Установка для заморожування біологічних об’єктів та спосіб ініціації кристалоутворення в кріозахисному середовищі

1 Установка для заморожування біологічних об'єктів, що містить охолоджувану камеру у вигляді посудини Дьюара, термоблок, установлений у горловині посудини Дьюара і виконаний з можливістю розміщення у ньому термодатчика та упаковок з бюматеріалом, причому корпус термоблока виготовлений у формі циліндра з нержавіючої сталі, висота якого відноситься до висоти горловини посудини Дьюара як 1 2, яка відрізняється тим, що термоблок містить диск з отворами для розміщення упаковок з бюматеріалом та обмежувальні пластини для підтримування зазначених упаковок, причому обмежувальні пластини жорстко з'єднані з диском за допомогою стрижнів з не ржавіючої сталі, корпус термоблока виконаний з можливістю вертикального переміщення відносно диска, останній з'єднано з втулкою з різзю, нанесеною по всій довжині втулки, яка виконана порожнистою з можливістю пропущення через неї до занурення у рідкий азот стрижня для ініціації кристалоутворення у крюзахисному середовищі, всередині корпусу передбачено вертикальний ряд штирів для фіксації корпусу у певному положенні, корпус оснащений змінним дном, виконаним суцільним або перфорованим, як термодатчик використано термопару або терморезистор, закріплений на обмежувальній пластині, вихід якого через один з отворів диска з'єднаний з реєструючим пристроєм 2 Спосіб ініціації кристалоутворення у крюзахисному середовищі, що включає створення короткочасного різкого перепаду температур у певній точці упаковки з бюматеріалом, розміщеній у горловині посудини Дьюара, який відрізняється тим, що різкий перепад температур викликають парами азоту, одержаними шляхом занурення металевого стрижня у рідкий азот у посудині Дьюара (О Винахід відноситься до кріобюлопі, а саме до розробки установки для заморожування біологічних об'єктів та до способу ініціації кристалоутворення в крюзахисному середовищі Відомий пристрій для заморожування ембріонів ссавців (Ас СРСР №1659040 публ 30 06 91 Бюл №24), що складається з охолоджуючої камери у вигляді судини Дьюара, в горловині якої підвішений з можливістю вертикального переміщення на штативі контейнер з термоізоляційного матеріалу, двох термодатчиків, термореєструючого приладу, пристосування у вигляді телескопічних стрижнів, призначених для підйому та занурення контейнерів, причому внутрішній стрижень має держач з ручкою, а ЗОВНІШНІЙ стрижень одним кінцем закріплений на контейнері, пристосування для ініціації кристалізації, що має Н-подібну форму, термрізоляційні ємності, у яких розташовані пробірки з біооб'єктами Проте даний пристрій має ряд недоліків Він дозволяє проводити заморожування тільки до 30°С за фіксованої швидкості охолодження, що виключає можливість заморожування різних видів біооб'єктів Крім того, в даному пристрої використовуються як упаковки для біооб'єктів тільки пробірки Уленгута, що дає змогу заморожувати тільки один вид біооб'єктів Пристосування Нподібної форми для ініціації кристалізації не є зручним у використанні, бо гілки стрижня Нподібної форми можуть не потрапляти в отвори термоізоляційного блоку Відомий пристрій для заморожування зародків ссавців (Ас СРСР 1802700 публ 15 03 93 Бюл №10), що складається з судини Дьюара, в горловині якої жорстко закріплений фіксаторами термо о (О 60161 блок, що являє собою контейнер у вигляді циліндра з полімерною пробкою і отворами для упаковок з бюматеріалом (пластикових соломинок), кронштейну, різьбової втулки, гайок та термопари Однак, за допомогою даного пристрою можливо проводити заморожування тільки у пластикових соломинах і реалізовувати дві фіксовані швидкості охолодження, що виключає можливість вибору оптимальних режимів заморожування для інших видів біооб'єктів Завданням винаходу є створення установки для заморожування різних видів біологічних об'єктів, у якій шляхом нового конструктивного рішення термоблоку, що передбачає збільшення пропускної спроможності випарів азоту до упаковок з бюматеріалом за рахунок переміщення корпусу відносно диску та наявності змінного дна, задається швидкість охолодження упаковок в діапазоні від 0,1 до 23,3°С/хв , а при поміщенні упаковок у попередньо охолоджений до різних кінцевих температур термоблок можливо реалізувати швидкості до 176,5°С/хв Поставлене завдання вирішується таким чином, що в установці для заморожування біологічних об'єктів передбачено термоблок, який містить диск з отворами для розміщення упаковок з бюматеріалом та обмежувальні пластини для підтримування зазначених упаковок, причому обмежувальні пластини жорстко з'єднані з диском за допомогою стрижнів з неіржавіючої сталі, корпус термоблоку виконаний з можливістю вертикального переміщення відносно диску, останній з'єднано з втулкою з різьбленням, нанесеним за всією довжиною втулки, яка виконана полою з можливістю пропущення через неї до занурення у рідкий азот стрижню для ініціації кристалоутворення у крюзахисному середовищі, в середині корпусу передбачено вертикальний ряд штирів для фіксації корпусу у певному положенні, корпус оснащений змінним дном, виконаним суцільним або перфорованим, в якості термодатчика використано термопару або терморезистор, закріплений на обмежувальній пластині, вихід якого через один з отворів диску з'єднаний з реєструючим пристроєм Застосування в якості термодатчика терморезистора, що кріпиться на обмежувальній пластині, дозволяє уникнути прямого контакту термодатчика з біооб'єктом та дефіциту отворів для пробірок Уленгута Шляхом занурення термоблоку в горловину судини Дьюара за рахунок нарізної втулки отримують кінцеві температури заморожування від 0 до -150°С, занурення стрижня через термоблок у рідкий азот створює умови для ініціації кристалізації у крюзахисному середовищі в упаковках з біооб'єктом Сукупність ознак заявленого пристрою невідома з джерел інформації, що дозволяє зробити висновок про його ВІДПОВІДНІСТЬ критерію новизни Заявлений пристрій (фіг 1) для заморожування біооб'єктів містить судину Дьюара 1, на якому установлено стояк 2 та термоблок 3, який складається з диску 4 з отворами для упаковок з біооб'єктом (пробірки Уленгута 5 та пластикові соломини 6), циліндру 7 зі штирями 8 для його закріплення на диску 4 та змінного дна 9, обмежуючі пластини 10 для фіксації упаковок, стрижні 11, що жорстко з'єднують пластини 10 з диском 4, пустотіла нарізкова втулка 12, гайки 13, терморезистор 14, фіксатори 15, термопара 16 Установка працює за двома варіантами Перший варіант Упаковки 5 і 6 з біооб'єктом розміщують в отвори, розташовані в диску 4 Циліндр 7 установлюють (або його зовсім знімають) відносно диску 4 таким чином, щоб отримати необхідну швидкість охолодження (швидкість охолодження залежить від ступеня ПІДНЯТОСТІ h корпуса 7 термоблока 3 відносно диску 4), що виконується за рахунок штирів 8, а також для зміни швидкості встановлюють (або не встановлюють, залежно від обраної швидкості охолодження) змінне дно, далі термоблок 3 занурюють в горловину судини Дьюара 1 і закріплюють його на визначеній завчасно глибині L за допомогою стояка 2, що кріпиться фіксаторами 15 до судини і гайками 13 до нарізної втулки 12 По досягненні температури, при якій необхідно викликати ініціацію кристалізації в пробірках Уленгута, в кожній окремій пробірці проводять посів льоду за традиційним способом (дотиком охолодженим пінцетом до дна пробірки) або одночасно в усіх пробірках за рахунок занурення сталевого стрижня через нарізну втулку та термоблок у рідкий азот Після досягнення необхідної кінцевої температури охолодження, упаковки з бюматеріалом (пробірки Уленгута) переносять у рідкий азот Другий варіант Упаковки з біооб'єктом 5 і 6 розміщують в отвори, які розташовані в диску 4 у попередньо охолоджений термоблок Для попереднього охолодження термоблока 3 його розташовують на глибині L для досягнення необхідної кінцевої температури Розташування циліндра 7 та дна задається, як у першому способі Режим попереднього охолодження термоблока триває від 0 до 90хв що залежить від заданої швидкості охолодження Потім В охолоджений таким чином термоблок розміщують упаковки з бюматеріалом та витримують за часом, який необхідний для збезводнення біооб'єкта Ініціацію кристалоутворення проводять так, як і у першому способі Після досягнення і необхідної кінцевої температури в упаковках, їх переносять до рідкого азоту Приклад 1 На запропонованій установці за другим варіантом були заморожені 10 ембріонів великої рогатої худоби зі швидкістю охолодження 0,3°С/хв до температури -32±2°С з наступним зануренням у рідкий азот Рівень збереженості деконсервованних ембріонів склав 90%, що відповідає рівню збереженості ембріонів, отриманого після заморожування на ВІДОМІЙ установці Приклад 2 На запропонованій установці за першим варіантом зі швидкістю охолодження 30°С/хв до температури -70±1°С з наступним зануренням у рідкий азот були заморожені 89 спермодоз від 10 бугаїв Рівень збереженості деконсервованої сперми склав 35 %, що на 5% вище, ніж при заморожуванні на традиційних установках Таким чином, використання запропонованого пристрою в порівнянні з існуючими має наступні переваги збільшується діапазон швидкостей заморожування завдяки конструктивному виконанню 60161 термоблока і його попереднього охолодження безпосередньо перед самим режимом заморожування, спрощується процес крюконсервацм за рахунок можливості простого здійснення процесу ініціації кристалізації одночасно у всіх упаковках, використання різних упаковок та режимів заморожування розширює можливості заморожування різних видів біооб'єктів Відомо спосіб штучної ініціації кристалізації крюзахисного середовища (Lehn-Jensen Н , Greve Т Low temperature preservation of cattle blastocysts // Thnogenology -1978 - V 9 - №4 - P 313-319), що здійснюється за рахунок дотику охолодженого в рідкому азоті пінцета до зовнішньої стінки упаковки з біооб'єктом при температурі -6 °С Недоліком даного способу є те, що для ініціації кристалоутворення в упаковці необхідно торкатися до кожної охолодженим пінцетом Це створює незручності в роботі та приводить до збою режиму заморожування, що спричинює переохолодження біооб'єкту та його загибель Відомий спосіб ініціації кристалізації при використанні пристрою для заморожування зародків (ас № 659040 СССР, МКИ A61D 19/02/ - Заявл 20 02 89, Опубл 30 06 91, Бюл № 24 - 3 с), що має Н-подібну форму, нижні галузі якого опущені в рідкий азот, а верхні встановлені з можливістю контакту з упаковками, що містять біооб'єкт Ініціація кристалоутворення здійснюється за рахунок дотику верхніх галузів з упаковкою Недоліком даного способу є те, що не завжди здійснюється контакт галузів з упаковкою, як наслідок не влучення їх в отвори термоізоляційного блоку Завданням винаходу є створення способу ІНІціацм кристалізації позаклітинного середовища в упаковках, наприклад, пробірках Уленгута (ампулах), шляхом контакту останніх з випарами азоту Упаковки з бюматеріалом, що поміщений у крюза Комп'ютерна верстка С Волобуев хисне середовище, охолоджуються в установці для заморожування біологічних об'єктів, у якому завдяки зануренню сталевого стрижня (d=2MM) через порожнину нарізкової втулки та термоблок у рідкий азот збільшується випар азоту, що, в свою чергу, приводить до ініціації росту кристалів льоду одразу у всіх упаковках Поставлене завдання вирішується таким чином, що спосіб ініціації кристалоутворення в крюзахисному середовищі передбачає створення короткочасного різкого перебігу температур у певній точці упаковки з бюматеріалом, розміщеної у горловині судини Дьюара, причому різкий перебіг температур викликають парами азоту, одержаними шляхом занурення стрижню у рідкий азот, що містить судина Дьюара Спосіб працює таким чином При досягненні температури, при якій необхідно викликати ініціацію кристалізації, сталевий стрижень (d=2MM) занурюється через термоблок, що пасивно охолоджується в горловині судини Дьюара, у рідкий азот на 30-60 секунд Після цього стрижень виймають з азоту, а термоблок продовжує охолоджуватися Виходячи з того, що основою для посіву льоду є пари азоту, позитивний ефект досягається в результаті використання термоблока зі ступенями відкритості від 10 до 100% Приклад 1 За запропонованим способом були заморожені ембріони миші, рівень збереження яких склав 90% (п=26), тоді як у контролі шляхом торкання охолодженим пінцетом дна пробірки рівень збереження склав 88,5% (п=15) Таким чином, запропонований спосіб ініціації кристалоутворення покращує режим заморожування, бо дає можливість легко та швидко (30-60 секунд) ініціювати ріст кристалів одночасно в усіх контейнера і його можна застосовувати при заморожуванні різних видів біооб'єктів Підписано до друку 06 10 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна