуючої дії під час заморожування. Таким ділення у ступінчатому градієнті щільності чином, висока концентрація кріопротектору та поссахарози було отримано фракцію клітин з щільністійна швидкість охолодження зразка до -70°С тю 1,127-1,176 г/см3. По завершенню розділення спричиняють пошкодження клітин при заморожуклітини були відмиті живильним середовищем ванні. DMEM/F12 з 20мМ Hepes (pH=7,4) і саме ця фракВ основу винаходу поставлено задачу створиція використовувалась для кріоконсервування. ти такий спосіб кріоконсєрвування суспензії клітин Заморожування суспензії клітин тестісів протестісів, в якому би, за рахунок зниження концентводили з використанням кріопротектору ДМСО, рації кріопротектору у захисному розчині і зміни розчин якого виготовляли на живильному середорежиму заморожування, забезпечувалась можливищі DMEM/F12 з додаванням 20мМ Hepes. Розвість підвищити схоронність та функціональну акчин ДМСО додавали до суспензії клітин у співвідтивність деконсервованого біоматеріалу. ношенні 1:1 для отримання кінцевої концентрації Ця задача вирішується тим, що у способі кріокріопротектору 10%. Об'єм зразку, що заморожуконсервування суспензії клітин, який включає повали, становив 1мл. Заморожування проводили на єднання суспензії клітин з розчином кріопротектопрограмному заморожувачі "Cryoson" (Німеччина) ру ДМСО і програмне заморожування від 20...22°С в кріоампулах (фірма Nunc) об'ємом 1,8мл згідно з до -70°С з послідуючим зануренням у рідкий азот, таким режимом: від температури 20...22°С до темзгідно з винаходом, ДМСО беруть у концентрації ператури початку кристалізації зразки охолоджу 5 91787 6 вали зі швидкістю 1°С/хв, далі проводили програношенню до базального в значній мірі залежить мне зняття переохолодження. Після цього збільвід виду тропного гормону, який використовується шували швидкість охолодження до 15...20°С/хв і для стимуляції, його концентрації, проміжку часу, охолоджували до -40°С, а в діапазоні температур впродовж якого проводили стимуляцію, темперавід -40°С до -70°С охолоджували зі швидкістю тури стимуляції та інші умови інкубації. Важливим 20...25°С/хв, далі зразки занурювали у рідкий азот. є саме збереження здібності клітин відповідати Програмне зняття переохолодження передбапідвищенням рівня тестостерону на стимулюючий чене можливостями заморожувана і реалізується агент. шляхом температурної ініціації кристалоутворення Паралельно визначали загальну схоронність (різкого зниження температури зразків), при цьому клітин у суспензії тесті-сів, схоронність клітин Лейвеличина переохолодження не перевищує 0,5-1°С. діга і показники функціональної активності суспенНагрів здійснювали на водяній бані при темпезії після кріоконсервування відомим способом (за ратурі 32-34°С. Далі зразки відмивали від ДМСО прототипом). Загальна схоронність клітин у сушляхом поступового зниження його концентрації у спензії становила 51,6±7%, а схоронність клітин живильному середовищі DMEM/F12. Після нагріЛейдіга 35,4±3,0%. Рівень базальної секреції тесвання визначали загальну життєздатність і загальтостерону становив 23±6 нмоль/кл 1012, стимуну схоронність розморожених клітин, схоронність льованої секреції 45±6 нмоль/кл 1012, тобто покаокремо клітин Лейдіга та базальний і стимульовазник базальної секреції знизився приблизно в 2 ний рівень тестостерону у середовищі інкубації рази по відношенню до стимульованої секреції клітин. через 1 годину після інкубації зі стимулюючим агеЖиттєздатність - це відносна кількість живих нтом. клітин до їх загальної кількості в нативному або Життєздатність і функціональна активність відеконсервованому зразку. Схоронність клітин у дігрітої суспензії клітин тестісів була перевірена in суспензії після кріоконсервування - це кількість vivo на прикладі інтратестикулярної трансплантації клітин у відсотках по відношенню до кількості клірозмороженої суспензії щурам з різними моделятин у суспензії до її заморожування. Показник схоми гіпогонадизму. А саме, експериментальний ронності по величині є меншим за показник життєгіпогонадизм (вада чоловічих статевих гормонів) і здатності, але являється більш об'єктивним хірургічний гіпогонадизм (орхіектомія - повне викритерієм. далення статевих залоз). Схоронність функції цих Загальну схоронність клітин у суспензії, як і заклітин була підтверджена зростанням тестостерогальну життєздатність, контролювали методом ну у крові і масою додаткових статевих залоз суправітального забарвлення трипановим синім. (Таблиця 1). Визначати життєздатність клітин Лейдіга у заПриклад 2. Для виявлення впливу процесу гальній суспензії за методом суправітального запрограмного зняття переохолодження зразків і барвлення трипановим синім неможливо, тому що швидкості їх охолодження до температури -40°С у нашому випадку суспензія містить цілий ряд кліна кінцеві показники схоронності та функціональтин, які однаково реагують на трипановий синій. ної активності клітин тесті-сів щурів спосіб здійсНа відміну від інших видів клітин у суспензії клітинювали аналогічно Прикладу 1, за винятком того, ни Лейдіга володіють активністю ферменту 3 що змінювали режим заморожування. Для першої HSD, який є ключовим ферментом у синтезі тестогрупи зразків від температури 20...22°С до -40°С стерону. Тому для визначення схоронності клітин охолодження проводили з постійною швидкістю Лейдіга в загальній суспензії використовували 1°С/хв з послідуючим зануренням у рідкий азот специфічне гістохімічне забарвлення. (режим 1). Для другої групи зразків від температуЗагальна життєздатність і загальна схоронри 20...22°С до -40°С охолодження проводили з ність клітин у суспензії становила 90,65±2,2% і постійною швидкістю 1°С/хв, але додатково про58±1%, відповідно. Схоронність клітин, які володіводили програмне зняття переохолодження зразють активністю 3 -HSD, що є одним із маркерів ків, після досягнення зразками температури -40°С клітин Лейдіга, становила 83±7%. їх занурювали у рідкий азот (режим 2). Для третьої Функціональну активність оцінювали шляхом групи зразків від температури 20...22°С охоловизначення базальної і стимульованої секреції, дження здійснювали з постійною швидкістю для чого проводили інкубацію клітин в середовищі 1°С/хв, далі проводили програмне зняття переоDMEM/F12 з 20мМ Hepes впродовж 1 години при холодження зразків, після чого збільшували швидтемпературі 32...34°С. Як стимулятор стероїдогекість охолодження до 15...20°С/хв і охолоджували незу використовували хоріонічний гонадотропін, з цією швидкістю до температури -40°С з послідуякий у концентрації 1 МЕ/мл додавали до середоючим зануренням у рідкий азот (режим 3). Показвища інкубації. Вміст тестостерону визначали у ники загальної схоронності клітин у суспензії, схосередовищі інкубації радіоімунологічним методом ронності клітин Лейдіга, а також функціональної з використанням тест-набору "РИА СТактивності клітин після відігріву наведено у Таблитестостерон" (Беларусь). ці 2. З Таблиці 2 видно, що введення до режиму Показник базальної секреції тестостерону стазаморожування процедури програмного зняття переохолодження зразків і збільшення швидкості новив 20±4 нмоль/кл 1012, стимульованої секреції охолодження до 15...20°С/хв при охолодженні до 75±8 нмоль/кл 1012. Таким чином, показник базатемператури -40°С забезпечує підвищення схольної секреції знизився по відношенню до стимуронності клітин Лейдіга майже у 2 рази, а стимульованої секреції в 4 рази вже через 1 годину післьовану секрецію тестостерону в 1,3 рази по відля інкубації зі стимулюючим агентом. Рівень підвищення стимульованого тестостерону по від 7 91787 8 ношенню до режиму 1 з постійною швидкістю охоПоказники загальної схоронності клітин у сулодження до -40°С. спензії, схоронності клітин Лейдіга, а також функПриклад 3. Для виявлення впливу швидкості ціональної активності клітин після відігріву навеохолодження в температурному інтервалі -40°С...дено у Таблиці 3. З Таблиці 3 видно, що 70°С на показники схоронності та функціональної використання високої і контрольованої швидкості активності клітин у зразках суспензії клітин тестісів охолодження у температурному інтервалі -40°С...турів на цьому етапі спосіб здійснювали аналогіч70°С підвищує показники загальної схоронності но Прикладу 1, за винятком того, що змінювали клітин у суспензії в 1,1 рази, схоронність клітин швидкість охолодження. Для першої групи зразків Лейдіга в 1,7 рази по відношенню до аналогічних від температури 20...22°С до -40°С охолодження показників згідно режиму 1. проводили з постійною швидкістю 1°С/хв, а далі Приклад 4. Для підтвердження придатності зазанурювали у рідкий азот. Тобто, після температуявленого способу для кріоконсервування суспензії ри -40°С зразки охолоджували з неконтрольоваклітин тестісів інших видів ссавці спосіб здійснюною швидкістю (режим 1). Для другої групи зразків вали аналогічно прикладам 1-3, але суспензію від температури 20...22°С до -70°С охолодження клітин тестісів отримували від кролів та морських проводили з постійною швидкістю 1...2°С/хв з поссвинок. Вибрані для досліджень тварини (щури, лідуючим зануренням у рідкий азот. Тобто, в інтекролі та морські свинки) є тваринами різного філорвалі температур -40°С...-70°С швидкість охологенетичного споріднення. дження була повільною і контрольованою - 1°С/хв, Якість відігрітого біоматеріалу оцінювали за як у прототипі (режим 4). Для третьої групи зразків показниками загальної схоронності та життєздатвід температури 20...22°С до -40°С охолодження ності клітин у суспензії, а також схоронності окрепроводили з постійною швидкістю 1°С/хв, у темпемо клітин Лейдіга (таблиці 4, 5). З таблиць видно, ратурному інтервалі від -40°С до -70°С швидкість що, як і у випадку зі щурами, режими 3 та 5 підвиохолодження підвищували до 20...25°С/хв з посліщують показники загальної схоронності та зальної дуючим зануренням у рідкий азот. Тобто, в інтержиттєздатності клітин у суспензії, а також схоронвалі температур -40°С...-70°С швидкість охолоність клітин Лейдіга по відношенню до режимів дження була високою і контрольованою заморожування, у яких характерні для різних тем20...25°С/хв (режим 5). пературних інтервалів явища не враховуються належним чином. Таблиця 1 Рівень тестостерону у крові тварин і маса їх додаткових статевих залоз для щурів з різними моделями гіпогонадизму (n=7) Рівень тестостерону, нмоль/л Маса додаткових статевих залоз, на грам маси тварини Рівень тестостерону, нмоль/л Маса додаткових статевих залоз, на грам маси тварини Без транспланТрансплантація нативної тації суспензії Експериментальний гіпогонадизм 0,44±0,06 0,93±0,06 1,49±0,21 Трансплантація кріоконсервавоної суспензії 0,75±0,06 2,22±0,33 2,22±0,21 Хірургічний гіпогонадизм 0,26±0,06 0,31±0,06 0,44±0,08 0,10±0,08 0,51±0,08 0,66±0,08 Таблиця 2 Вплив програмного зняття переохолодження та швидкості охолодження до температури -40°С на показники схоронності та функціональної активності клітин у зразках суспензії клітин тестісів щурів (n=4) Загальна схоронність Схоронність клітин Базальна секреція тестосклітин у суспензії, % Лейдіга у суспензії, % терону, нмоль/кл 1012 Режим 1 Режим 2 Режим 3 55,6±6 64,8±2 64,5±3 36,6±5 47,4±8 71,6±4 30±5 11±1 10±2 Стимульована секреція тестостерону, нмоль/кл 1012 48±5 61±5 63±2 9 91787 10 Таблиця 3 Вплив швидкості охолодження в температурному інтервалі -40°С...-70°С на показники схоронності та функціональної активності клітин у зразках суспензії клітин тестісів щурів (n=4) Загальна схоронність Схоронність клітин Базальна секреція тестосклітин у суспензії, % Лейдіга у суспензії, % терону, нмоль/кл 1012 Режим 1 Режим 4 Режим 5 55,6±6 51,6±7 61,3±4 36,6±5 35,4±3 61,0±4 30±5 23±6 17±2 Стимульована секреція тестостерону, нмоль/кл 1012 48±5 45±6 47±5 Таблиця 4 Вплив різних режимів охолодження на показники схоронності та життєздатності у зразках суспензій клітин тестісів кролів (n=4) Режим 1 Режим 2 Режим 3 Режим 4 Режим 5 Загальна схоронність клітин у Загальна життєздатність клітин суспензії, % у суспензії, % 14,6±6,7 32,7±8,2 6,9±4,8 27,6±6,0 25,9±9,2 51,7±7,8 16,7±6,1 22,1±5,4 26,3±6,7 29,4±5,6 Схоронність клітин Лейдіга у суспензії, % 31,6±7,4 45,8±8,5 48,2±8,2 72,7±7,9 74,7±5,0 Таблиця 5 Вплив різних режимів охолодження на показники схоронності та життєздатності у зразках суспензій клітин тестісів морських свинок (n=4) Режим 1 Режим 2 Режим 3 Режим 4 Режим 5 Загальна схоронність клітин у Загальна життєздатність клітин суспензії, % у суспензії, % 29,6±4,0 60,3±6,7 26,9±4,4 69,2±2,6 27,9±7,4 63,5±3,5 21,6±4,5 46,3±8,9 28,6±5,8 50,0±7,6 Джерела інформації. 1. Chen G.R., Ge R.S., Lin H., Sottas СМ., Hardy M.P. Development of a cryopreservation protocol for Leydig cells // Human Reproduction. - 2007. - Vol. 22, № 8. - P. 2160-2168. 2. Пахомов А.В., Божок Г.А., Легач Е.И., Бондаренко Т.П. Гормонопродуцирующая способность клеток интерстиция семенников и органотипичес Комп’ютерна верстка О. Гапоненко Схоронність клітин Лейдіга у суспензії, % 15,7±1,4 17,3±5,3 33,1±6,01 21,0±2,4 31,4±5,5 кой культуры семенников новорожденных поросят после криоконсервирования // Проблемы криобиологии. - 2007. - Т. 17, № 2. - С. 179-185. 3. Tai J., Tze W.J., Johnson H.W. Cryopreservation of rat Leydig cell for in vitro and in vivo studies // Horm Metab Res. - 1994. - Vol. 26, № 3. - P. 145147. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601