Пептиди, фармацевтична композиція з протипухлинною активністю та спосіб лікування пухлин у ссавців

1 Пептиди формули І R1R2N-CHX-CO-A-B-D-E-(F)t-K, I де R1 означає метил, етил або ізопропіл, R2 означає водень, метил або етил, R1-N-R2 разом можуть утворювати піролідинове кільце, А означає залишок валілу, ізолейцилу, лейцилу, 2трет-бутилгліцилу, 2-етилгліцилу, норлейцилу або норвалілу, В означає залишок N-метил-валілу, -лейцилу, ізолейцилу, -норвалілу, -норлейцилу, -2-третбутилгліцилу, -3-трет-бутилаланілу або -2етилгліцилу, D означає залишок пролілу, 3,4-депдропролілу, 4фторопролілу, 4,4-дифторопролілу, азетидин-2карбонілу, гомопролілу, 3-метил пролілу, 4 Відомо, ЩО пептиди, ізольовані з продуктів морського походження, такі як доластатин-10 (США № 4816444) та доластатин-15 (ЕР-А398558), мають сильну інгібуючу дію на ріст клітин (див Biochem Pharmacology, 40, № 8, 1859-64, 1990, J Nail Cancer Inst, 85, 483-88, 1993, та посилання у них) На основі одержаних цікавих результатів експериментальних досліджень пухлинних систем in vivo зараз проводяться подальші доклінічні дослідження цих природних продуктів для того, щоб розпочати КЛІНІЧНІ дослідження у хворих на рак пацієнтів Однак, природні продукти мають недоліки, такі як низька розчинність у водних розчинниках та метилпролілу, 5-метилпролілу або тіазолідин-4карбонілу, Е означає залишок 3,4-депдропролілу, 4фторопролілу, 3-метил пролілу, 4-метил пролілу, азетидин-2-карбонілу або 4,4-дифторопролілу, F означає залишок валілу, 2-трет-бутилгліцилу, ізолейцилу, лейцилу, 2-цикпогексилгліцилу, норлейцилу, норвалілу, неопентилгліцилу, аланілу, Р -аланілу або аміноізобутироілу, X означає алкіл (бажано С25), циклопропіл або циклопентил, t означає 0 або 1,і К означає алкоксигрупу (бажано Сі 4), бензилоксигрупу або заміщену чи незаміщену амінофупу, та їх солі з фізіологічно прийнятними кислотами 2 Фармацевтична композиція з протипухлинною активністю, яка включає активний інгредієнт на основі пептиду та фармацевтично прийнятний носій, яка відрізняється тим, що як пептид вона включає принаймні одну сполуку за п 1 в терапевтично ефективній КІЛЬКОСТІ 3 Спосіб лікування пухлини у ссавця, який включає введення ссавцю пептиду, який відрізняється тим, що як пептид використовують принаймні одну сполуку за п 1 в терапевтично ефективній КІЛЬКОСТІ дорогі компоненти, потрібні для синтезу Даний винахід стосується нових пептидів та їх похідних, які мають поліпшений терапевтичний потенціал для лікування пухлинних захворювань порівняно з доластатином-15 Більш того, сполуки за цим винаходом можуть бути легко синтезовані, як детально описано нижче Сполуки за цим винаходом включають нові пептиди формули І R1R2N-CHX-CO-A-B-D-E-(F)t-K Де R позначає метил, етил або ізопропіл, R2 позначає водень, метил або етил, R1-N-R2 разом можуть утворювати піролідино q Ю ^^ ^^ (О 46775 можуть бути CF3, нітрогрупою, Сі 4ве кільце, алкілсульфонілом, Сі 4-алкоксигрупою, галогеном, А позначає залишок валілу, ізолейцилу, лейСі 4-алкілом, який може утворювати циклічну сисцилу, 2-трет-бутилгліцилу, 2-етилгліцилу, норлейтему, ціаногрупою, гідроксилом, І\І(СНз)2) СООМе, цилу або норвалілу COOEt, СООїРг або COONH2), або В позначає залишок N-метил-валілу, -лейцилу, -ізолейцилу, -норвалілу, -норлейцилу, -2-трет-(СНгіілгбензпдрил (w = 0,1 чи 2, який може бутилгліцилу, -3-трет-бутилаланілу або -2мати до двох замісників, що незалежно один від етилгліцилу, одного можуть бути CF3, нітрогрупою, Сі 4алкілсульфонілом, Сі 4-алкоксигрупою, галогеном, D позначає залишок пролілу, 3,4Сі 4-алкілом, який може утворювати циклічну сисдипдропролілу, 4-фторпролілу, 4,4тему, ціаногрупою, гідроксилом, І\І(СНз)2, СООМе, дифторпролілу, азетидин-2-карбонілу, гомопроліCOOEt, СООїРг або СООМН2), або біфеніл (який лу, 3-метил пролілу, 4-метил пролілу, 5може мати до двох замісників, що незалежно один метилпролілу або тіазолідин-4-карбонілу, від одного можуть бути CF3, нітрогрупою, Сі 4Е позначає залишок 3,4-депдропролілу, 4алкілсульфонілом, Сі 4-алкоксигрупою, галогеном, фторпролілу, 3-метил пролілу, 4-метил пролілу, Сі 4-алкілом, який може утворювати циклічну сисазетидин-2-карбонілу або 4,4-дифторпролілу, тему, ціаногрупою, гідроксилом, І\І(СНз)2, СООМе, F позначає залишок валілу, 2-третCOOEt, СООїРг або COONH2), або піридил (який бутилгліцилу, ізолейцилу, лейцилу, 2може мати до двох замісників, що незалежно один циклогексилгліцилу, норлейцилу, норвалілу, невід одного можуть бути CF3, нітрогрупою, Сі 4опентилгліцилу, аланілу, (і-аланілу або аміноізоалкілсульфонілом, Сі 4-алкоксигрупою, галогеном, бутироілу, Сі 4-алкілом, який може утворювати циклічну сисX позначає алкіл (бажано С25), циклопропіл тему, ціаногрупою, гідроксилом, І\І(СНз)2, СООМе, або циклопентил, COOEt, СООїРг або COONH2), або ПІКОЛІЛ (який t позначає 0 або 1, і може мати до двох замісників, що незалежно один К позначає алкоксигрупу (бажано Сі 4), бензивід одного можуть бути CF3, нітрогрупою, Сі 4локсигрупу або заміщену чи незаміщену аміногруалкілсульфонілом, Сі 4-алкоксигрупою, галогеном, пу, та їх солі з фізіологічно прийнятними кислотаСі 4-алкілом, який може утворювати циклічну сисми Даний винахід описує також способи тему, ціаногрупою, гідроксилом, І\І(СНз)2, СООМе, одержання сполук формули І, фармацевтичні комCOOEt, СООїРг або COONH2), або позиції, що містять такі сполуки разом з фармацевтичне прийнятним носієм, та способи їх викорис-СНг-СНг-піридил (який може мати до двох тання для лікування раку у ссавців замісників, що незалежно один від одного можуть бути CF3, нітрогрупою, Сі 4-алкілсульфонілом, Сі &,Конкретно, К може позначати Сі 4-алкокси, беалкоксигрупою, галогеном, Сі 4-алкілом, який може нзилокси або аміногрупу формули R5-N-R6, де утворювати циклічну систему, ціаногрупою, гідроR5 позначає водень, або пдроксигрупу, або Сі ксилом, N(CH3)2, СООМе, COOEt, СООїРг або 4-алкокси групу, або бензилоксигрупу (яка може COONH2), або бензотіазоліл (який може мати до мати до двох замісників, що незалежно один від двох замісників, що незалежно один від одного одного можуть бути CF3, нітрогрупою, Сі 4можуть бути CF3, нітрогрупою, Сі &,алкілсульфонілом, Сі 4-алкоксигрупою, галогеном, алкілсульфонілом, Сі 4-алкоксигрупою, галогеном, Сі 4-алкілом, ціаногрупою, гідроксилом, І\І(СНз)2, Сі 4-алкілом, який може утворювати циклічну сисCOOMe, COOEt, СООїРг або COONH2), або фенітему, ціаногрупою, гідроксилом, І\І(СНз)2, СООМе, локсигрупу (яка може мати до двох замісників, що COOEt, СООїРг або СООМН2), або бензоізотіазонезалежно один від одного можуть бути ліл (який може мати до двох замісників, що незаCF3,нітрогрупою,Сі 4,алкілсульфонілом галогеном, лежно один від одного можуть бути CF3, нітрогруСі 4-алкоксигрупою,галогеном,Сі 4-алкілом, ціаногпою, Сі 4-алкілсульфонілом, Сі 4-алкоксигрупою, рупою, гідроксилом, N(CH3)2, COOMe, COOEt, галогеном, Сі 4-алкілом, який може утворювати COOiPra6oCOONH 2 ), 6 циклічну систему, ціаногрупою, гідроксилом, R позначає водень, або Сі 12 -алкіл (який моN(CH3)2, СООМе, COOEt, СООїРг або COONH2), же бути заміщений одним чи кількома атомами або бензопіразоліл (який може мати до двох заміфтору), або -CfCHhhCN, або -С(СНз)2ССН, або сників, що незалежно один від одного можуть бути С(СН3)2С=СН2, або -С(СН3)2СН2ОН, або CF3, нітрогрупою, Сі 4-алкілсульфонілом, Сі &,С(СНз)2СН2СН2ОН, або -(CH2)V-C3 у-циклоалкіл (v = алкоксигрупою, галогеном, Сі 4-алкілом, який може 0,1 чи 2) (який може бути заміщеним метильною утворювати циклічну систему, ціаногрупою, гідрогрупою), або норефедрил, або норпсевдоефедксилом, N(CH3)2, СООМе, COOEt, СООїРг або рил, або ХІНОЛІЛ, або піразил, або адамантил, або COONH2), або бензоксазоліл (який може мати до СНг-бензімідазоліл, або СЬЬ-адамантил, або альдвох замісників, що незалежно один від одного фа-метилбензил, або альфа-диметилбензил, або можуть бути CF3, нітрогрупою, Сі &,(Cbbjv -феніл (v = 0,1, 2 чи 3, який може мати до алкілсульфонілом, Сі 4-алкоксигрупою, галогеном, двох замісників, що незалежно один від одного Сі 4-алкілом, який може утворювати циклічну сисможуть бути CF3, нітрогрупою, Сі &,тему, ціаногрупою, гідроксилом, І\І(СНз)2) СООМе, алкілсульфонілом, Сі 4-алкоксигрупою, галогеном, COOEt, СООїРг або COONH2), або-(СН2)тСі 4-алкілом, який може утворювати циклічну сисфлуореніл ( т = 0 чи 1, який може мати до двох тему, ціаногрупою, гідроксилом, І\І(СНз)2, СООМе, замісників, що незалежно один від одного можуть COOEt, СООїРг або COONH2), або бути CF3, нітрогрупою, Сі 4-алкілсульфонілом, Сі &,-(СН2)т-нафтил ( т = 0 чи 1, який може мати алкоксигрупою, галогеном, Сі 4-алкілом, який може до двох замісників, що незалежно один від одного 46775 утворювати циклічну систему, ціаногрупою, гідроксилом, N(CH3)2, COOMe, COOEt, COOiPr або COONH2), або піримідил (який може мати до двох замісників, що незалежно один від одного можуть бути CF3, нітрогрупою, Сі 4-алкілсульфонілом, Сі &,алкоксигрупою, галогеном, Сі 4-алкілом, який може утворювати циклічну систему, ціаногрупою, гідроксилом, N(CH3)2, COOMe, COOEt, СООїРгабо СООМН2), або -(СН 2 ) т -шданіл (т = 0 чи 1, який може мати до двох замісників, що незалежно один від одного можуть бути CF3 нітрогрупою, Сі &,алкілсульфонілом, Сі 4-алкоксигрупою, галогеном, Сі 4-алкілом, який може утворювати циклічну систему, ціаногрупою, гідроксилом, г\І(СНз)2, COOMe, COOEt, COOiPr або COONH2), або -(СН2СН2О)у-СНз (у = 0, 1, 2, 3, 4 чи 5), або -(СН2СН2О)у-СН2-СНз (у = 0, 1, 2, 3, 4 чи 5), або -ІЧН-СбНб (який може мати до двох замісників, що незалежно один від одного можуть бути CF3 нітрогрупою, Сі 4-алкілсульфонілом, Сі &,алкоксигрупою, галогеном, Сі 4-алкілом, який може утворювати циклічну систему, ціаногрупою, гідроксилом, N(CH3)2, COOMe, COOEt, COOiPr або COONH2), або -ІЧСНз-СбНб (який може мати до двох замісників, що незалежно один від одного можуть бути CF3, нітрогрупою, Сі 4-алкілсульфонілом, Сі &,алкоксигрупою, галогеном, Сі 4-алкілом, який може утворювати циклічну систему, ціаногрупою, гідроксилом, N(CH3)2, COOMe, COOEt, COOiPr або COONH2), або -І\ІН-СН2-СбН5 (який може мати до двох замісників, що незалежно один від одного можуть бути CF3, нітрогрупою, Сі 4-алкілсульфонілом, Сі &,алкоксигрупою, галогеном, Сі 4-алкілом, який може утворювати циклічну систему, ціаногрупою, гідроксилом, N(CH3)2, COOMe, COOEt, СООїРгабо COONH2), або -І\ІСНз-СН2-СбН5 (який може мати до двох замісників, що незалежно один від одного можуть бути CF3, нітрогрупою, Сі 4-алкілсульфонілом, Сі &,алкоксигрупою, галогеном, Сі 4-алкілом, який може утворювати циклічну систему, ціаногрупою, гідроксилом, N(CH3)2, COOMe, COOEt, COOiPr або COONH2), або п'ятичленний гетероарил, який може мати до двох замісників, що незалежно один від одного можуть бути CF3, нітрогрупою, Сі 4алкілсульфонілом, Сі 4-алкоксигрупою, тюметилом, тюетилом, ПІКОЛІЛОМ, ацетилом, Сз %циклоалкілом, тюфенілом, -CH2-COOEt, С34алкіленовою групою, що утворює біциклічну систему з гетероциклом, фенілом (який може мати до двох замісників, що незалежно один від одного можуть бути нітрогрупою, CF3, CN, галогеном, або Сі 4-алкілом), бензилом (який може мати до двох замісників, що незалежно один від одного можуть бути нітрогрупою, CF3, галогеном, Сі 4-алкілом, Сі 4-алкілсульфонілом, ціаногрупою, гідроксилом, Сі 4-діалкіламшогрупою), або -СНР7-5-членний гетероарил (який може мати до двох замісників, що незалежно один від одного можуть бути CF3, нітрогрупою, ціаногрупою, галогеном, COOMe, COOEt, COOiPr, CONH 2 , Сі 4 алкілом, Сі 4-алкоксигрупою, фенілом, бензилом, 6 нафтилом, чи Сі 4-алкілсульфонилом [R7 = водень, ЛІНІЙНИЙ чи розгалужений Сі 5-алкіл, бензил]) -СНР7-5-членний гетероарил може, наприклад, бути представленим одним із таких залишків «, CH, V-ce б ^А 6" 6 6 Ь СН3 5-чяенний гетероарил може наприклад бути представлений такими COOEt 46775 8 CH(CH3)CH2CH3, t дорівнює О чи 1 К бажано має такі значення -ОС(СН3)з, -NH2, -NH-Ci 12-алкіл, -NH-C38циклоалкіл, -МН-[3,ЗО]-біциклооктил, норефедрил, норпсевдоефедрил, -NH-ХІНОЛІЛ, -NH-піразил, -NHСНг-бензімідазоліл, -NH-адамантил, -NH-CH2адамантил, -МН-СН(СН3)-феніл, -NH-C(CH3)2феніл, -N(Ci 4-алкокси)-Сі 4-алкіл, -N(i 4-алкокси)СН2-феніл, -N(Ci 4-алкокси)-феніл, -N(CH3)OBzl, МН-(СН2)у-феніл (v = 0,1, 2 або 3), -NH-(CH2)mнафтил ( т = 0 або 1), -І\ІН-(СН2)ибензпдрил (w = 0,1 або 2), -NH-біфеніл, -NH-тридил, -NH-CH2тридил, -ІЧН-СНг-СНг-піридил, -NH-бензотіазоліл, -NH-бензоізотіазоліл, -NH-бензопіразоліл, -NHбензоксазоліл, -МН-(СН2)т-флуореніл ( т = 0 або 1), -NH-піримідил, -МН-(СН2)т-інданіл (т= 0 або 1), -NH-(CH2CH20)y-CH3 (y= 0, 1, 2, 3, 4 або 5), -NH(СН2СН20)у-СН2СНз (у = 0, 1, 2, 3, 4 або 5), -NH-(5членний гетероарил) (як зображено на сторінках 78,-МН-СНР7-5-членний гетероарил [R7 = водень, лінейний чи розгалужений Сі 5-алкіл, бензил] (як зображено на сторінці 7-8, або К позначає CHj /N N •Н. vJІ —я /~\ s —N гл ГЛ S=f> ^0-^0 R -N-R разом можуть утворювати структури, які обирають із групи, що складається із -Н N /—ч fi •N S» / S /—^ •N N 0 / —v / "N N S=0 / -О Перевага надається сполукам формули І, у яких замісники R1, R2, А, В, D, Е, X, F та t мають такі значення R1 позначає метил чи етил, R2 позначає водень, метил чи етил, А позначає залишок валілу, ізолейцилу, 2трет-бутилгліцилу, В позначає залишок N-метил-валілу, ізолейцилу, чи-2-трет-бутилгліцилу, D позначає залишок пролілу, 3,4депдропролілу, 4-фторопролілу, 3-метил пролілу чи тіазолідинил-4-карбонілу, Е позначає залишок 3,4-депдропролілу, 4фторопролілу, 3-метил пролілу, чи азетидин-2карбонілу, F позначає залишок D-валілу, 2-третбутилгліцилу, D-ізолейцилу, D-лейцилу, чи аміноізобутироілу, X позначає -СН(СНз)2, -С(СН3)з, чи Більш бажано К позначає -NHCH3 -NHCH2CH3, -NH(CH2)2CH3, NH(CH2)3CH3 -NH(CH2)4CH3 -NH(CH2)5CH3 NH(CH2)6CH3, -NH(CH2)7CH3 -NHCH(CH3)2 NHCH(CH3)CH2CH3 -NHCH(CH3)CH2CH2CH3, NHCH(CH2CH3)2 -NH(CH2CH2CH3)2 -NHC(CH3)3, NHCH(CH2CH3)CH2CH2CH3, -NHCH(CH3)CH(CH3)2 NHCH(CH2CH3)CH(CH3)2) -NHCH(CH3)C(CH3)3, -NHциклопропіл, -NH-циклобутил, -NH-циклопентил, NHциклогексил, -NH-циклогептил, -NHЦИКЛООКТИЛ, -МН-біцикло[3,3,0]октил, -N(CH3)OCH3, -N(CH3)OCH2CH3 -N(CH3)OCH2CH2CH3 N(CH3)OCH(CH3)2, -N(CH2CH3)OCH3, N(CH2CH3)OCH2CH3, -N(CH(CH3)2)OCH3, N(CH3)OCH2C6H5, -N(OCH3)CH2C6H5, -N(CH3)OC6H5 -NH-CH2-C6H5, -NH(CH2)2C6H5 -NH(CH2)3C6H5 NHCH(CH3)C6H5 -NHC(CH3)2C6H5 NHC(CH3)2CH2CH3 -NHC(CH3)(CH2CH3)2, NHCH(CH3)CH(OH)C6H5, -NHCH циклогексил, -NHCH2CF3, -NHCH(CH2F)2 -NHC(CH3)2CH2CH2OH, NH(CH2CH2O)2CH2CH3 -NHC(CH3)2CH(CH3)2, NHC(CH3)2CN, -NHC(CH3)2CCH, норефедрил, норпсевдоефедрил, -NH-ХІНОЛІЛ, -NH-піразил, -NHадамантил (I), -NH-адамантил (2), NH-CH2адамантил, -NH-CH2-нaфтил, -NH-бензпдрил, -NHбіфеніл, -NH-піридил, -NH-ПІКОЛІЛ, -NH-CH2-CH2піридил, -NH-бензотіазоліл, -NH-бензоізотіазоліл, NH-бензопіразоліл, -NH-бензоксазоліл, -NHфлуореніл, -NH-піримідил, -NH-Tia3onin(2), -NHізоксазоліл(З), -МН-СН2-фураніл(2), -NH-(3метил)ізоксазоліл(5), ^Н-(3-метил)ізотіазоліл(5), NH-(2-тpифтopмeтил)тlaдlaзoлlл(5), -ОС(СНз)з NH-CH2-(4-Me™-|)-Tia3onu-|(2), -NH-CH2-TieHin(2), 46775 10 (EDCI), н-пропанфосфонового ангідриду (РРА), г\І,г\І-біс(2-оксазолідиніл)-амідофосфорил хлориду (BOP-СІ), бром-трис-піролідинофосфоній гексафторфосфату (РуВгор), дифенілфосфорилазиду (DPPA), реагенту Кастро (ВОР, РуВор), солей 0Г\ ГЛ /% бензотріазоліл-г\І,М,М,г\Г-тетраметилуронію (HBTU), солей O-a3a6eH3OTpia3onin-N,N,N',N'тетраметилуронію (HATU), діетилфосфорилціаніду (DEPCN), 2,5-дифеніл-2,3-дипдро-3-оксо-4пдрокситюфену дюксиду (реагент Штегліха, HOTDO) та 1,1-карбонілдммідазолу (CDI) Реагенти для проведення реакції сполучення можуть застосовуватись самі або у сполученні з домішками, Ці приклади ілюструють, але не обмежують такими як г\І,г\І-диметил-4-амінопіридин (DMAP), Nобсяг даного винаходу пдроксибензотриазол (HOBt), NПептиди формули І складаються із Lпдроксибензотриазин (HOOBt), азабензотриазол амінокислот, але F може також бути D(HOAt), N-пдроксисукцинімід (HOSu) або 2амінокислотою пдроксипіридин Нові сполуки можуть також бути одержані у виЯкщо при ферментативному синтезі пептидів гляді солей з фізіологічне прийнятними кислотами, звичайно можна обійтись без захисних груп, то при такими як хлористоводнева кислота, лимонна хімічному синтезі для обох реагентів потрібен обокислота, ротний захист реакційноздатних груп, які не беруть винна кислота, молочна кислота, фосфорна участі в утворенні амідного зв'язку При хімічному кислота, метансульфонова кислота, оцтова кислосинтезі пептидів перевага надається трьом метота, мурашина кислота, малеїнова кислота, фумадам введення захисних груп це методи введення рова кислота, яблучна кислота, бурштинова кисбензилоксикарбонільної (Z), т-бутоксикарбонільної лота, малонова кислота, сірчана кислота, L(Вос) та 9-флуоренілметоксикарбонільноі (Fmoc) глутамшова кислота, L-аспарапнова кислота, пірогруп У кожному випадку це стосується захисної виноградна кислота, слизова кислота, бензойна групи на альфа-амшогрупі фрагмента, що приєдкислота, глюкуронова кислота, щавлева кислота, нується до ланцюга Детальний огляд захисних аскорбінова кислота та ацетил гліцин груп для амінокислот наведено у Mueller, Нові сполуки можуть бути одержані методами, Methoden der orgamschen Chemie, Vol XV/1, pp 20відомими у хімії пептидів Так, пептиди можуть 906, Thieme Verlag, Stuttgart, 1974 Реакція сполубути зібрані шляхом послідовного приєднання амічення фрагментів, що використовуються для нокислот або шляхом з'єднання придатних малих складання пептидного ланцюга, може бути провефрагментів пептидів При послідовному складанні дена у розчині, у суспензії, або за методом, подібпептидний ланцюг поступово подовжується, починим до того, що було описано Mernfield у J Amer наючи з С-кінця, по одній амінокислоті за раз При Chem Soc, 85 з'єднанні фрагментів можна зв'язувати фрагменти різної довжини, а самі фрагменти у свою чергу (1963) 2149 Особлива перевага надається можуть бути одержані шляхом послідовного скламетодам, за якими сполучення пептидів проводання амінокислот чи також з'єднанням фрагмендиться послідовно або шляхом з'єднання фрагметів нтів з використанням методів введення захисних груп Z, Вос або Fmoc Згідно із зазначеною метоЯк при послідовному складанні, так і при з'єддикою Мерифілда один із реагентів іммобілізуєтьнанні фрагментів блоки треба зв'язувати шляхом ся на нерозчинній полімерній основі (яка далі наутворення амідного зв'язку Придатними для цього зивається також смолою) Типово це призводить до методами є ферментативні та ХІМІЧНІ послідовного складання пептиду на полімерній ХІМІЧНІ методи утворення амідного зв'язку деоснові з використанням методики захисних груп тально описані у Mueller, Methoden der orgamschen Вос або Fmoc, причому пептидний ланцюг, що Chemie, VolXV/2, pp 1-364, Thieme Verlag, подовжується, є ковалентне зв'язаним на КІНЦІ С з Stuttgart, 1974, Stewart, Young, Solid Phase Peptide нерозчинними частинками смоли (див Фіг 1 та 2) Synthesis, pp 31-34,71-82, Pierce Chemical Цей метод дозволяє вилучати реагенти та побіжні Company, Rockford, 1984, Bodanszky, Klausner, продукти фільтруванням і, таким чином, перекрисOndetti, Peptide Synthesis, pp 85-128, John Wiley & талізація проміжних продуктів не потрібна Sons, New York, 1976, та інших стандартних роботах по хімії пептидів Особлива перевага надаєтьЗахищені амінокислоти можуть бути зв'язані з ся азидному методу, методу симетричних та змібудь-якими придатними полімерами, які мають шаних ангідридів, методу синтезуємих in situ або лише бути нерозчинними у розчинниках, що викопопередньо синтезованих ефірів, використанню ристовуються, та мати стабільну фізичну форму, захищених уретановою групою М-карбоксияка забезпечує зручність фільтрування Полімер анпдридів амінокислот та утворенню амідного повинен мати функціональну групу, до якої перша зв'язку за допомогою реагентів/активаторів для захищена амінокислота може бути міцно приєднапроведення реакції сполучення, особливо дицикна шляхом утворення ковалентного зв'язку Різнологексилкарбодиміду (DCC), дмзопропілкарбодиміманітні полімери є придатними для застосування з ду (DIG), 1-етоксикарбоніл-2-етокси-1,2цією метою, наприклад, целюлоза, ПОЛІВІНІЛОВИЙ спирт, поліметакрилат, сульфонований полістидипдрохшоліну (EEDQ), 1-етил-3-(3рол, хлорметилований співполімер стиродиметиламшопропіл)карбодмміду пдрохлориду МН-СН2-(5-метил)-тієніл(2), -NH-(2метил)тіадіазоліл(5), -NH-(2циклопропіл)тіадіазоліл(5), або К позначає 11 46775 12 лу/дившілбензолу (смола Мерифілда), 4ристані для інгібування або іншого лікування щільметилбензпдриламшова смола (МВНА-смола), них пухлин (наприклад, пухлин легенів, грудної фенілацетамідометильна смола (Рат-смола), залози, товстої кишки, простати, сечового міхура, смола п-бензилоксибензилового спирту, бензпдпрямої кишки, або ендометріальних пухлин) або риламшова смола (ВНА-смола), 4-(пдроксиметил)гематологічних злоякісних утворень (наприклад, бензоілоксиметильна смола, смола за Breipohl та лейкемії, лімфоми) шляхом введення сполуки ссаш , (Tetrahedron Letters 28 (1987) 565, надана фірвцю мою ВАСНЕМ), 4-(2,4Особливою перевагою нових сполук є те, що диметоксифеніламшометил)-фенокси-смола (навони мають більшу СТІЙКІСТЬ проти ферментативдана фірмою Novabiochem) або о-хлоротритильна ного розкладу, ніж Доластатин-15 смола (надана фірмою Biohehas) Введення може бути здійснено будь-яким Для синтезу пептидів у розчині придатні усі шляхом, який є звичайним для фармацевтичних, розчинники, що є інертними за умов проведення бажано онкологічних, агентів, включаючи перорареакції, особливо вода, N.N-диметилформамід льні та парентеральні шляхи, такі як підшкірний, (ДМФ, DMF), д и мети л сульфоксид (ДМСО, DMSO), внутрішньовенний, внутрішньо м'язовий та внутріацетонітрил, дихлорметан (ДХМ, DCM), 1,4шньочеревний дюксан, тетрапдрофуран ЛТФ, THF), М-метил-2Сполуки можуть бути введені самі або у формі піролідон (НМП, NMP), та суміші зазначених розфармацевтичних композицій, що містять сполуку чинників Синтез пептидів на полімерній основі формули І разом з фармацевтичне прийнятним може бути проведений в усіх інертних розчинниках носієм, придатним для потрібного шляху введенпохідних амінокислот Але додаткова перевага ня Такі фармацевтичні композиції можуть бути надається таким розчинникам, у яких смола буде комбінованими продуктами, тобто можуть містити набухати, таким як ДМФ, ДХМ, НМП, ацетонітрил ІНШІ терапевтичне активні інгредієнти та ДМСО, та сумішам цих розчинників Після завеДоза, що вводиться ссавцю, повинна містити ршення синтезу пептид відщеплюють від полімерефективну для інгібування пухлини КІЛЬКІСТЬ актиної основи Умови, за яких можливо провести відвного інгредієнта, яка залежить від звичайних фащеплення для смол різних типів, описані у кторів, утому числі біологічної активності конкретлітературі Реакціями відщеплення, які найчастіше ної сполуки, ицо використовується, шляху використовуються, є такі з кислотним чи паладієвведення, віку, стану здоров'я та ваги тіла пацієнвим каталізатором, особливо відщеплення у рідта, природи та ступеню виявлення симптомів, пекому безводному фтористому водні, у безводній ріодичності лікування, введення інших препаратів, трифторметансульфокислоті, у розведеній чи конта бажаного ефекту Типова денна доза становить центрованій трифторооцтовій кислоті, каталізоваприблизно від 0,5 до 50міліграм на кілограм ваги не паладієм відщеплення у ТГФ чи сумішах ТГФтіла при пероральному введенні і приблизно від ДХМ у присутності слабкої основи, такої як мор0,05 до 20 при парентеральному введенні фолін, або відщеплення у суміші оцтова кислотаНові сполуки можуть бути введені у вигляді дихлорметан-трифторетанол У залежності від звичайних твердих чи рідких фармацевтичних ліобраних захисних груп, вони можуть бути зберекарських форм, наприклад, таблеток без покриття жені або також можуть бути відщеплені за умов або з (плівковим) покриттям, капсул, порошків, проведення реакції відщеплення Часткове зняття гранул, супозиторіїв чи розчинів, їх виготовлення захисту з пептиду може також бути потрібним у здійснюють у звичайний спосіб Активні сполуки разі необхідності проведення певних реакцій одепри цьому можуть перероблятись із звичайними ржання похідних Пептиди, деалкіловані з N-кінця, фармацевтичними допоміжними речовинами, таможуть бути одержані а) шляхом приєднання ВІДкими як зв'язуючедля таблеток, наповнювачі, конПОВІДНИХ N.N-діалкіламінокислот у розчині або на серванти, розпушувальні засоби для таблеток, полімерній основі, Ь) відновлювальним алкілуванрегулятори течи, пластифікатори, змочувальні ням іммобілізованого на смолі пептиду у суміші агенти, диспергуючі агенти, емульгатори, розчинТГФ/1% оцтової кислоти NaCNBbb та ВІДПОВІДНИМ ники, композиції з подовженим строком виділення, альдегідом чи кетоном, с) пдрогенуванням пептиантиоксиданти та/або газами-пропелентами (див дів у розчині у присутності альдегіду або кетону та Н Sucker та ш ( Pharmaceutische Technology, Pd/C Thieme Verlag, Stuttgart, 1978) Лікарські форми для введення, одержані таким чином, звичайно РІЗНІ описані у цьому винаході амінокислоти, містять 1-90% мас активної речовини що не трапляються у природі, можуть бути одержані із комерційних джерел або синтезовані із комерційно-доступних матеріалів з використанням методів, відомих фахівцям уданій галузі Комерційно-доступними вихідними матеріалами є азетидин-2-карбонова кислота, 3-метил-І__-пролш, 5метил-І_-пролш, і Вос- або Fmoc-захищений 3,4депдропролін (ACROS, NOVABIOCHEM, ВАСНЕМ) Цис- та транс-4-фторпролш можуть бути одержані за методом, описаним Panasik та ш (N Panasik, E S Eberhardt, A S Edison, D R Powell, RT Raines, Int J Peptide Protein Res, 44, 1994, 262-269) із гідрокси проліну Сполуки за цим винаходом можуть бути вико Наведені нижче приклади призначені для ілюстрації винаходу Протешогенні амінокислоти у прикладах скорочено позначаються з використанням відомого трибуквеного коду Інші використані скорочення Мег\/аІ = N N-диметилвалін, MeVal = N-метил валін А Загальні процедури І Пептиди, що описані у пункті 1 формули винаходу, є або синтезованими шляхом класичного синтезу у розчині з використанням стандартної Zта Вос-методики, як було описано вище, або стандартними методами твердо фазного синтезу з використанням методик введення Вос- та Fmoc 13 46775 14 ти^рифторетанолу/дихлорметану (1 1 3) перемізахисних груп шували при кімнатній температурі протягом 1 год Після ЦЬОГО смолу відокремлювали на фільтрі з а) Цикл синтезу за методикою використання відсмоктуванням та ретельно промивали відщепFmoc-захисноі групи лювальним розчином Об'єднані фільтрати концентрували під вакуумом та обробляли ефіром 1 Промивка ДМФ 1х1хв Осад твердої речовини, що утворився, вилучали 2 20% піперидину у ДМФ 1х4хв фільтруванням чи центрифугуванням, промивали 3 20% піперидину у ДМФ 1х16хв діетиловим ефіром та сушили при зниженому тис4 Промивка ДМФ 5x1 хв ку 5 Додання попередньо активованої захищеної амінокислоти (активація 1 V Очищення та характеризування пептидів еквівалентом TBTU та 5 еквівалентаОчищення здійснювали гель-хроматографією ми ОІРЕАуДМФ), (SEPHADEX G-10, G-15/10% HOAc, SEPHADEX І_Н20/МеОН) та/або хроматографією при середРеакція приєднання пептиду 1х61хв ньому тиску (стаціонарна фаза HD-SIL С-8, 20-45 6 Промивка ДМФ 3x1 хв мікрон, ЮОангстрем, рухома фаза градієнт з А = 7 Якщо ступінь перетворення непов0,1% трифторооцтова кислота/вода, В = 0,1% на, повторення реакції приєднання трифторооцтова кислота/МеОН), або препаратив(назад до 5) ною рідинною хроматографією високого тиску 8 10% оцтового ангідриду у ДМФ 1х8хв (стаціонарна фаза 9 Промивка ДМФ 3x1 хв 10 Назад до 2 Waters Delta-Pak C-18, 15мікрон, ЮОангстрем, рухома фаза градієнт з А - 0,1% трифторооцтова кислота/вода, В = 0,1% трифторооцтова кислоBOP-СІ та РуВгор використовували як реагента/МеОН) ти для приєднання амінокислот після N-метил амінокислот Час реакції ВІДПОВІДНО збільшували, Ступінь чистоти одержаних продуктів визначавключаючи ли методом аналітичної рідинної хроматографії високого тиску (стаціонарна фаза 100 2,1 MM ПОДВІЙНІ реакції приєднання При синтезі у VYDAC С-18,300ангстрем, рухома фаза градієнт розчині для цього типу реакції сполучення найбіацетонітрил-вода, буферизована 0,1% трифторольша перевага надається використанню Восоцтової кислоти, 40°С) захищеного N-карбоксіанпдриду (NCA) амінокислоти, Z-захищеного N-карбоксіанпдриду (NCA) Аналіз проводили методами мас-спектрометри амінокислоти, або півалоілхлориду, ВІДПОВІДНО, у з бомбардуванням швидкими атомами та ЯМРякості агента конденсації спектроскопм 1 Відновлювальне алкілування N-кінця 1 В Специфічні методи Вилучають захисні групи на N-КІНЦІ пептидної Приклад 1 (Амінокислотна ПОСЛІДОВНІСТЬ № 1) смоли, одержаної за методикою Ala (етапи 2-4 у Ме\/аІ-\/аІ-Ме\/аІ-Рго-і-азетидиніл-2Ala), а потім проводять реакцію з 3-кратним молякарбоксамід рним надлишком альдегіду чи кетону у суміші Проводили реакцію 0,53г Fmoc-RINK-смоли ДМФ/1% оцтової кислоти при доданні 3 еквівален(ступінь заміщення 0,46моль/г), що відповідає тів ІЧаСІЧВНз Після ПОВНОГО проходження реакції розміру порції 0,25моль, як описано у Ala, з (негативний тест Кайзера) смолу кілька разів про0,4моль кожного із мивали водою, ізопропанолом, ДМФ та дихлормеFmoc-L-a3eTHflHH-2-Kap6oHOBOi кислоти таном Fmoc-Pro-OH Відновлювальне алкілування у розчині може Fmoc-MeVal-OH бути здійснено, наприклад, шляхом проведення Fmoc-Val-OH реакції пептидів, фрагментів пептидів, або аміноFmoc-Val-OH кислот зі знятим на N-КІНЦІ захистом з ВІДПОВІДНИПроводили реакцію приєднання амінокислоти, МИ альдегідами чи кетонами з використанням наступної за N-метиламшокислотою, з викорисNaCNBH3 або водню-Pd/C танням РуВгор у якості агента приєднання, шляхом подвійного приєднання Після завершення III Доопрацювання пептидної смоли, одержаповторюваних циклів синтезу проводили зняття ної, як описано у ІЬта II захисних груп N-кінця пептидної смоли (етапи 2-4 у Пептидну смолу сушили при зменшеному тисAla), а потім реакцію з водним розчином формальку, а потім піддавали обробці сумішшю трифтородегіду, як описано у All, і сушили при зниженому оцтової кислоти (TFA) з водою (95 5) протягом 1,5 тиску Одержану смолу піддавали процедурі відгодини (Wade, Tregear, Howard Florey Fmoc щеплювання у трифторооцтовій кислоті, як описаWorkshop Manual, Melbourne 1985) Після цього но у АІІІ Сировий продукт очищали методом пресмолу відокремлювали на фільтрі та промивали паративної хроматографії середнього тиску, трифторооцтовою кислотою (TFA) та ДХМ Фільтодержуючи 5мг потрібного чистого пептиду (10рат та промивну рідину концентрували, і пептид 40% А за 10хв , 40-90% А за 200хв) Додатковий осаджували доданням діетилового ефіру Після аналіз сполуки проводили шляхом масохолодження на льодяній бані осад відокремлюспектрометри з бомбардуванням швидкими атовали на фільтрі, розводили у 30%-ній оцтовій кисмами ([М+Н]+ = 537,37) лоті та люфілізували IV При використанні о-хлортритильної смоли (поставлена фірмою Biohellas) суспензію пептидної смоли у суміші оцтової кисло Приклад 2 (Амінокислотна ПОСЛІДОВНІСТЬ № 1) Me2Val Val-MeVal-Pro-3,4депдропролілбензиламід 15 46775 16 a) Z-MeVal-Pro-OMe зниженому тиску Водну фазу екстрагували тричі етилацетатом, встановлювали рН 2 при 4 °С, і 66,25г (250моль) Z-MeVaf-OH розчиняли у екстрагували тричі етилацетатом Об'єднані орга250мл сухого дихлорметану Після додання нічні екстракти зневоднювали над сульфатом на36,41 мл (262,5моль) триетиламшу реакційну суміш трію і розчинник випарювали при зниженому тиску, охолоджували до -25°С і додавали 32,27мл одержуючи 30,6г твердої речовини білого кольору (262,5моль) півалоілхлориду Після перемішування протягом 2,5 годин до реакційної суміші додаg) Me2Val-Val-MeVal-Pro-OH вали 41,89г (250моль) Н-Рго-ОМехНСІ у 250мл N.N-диметильований тетрапептид у кислій дихлорметану, нейтралізованого 36,41 мл формі одержували із Z-захищеного тетрапептида у (262,5моль) триетиламшу при 0°С Продовжували кислій формі шляхом пдрогенування Z-захисноі перемішування протягом 2 годин при -25°С та прогрупи з послідуючим доданням до пдрогенуючої тягом ночі при кімнатній температурі Реакційну суміші водного розчину формальдегіду для одерсуміш розводили дихлорметаном і ретельно прожання потрібного продукту з майже КІЛЬКІСНИМ ВИмивали насиченим водним розчином МаНСОз(Зх), ХОДОМ водою (1х), 5% лимонною кислотою (Зх) і насичеh) Me2Val-Val-MeVal-Pro-3,4ним водним розчином NaCI Органічну фазу знедепдропролшметиловий ефір воднювали над сульфатом натрію і упарювали до 3,38г Me2Val-Val-MeVal-Pro-OH (7,27моль) і сухого залишку Залишок (91,24г) перемішували 0,925г 3,4-депдропролшметилового ефіру пдропротягом ночі з петролейним ефіром і фільтрувахлориду (7,27моль) розчиняли у 75мл сухого дихли Одержували 62,3г продукту лорметана Додавали при 4 °С 0,975мл Nметилморфоліну (8,72моль), 0,332г HOBt b) H-MeVal-Pro-OMe (2,43моль) і 1,4r EDCI (7,27моль) Після перемішу48,9г (ІЗОмоль) Z-MeVal-Pro-OMe розчиняли у вання протягом ночі при кімнатній температурі 490мл метанолу Після додання 10,9мл (ІЗОмоль) додавали дихлорметан і органічну фазу промиваконцентрованої хлористоводневої кислоти і 2,43г ли три рази насиченим розчином бікарбонату на10%паладію на деревному вугіллі реакційну трію і один раз водою Органічний шар екстрагусуміш пдрогенували Після фільтрування та упавали 5% водним розчином лимонної кислоти рювання до сухого залишку одержували 36,43г Встановлювали значення рН кислого водного шапродукту ру 8 за допомогою 1Н NaOH і екстрагували 4 рази c) Z-MeVal-Pro-OMe дихлорметаном Після зневоднювання над суль18,1г (65моль) H-MeVal-Pro-OMe, 21,6г фатом натрію і упарювання при зниженому тиску (78моль) Z-Val-N-карбоксианпдриду і 22,8мл одержували 2,82г пентапептиду метилового ефіру (ІЗОмоль) дмзопропілетиламіну перемішували у 110мл ДМФ при 40°С протягом 2 годин Після упаk) Me2Val-Val-MeVal-Pro-3,4рювання ДМФ додавали дихлорметан і органічну депдропролінбензиламід фазу промивали насиченим водним розчином Проводили реакцію розчину 2,0г депдропроліNah-ІСОз (Зх), водою (1х), 5% лимонної кислоти (Зх) ну, що містив пентапептиду метиловий ефір, у і насиченим розчином NaCI Органічну фазу зне20мл метанолу, з 4,6мл 1Н розчину LiOH при кімводнювали над сульфатом натрію і упарювали до натній температурі Після завершення реакції (косухого залишку Одержували продукт (29,3г) у винтроль методом тонкошарової хроматографії) догляді в'язкої маслянистої рідини давали воду, метанол упарювали і сполуку люфілізували із води Одержували білий порошок, d) H-Val-MeVal-Pro-OMe який розчиняли у Збмл дихлорметану і додавали 29,3г (61,6моль) Z-MeVal-Pro-OMe розчиняли у 0,388мл (3,55моль) бензиламіду Після додання 230мл метанолу Після додання 1,15г 10% паладію 0,476мл N-метилморфолшу (4,26моль), 0,163г на деревному вугіллі реакційну суміш пдрогенуваHOBt (1,19моль) та 0,684г EDCI (3,55моль) при 4 ли Після фільтрування та упарювання до сухого °С, реакційну суміш перемішували при кімнатній залишку одержували 21,96г продукту температурі протягом ночі Додавали дихлорметан є) Z-Val-Val-MeVal-Pro-OMe і органічну фазу промивали 3 рази насиченим роз15,29г (61 моль) Z-Val-OH і 21,96г (61 моль) Нчином бікарбоната натрію і один раз водою ОргаVal-MeVal-Pro-OMe розчиняли у 610мл дихлорменічний шар екстрагували ДВІЧІ 5% лимонною кистану та охолоджували до О °С Після додання лотою Значення рН кислого водного шару 8,16мл (73,2моль) М-метилморфоліну, 2,77г доводили до 9 за допомогою 5Н NaOH і екстрагу(20,3моль) HOBtTa 11,74г (61 моль) вали 4 рази дихлорметаном Після зневоднювання EDCI реакційну суміш перемішували протягом над сульфатом натрію і упарювання розчинника ночі при кімнатній температурі, розводили дихлопри зниженому тиску одержували 600мг сирого рметаном і ретельно промивали насиченим водпентапетида бензиламіда ЗООмг цього сирого ним розчином Nah-ІСОз (Зх), водою (1х), 5% липродукту піддавали подальшій очистці методом монною кислотою (Зх) і насиченим розчином NaCI рідинної хроматографії середнього тиску (0-10% А Органічну фазу зневоднювали над сульфатом за 5', 10-25% А за 10', 25-90% А за 450'), одержуюнатрію і упарювали до сухого залишку, одержуючи чи 92мг аналітично чистого продукту Сполуку до31,96г продукту датково аналізували методом мас-спектрометри з f) Z-Val-Val-MeVai-Pro-OH бомбардуванням швидкими атомами ([М+Н]+ = 31,96г (57моль) Z-Val-Val-MeVal-Pro-OMe роз639,4) чиняли у 250мл метанолу і додавали 102,6мл (102,6моль) 1М водного розчину LiOH Після пеЗгідно З прикладами 1 та 2 були одержані та ремішування при кімнатній температурі протягом можуть бути одержані такі продукти 24 годин додавали воду і метанол упарювали при 17 18 46775 3 XaaVaiXabPraXac 53 Xaa Va! Xab Pro Xbz 4 Xaa Val Xab Pro Xad 54 Xaa Vai Xab Pro Xca 5 Xaa Val Xab Pro Xae 55 Xaa Val Xab Pro Xcb 6 Xaa Val Xab Pro Xaf 58 Xaa Val Xab Pro Xcc 7 Xaa Val Xab Pro Xag 57 Xaa Val Xab Pro Xcd 8 Xaa Val Xab Pro Xab 58 Xaa Va! Xab Pro Xae 9 Xaa Val Xab Pro Xai 10 Xaa Vai Xab Pro Xak 59 Xaa Val Xab Pro Xcf 11 Xaa Val Xab Pro Xal 60 Xaa Val Xab Pro Xcg 12 Xaa Val Xab Pro Xam 61 Xaa Val Xab Pro Xch 13 Xaa Vat Xab Pro Xan 62 Xaa Val Xab Pro Xci 14 Xaa Val Xab Pro Xao 63 XaaVa!XabProXck 15 Xaa Vai Xab Pro Xap 64 Xaa Va! Xab Xcn Xco 16 Xaa Vai Xab Pro Xaq 65 Xaa Val Xab Xcn Xak 17 Xaa Vai Xab Pro Xar 66 Xaa Va! Xab Xcn Xaq 18 Xaa Val Xab Pro Xas 67 Xaa Val Xab Xcn Xar 19 Xaa Vai Xab Pro Xat 68 Xaa Val Xab Xcn Xay Xaa Val Xab Pro Xau 69 Xaa Val Xab Xcp Xak 21 Xaa Val Xab Pro Xav 70 Xaa Val Xab Xcp Xaq 22 Xaa VaS Xab Pro Xaw 71 Xaa Val Xab Xcp Xar 23 Xaa Vsl Xab Pro Xax 72 Xaa Val Xab Xcp Xay 24 Xaa Val Xab Pro Xay 73 Xaa Vai Xab Pro Xcn Xcr 25 Xaa Val Xab Pro Xaz 74 Xaa Val Xab Pro Xcn Xcs 26 Xaa Va! Xab Pro Xba 75 Xaa Vai Xab Pro Xcn Xct 27 Xaa Vai Xab Pro Xbb 76 Xaa Vaf Xab Pro Xcn Xcu 28 Xaa Val Xab Pro Xbc 77 Xaa Va! Xab Pro Xcn Xcv 29 Xbd Vai Xab Pro Xar 78 Xaa Val Xab Pro Xcq Xcr 30 Xbd Val Xab Pro Xar 79 Xaa Vai Xab Pro Xcq Xcs 31 Xaa Val Xab Pro Xcx 80 Xaa Val Xab Pro Xcq Xct 32 Xaa Val Xab Pro Xcy 81 Xaa Val Xab Pro Xcq Xcu 33 Xaa He Xab Pro Xar 82 Хза Vai Xao Pro Xcq Xcv 34 Xaa Xbh Xab Pro Xar 83 Xaa Vai Xab Pro Xcw Xcr 35 Xaa Va! Xbf Pro Xar 84 Xaa Vai Xab Pro Xcw Xcs Xaa Val Xbg Pro Xar 85 Xaa Val Xab Pro Xcw Xct 37 Xaa Va! Xab Pro Xbi 86 Xaa Vai Xab Pro Xcw Xcu 38 Xaa Val Xab Pro Xbk 37 Xaa Vai Xab Pro Xcw Xcv 39 Xaa Vai Xab Pro Xb! 88 Xaa Val Xab Pro Xcw OCH3 40 Xaa Val Xab Pro Xbm 89 Xaa Val Xab Pro Xcl Xaa Val Xab Pro Xbn 90 Xaa Val Xab Pro Xcm 42 Xaa Val Xab Pro Xbo 91 Xaa Vai Xab Pro Xcz 43 Xaa Val Xab Pro Xbp 92 Xaa Vai Xab Pro Xda 44 Xaa Vai Xab Pro Xbq 45 Xaa Vai Xab Pro Xbr 46 Xaa Val Xab Pro Xbs 47 Xaa Val Xab Pro Xbt 48 Xaa Vai Xab Pro Xbu 49 Xaa Va! Xab Pro Xbv 50 Xaa Va! Xab Pro Xbw 51 Xaa Val Xab Pro Xbx 52 Xaa Vai Xab Pro Xby 20 36 41 Приклади аналізу синтезованих нових сполук методом мас-спектрометри наведено нижче у таблиці приклад (№) 61 64 88 89 МС-аналіз з бомбардуванням швидкими атомами [Мол вага (визначена)] 627 546 552 655 19 20 46775 Таблиця Ідентифікація амінокислотних послідовностей сполук, одержаних згідно з Прикладами 1 та 2 Номер(а) спо- Номер амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ луки 1-32, 35-63, 881 92 2 33 3 34 4 64-72 5 73-87 Символи Хаа у короткому описові мають такі значення Хаа N.N-диметилвалін Xab N-метилвалш Xak: Xal: о н.с °н3с Xam: Xan: CR Хас: OH. OH 3 C Xad: Xao: н„с он3с Хае: н,с YV"' Xaq: Xaf: Н.С CH. сн Xar: Xag: Xas: Xah: 0 Xat: N—t Xai: тн с са ( 0 3 Xau: о 21 22 46775 *J£ Xav: ХЬЗс: ОН 3 С Xaw: ХЬХ: CK, Xax: GH. Xbm: CH, Xay: Xbnr Xaz: ХЬо: Xba: ХЬр: Xbb: CH, Xbc: Xbd Xbe. N.N-диметил-третбугил-гліцин Xbf N-метилізолейцин Xbg N-MeTnn-2-трет бутил-тіцин Xbh Xbq: Ы.Ы-дшетшизолейцин 2-трет бутилгліцин Xbi. Xbr: Xbs: о н3с Y^Oi, OH 3 C 23 24 46775 Xcf: Xbt: ** сн, Хсд: Xbu: Xch: Xbv: XcU Хек 3,4-дег1дропрол1н-адамантил{1)-ам1д Xbw: rj Г Xbx: гт Xby: о н3с N '~YNІ р снэ Хсп 3,4-дегідропроліи Хсо о н3с СИ, Хеш; снэ о н3с Г1 Xbz: сн. 3,4-дегідропролінамід Хер СН, Xcq 4-фторопролж н3с Xca: о н3с Хсх: сн. СНXcb: Xcs: Г7 9 -сн. Xcc: Xct о Xcd: ХСЄ; сна Xcu: Xcv: Xcw і-азетидин--2-кар6оніл н3с о 25 XCX: Xcy: XcZ: Xda: Сполуки за цим винаходом можуть бути перевірені на протиракову активність за звичайними методами, включаючи, наприклад, описані нижче методи А Метод перевірки in vitro Цитотоксичність вимірювали згідно зі стандартною методологією для ЛІНІЙ прилипаючих клітин, таких як аналіз мікро культур з використанням тетразолію (МТТ) Детальний опис цього аналізу був опублікований (Alley М С та ш , Cancer Research, 48 589-601, 1988) Культури клітин пухлини на стадії експоненціального росту, таких як клітин НТ29 карциноми прямої кишки або LX-1 пухлини легенів, використовували для одержання культур на планшетах для титрування Клітини висівали при ЩІЛЬНОСТІ 5000-20000 клітин на лунку на 96луночні планшети (на 150мкл середовища), і вирощували протягом ночі при 37°С Додавали сполуки, що аналізуються, серіями з 10-кратним розведенням від 10 4 М до 10 ° М Після ЦЬОГО КЛІТИНИ шкубували протягом 48 годин Для визначення КІЛЬКОСТІ життєздатних клітин у кожній лунці додавали барвник МТТ (50мкл розчину 3-(4,5диметилтіазол-2-іл)-2,5-дифенілтетразолій бромиду у сольовому розчині з концентрацією Змг/мл) Цю суміш шкубували при 37°С протягом 5 годин, після чого до кожної лунки додавали 50мкл 25% ДСН, рН 2 Після інкубування протягом ночі вимірювали поглинання кожної лунки при 550 нм за допомогою пристрою для проведення імуноферментного аналізу на твердих носіях (ELISA) Розраховували середні значення ± середньоквадратову помилку для даних від реплікованих лунок, використовуючи формулу для % Т/С (% життєздатних клітин після обробки/контрольний дослід) Оптична густина клітин після обробки Оптична густина контрольних клітин х 100% = % Т/С Концентрацію аналізуємої сполуки, при якій ступінь інгібування росту клітин (Т/С) становила 50%, позначали як величину ICso 46775 26 Сполука за прикладом 1 2 61 64 88 89 ІС50 [І\ 6x10 1 хЮ 2x10 2x10 4x10 6x10 В Метод перевірки in vivo Сполуки за даним винаходом було піддано додатковому аналізу шляхом проведення ДОКЛІНІчних випробувань на активність in vivo, яка є показником їх клінічної придатності Такі тести було проведено з голими мишами, яким було трансплантовано (ксенотрансплантовано) пухлинну тканину, бажано людського походження, як це відомо фахівцям у даній галузі Оцінювали протипухлинну ефективність сполук, що тестуються, після їх введення мишам-носіям ксенотрансплантатів Більш конкретно, пухлину грудної залози людини (МХ-1), яку було вирощено у голих мишей, що не мали вилочкової залози, трансплантували новим мишам-реципієнтам, використовуючи фрагменти пухлини розміром біля 50мг День трансплантування позначали як день 0 Через період від шести до десяти днів мишам, розбитим на групи по 5-10 мишей для кожної дози, вводили сполуки, що випробовувались, шляхом внутрішньовенних ІН'ЄКЦІЙ Сполуки вводили кожного другого дня протягом трьох тижнів, дозами по 1-100мг/кг ваги тіла Діаметр пухлини і вагу тіла вимірювали ДВІЧІ на тиждень Об'єм пухлин розраховували, використовуючи діаметри, визначені за допомогою штангенциркуля з ноніусом, за формулою (довжина х ширина2) 12= мм3 об'єму пухлини Для кожної групи, що одержували лікування, розраховували середній об'єм пухлин, і для кожної групи визначали значення Т/С порівняно з контрольними групами мишей з пухлинами, які не одержували лікування Нові сполуки мають добрі інгібуючі властивості по відношенню до пухлин ПЕРЕЛІК АМІНОКИСЛОТНИХ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ (2) ЗАГАЛЬНА ІНФОРМАЦІЯ (і) ЗАЯВНИК (A) BASF Aktiengesellschaft (B) ВУЛИЦЯ Can-Bosch-Strasse 38 (C) МІСТО Ludwigshafen (Е) КРАЇНА Федеративна Республіка Німеччина (F)ZIP D-67056 (G) ТЕЛЕФОН 0621/6048526 (Н) ТЕЛЕФАКС 0621/6043123 (І) ТЕЛЕКС 1762175170 (м) НАЗВА ВИНАХОДУ Нові пептиди, їх одержання та використання (їм) КІЛЬКІСТЬ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ 5 (iv) ФОРМА, ПРИДАТНА ДЛЯ КОМП'ЮТЕРНОГО ЗЧИТУВАННЯ (A) ТИП НОСІЯ Дискета, 3,5 дюйма, 2 DD (B) комп'ютер ІВМ-АТ-сумісний, процесор 80286 (C) ОПЕРАЦІЙНА СИСТЕМА MS-DOS версія 50 (D) ПРИКЛАДНА ПРОГРАМА WordPerfect 27 ІНФОРМАЦІЯ ПРО АМІНОКИСЛОТНУ ПОСЛІДОВНІСТЬ № 1 (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ (A) ДОВЖИНА 5 амінокислот (B) ТИП амінокислота (D) ТОПОЛОГІЯ лінійна (м) ТИП МОЛЕКУЛИ пептид (хі) ОПИС АМІНОКИСЛОТНОЇ ПОСЛІДОВНОСТІ ПОСЛІДОВНІСТЬ № 1 Хаа Val Xaa Pro Xaa (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО АМІНОКИСЛОТНУ ПОСЛІДОВНІСТЬ № 2 (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ (A) ДОВЖИНА 5 амінокислот (B) ТИП амінокислота (D) ТОПОЛОГІЯ лінійна (м) ТИП МОЛЕКУЛИ пептид (хі) ОПИС АМІНОКИСЛОТНОЇ ПОСЛІДОВНОСТІ ПОСЛІДОВНІСТЬ № 2 Xaa He Xaa Pro Xaa (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО АМІНОКИСЛОТНУ ПОСЛІДОВНІСТЬ № З (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ (A) ДОВЖИНА 5 амінокислот (B) ТИП амінокислота 46775 28 (D) ТОПОЛОГІЯ лінійна (м) ТИП МОЛЕКУЛИ пептид (хі) ОПИС АМІНОКИСЛОТНОЇ ПОСЛІДОВНОСТІ ПОСЛІДОВНІСТЬ № З Xaa Xaa Xaa Pro Xaa (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО АМІНОКИСЛОТНУ ПОСЛІДОВНІСТЬ № 4 (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ (A) ДОВЖИНА 5 амінокислот (B) ТИП амінокислота (D) ТОПОЛОГІЯ лінійна (м) ТИП МОЛЕКУЛИ пептид (хі) ОПИС АМІНОКИСЛОТНОЇ ПОСЛІДОВНОСТІ ПОСЛІДОВНІСТЬ № 4 Xaa Val Xaa Хаа Хаа (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО АМІНОКИСЛОТНУ ПОСЛІДОВНІСТЬ № 5 (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ (A) ДОВЖИНА 6 амінокислот (B) ТИП амінокислота ТОПОЛОГІЯ лінійна (м) ТИП МОЛЕКУЛИ пептид (хі) ОПИС АМІНОКИСЛОТНОЇ ПОСЛІДОВНОСТІ ПОСЛІДОВНІСТЬ № 5 Хаа Val Xaa Pro Xaa Хаа ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044)456-20- 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71