Спосіб кріоконсервування еритроцитів бугая

УКРАЇНА (19) UA (11) 60437 (13) U (51) МПК A01N 1/02 (2006.01) МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ видається під відповідальність власника патенту ОПИС ДО ПАТЕНТУ НА КОРИСНУ МОДЕЛЬ (54) СПОСІБ КРІОКОНСЕРВУВАННЯ ЕРИТРОЦИТІВ БУГАЯ 1 2 (13) 60437 (11) тейнерах ЦНЇІГПК об'ємом 10мл до -196°С шляхом швидкого занурення в рідкий азот. Відігрівають на водяній бані при 42-44°С. Недоліком способу є недостатньо висока збереженість клітин (76,73±1,79%), а також те, що він може бути використаний лише у випадку швидкого заморожування [3]. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити відомий спосіб кріоконсервування еритроцитів бугая шляхом введення в кріозахисне середовище тканинного препарату, і таким чином забезпечити підвищення збереженості клітин, а також розширити можливості способу. Поставлена задача вирішується тим, що в способі кріоконсервування еритроцитів тварин шляхом заморожування в кріозахисному середовищі, що містить низькомолекулярний кріопротектор, відповідно до корисної моделі, в кріозахисне середовище додатково вводять тканинний препарат антисептик-стимулятор Дорогова, фракція 2 (АСД-2) у концентрації 15-20%. Препарат АСД-2 являє собою водний розчин органічних і неорганічних сполук, які є продуктами сухої високотемпературної перегонки тканин тварин [4]. Препарат АСД-2 широко застосовується у ветеринарії перорально або зовнішньо, як антисептик, стимулятор, речовина, що підвищує природну резистентність організму. Препарат є сумісним з широко відомими низькомолекулярними кріопротекторами (гліцерин, 1,2-пропандіол, диметілсульфоксид) і може бути використаний при різних швидкостях заморожування. UA Корисна модель належить до галузі кріобіології і може бути використана при розробці методів тривалого низькотемпературного зберігання еритроцитів тварин. Відомий спосіб кріоконсервування еритроцитів бугая, згідно з яким еритромасу заморожують у кріозахисному середовищі, що містить 3 М гліцерин, до температури -196°С шляхом занурення контейнера в рідкий азот. Відігрівають зразки на водяній бані при температурі 42-44°С [1]. Недоліком даного способу є його обмеженість. Він дозволяє отримати задовільний відсоток негемолізованих клітин (82+90%) лише при використанні швидкостей заморожування від 43 до 100°С/хв. і більше та високої концентрації гліцерину (3М). Відомий спосіб кріоконсервування еритроцитів бугая, згідно з яким еритромасу заморожують у кріозахисному середовищі ЦОЛІПК 1U, що містить: 30% гліцерину, 4% манніту, 0,7% NaCl; 0,03% Na2HPО4*12H2О, pH 7.4, до температури -196°С шляхом швидкого занурення контейнера в рідкий азот. Відігрівають на водяній бані при температурі 42-44 °С [2]. Недоліком даного способу є дуже високий відсоток загибелі клітин. Рівень гемолізу після розморожування складає 92,25±0,67%. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб кріоконсервування еритроцитів бугая, згідно з яким до еритромаси у співвідношенні 1:1 додають кріозахисне середовище, яке містить низькомолекулярний кріопротектор 10% ДМСО; 0,9% NaCl; 10мМ фосфатний буфер, рН 7,4 і заморожують одержану суспензію клітин в алюмінієвих кон U (73) ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ (57) Спосіб кріоконсервування еритроцитів бугая шляхом заморожування в кріозахисному середовищі, що містить низькомолекулярний кріопротектор, який відрізняється тим, що в кріозахисне середовище додатково вводять тканинний препарат антисептик-стимулятор Дорогова, фракція 2 в концентрації 15-20%. (19) (21) u201011938 (22) 08.10.2010 (24) 25.06.2011 (46) 25.06.2011, Бюл.№ 12, 2011 р. (72) ДЮБКО ТЕТЯНА СТАНІСЛАВІВНА, БОНДАРЕНКО ОЛЕГ БОРИСОВИЧ, ГОРЯЧА ІРИНА ПЕТРІВНА, ЗІНЧЕНКО ВАСИЛЬ ДЕМИДОВИЧ, ДЕНИСОВА ОЛЬГА МИКОЛАЇВНА, ЖЕГУНОВ ГЕННАДІЙ ФЕДОРОВИЧ 3 Завдяки використанню препарату АСД-2 у кріозахисному середовищі заявлений спосіб дозволяє підвищити збереженість клітин на 32,6±2%. Спосіб кріоконсервування еритроцитів бугая здійснюють таким чином. Кров забирають у бугая з яремної вени в 20мл шприц, що містить 0,4мл гепарину. Еритроцити відокремлюють від плазми центрифугуванням протягом 5хв. при 800g і потім ще двічі відмивають фізіологічним розчином (0,89% NaCl) шляхом центрифугування протягом 5хв. при 800g. Отриману еритромасу змішують в об'ємному співвідношенні 1:10 із кріозахисним розчином, який містить, залежно від обраної швидкості заморожування, низькомолекулярний кріопротектор ДМСО (7,5 або 12,5%), гліцерин (5%) або 1,2пропандіол (15%), виготовлений на фізіологічному розчині або 5мМ натрій-фосфатному буфері, і АСД-2 в концентрації 15-20%. Після інкубування в кріозахисному середовищі при кімнатній температурі (20-22°С) протягом 20хв. зразки об'ємом 1мл у пластикових контейнерах заморожують шляхом занурення у рідкий азот (-196°С) або в морозильній камері (-18°С), і потім зберігають при відповідній температурі. Розморожують зразки на водяній бані при 22-25°С. Відмивання еритроцитів від середовища кріоконсервування проводять у два етапи: спочатку 0,6М розчином і потім 0,15М розчином NaCl. В експериментах використовували препарати АСД-2 виробництва Новогалещинської біофабрики (м. Київ, Україна), Армавірської біофабрики (м. Армавір, Росія) або ТОВ «Ареал Медикал» (м. Москва, Росія), попередньо З рази очищений на колонці з активованим вугіллям, який мав рН 6,97,0. Необхідний показник рН одержували шляхом титрування вихідного препарату АСД-2 80%-м водним розчином лимонної кислоти. Спосіб пояснюється наступними прикладами. Приклад 1. Кріокопсервувания еритроцитів бугая з використанням швидкого заморожування, кріопротектора ДМСО і АСД-2 Кров набирали з яремної вени бугая в 20-мл шприц, що містив 0,4мл гепарину. Еритроцити відокремлювали від плазми центрифугуванням протягом 5хв. при 800g і потім ще двічі відмивали фізіологічним розчином (0,89% NaCl) шляхом центрифугування за тих же умов. Отриману еритромасу змішували в об'ємному співвідношенні 1:10 із середовищем кріоконсервування, яке містить ДМСО (12,5%), приготовлений на фізіологічному розчині, і попередньо очищений препарат АСД-2 (15%) виробництва Новогалещинської біофабрики (м. Київ, Україна), що мав рН 7,0. Після інкубації в кріозахисному середовищі при кімнатній температурі (20-22°С) протягом 20хв. зразки об'ємом 1мл у пластикових контейнерах заморожували зануренням у рідкий азот. Відігрівали зразки на водяній бані при 22-25°С. Відмивали еритроцити від кріозахисного середовища шляхом центрифугування по 5хв. при 800g у два етапи: спочатку 0,6М розчином і потім 0,15М розчином NaCl. Збереженість еритроцитів оцінювали за виходом гемоглобіну [5] шляхом вимірювання оптичної 60437 4 щільності у надосаді при 543нм і виражали у відсотках відносно 100%-но гемолізованих клітин у присутності 0,1% тритону Х-100. Гемоліз клітин одразу після розморожування і відмивання склав 4,16±0,5%. Після зберігання при -196°С протягом 1 тижня рівень гемолізу склав 8,21+0,35%. Приклад 2. Кріоконсервування еритроцитів бугая з використанням повільної швидкості заморожування, суміші кріопротекторів ДМСО і гліцерину та препарата АСД-2 Кров набирали з яремної вени бугая в 20-мл шприц, що містив 0,4мл гепарину. Еритроцити відокремлювали від плазми центрифугуванням протягом 5хв. при 800g і потім ще двічі відмивали фізіологічним розчином (0,89% NaCl) шляхом центрифугуванням за тих же умов. Отриману еритромасу змішували в об'ємному співвідношенні 1:10 із середовищем кріоконсервування, до складу якого входили: низькомолекулярні кріопротектори гліцерин (5%) і ДМСО (12,5%), приготовлені на фізіологічному розчині з доданням 5 мМ натрійфосфатного буферу, рН 7,4, та попередньо очищений препарат АСД-2 (20%) виробництва ТОВ «Ареал Медикал» (м. Москва, Росія), зі значенням рН 6,9. Після інкубування в кріозахисному середовищі при кімнатній температурі (20-22°С) протягом 20хв. зразки об'ємом 1мл у пластикових контейнерах заморожували в морозильній камері побутового холодильника «Мінськ-18» (-18°С) і зберігали при цій температурі 1 добу. Відігрівали зразки на водяній бані при 22-25°С. Відмивали клітини від середовища кріоконсервування шляхом центрифугування впродовж 5хв. при 800g у два етапи: спочатку 0,6М розчином і потім 0,15М розчином NaCl. Гемоліз клітин, визначений за методом [5], після зберігання при -18°С протягом 1 доби і розморожування склав 8,1 ±0,4%. Приклад 3. Кріоконсервування еритроцитів, бугая з використанням повільної швидкості заморожування, кріопротектора 1,2-ПД і АСД-2 Кров набирали з яремної вени бугая в 20-мл шприц, що містив 0,4мл гепарину. Еритроцити відокремлювали від плазми центрифугуванням протягом 5хв. при 800g і потім ще двічі відмивали фізіологічним розчином (0,89% NaCl) шляхом центрифугування за тих же умов. Отриману еритромасу змішували в об'ємному співвідношенні 1:10 з середовищем кріоконсервування, яке містило 1,2-пропандіол (15%), приготовлений на фізіологічному розчині з доданням 5мМ натрій-фосфатного буферу, рН 7,4, і попередньо очищений препарат АСД-2 (15%) виробництва Армавірської біофабрики (м. Армавір, Росія), зі значенням рН 6,9. Після інкубації в кріозахисному середовищі при кімнатній температурі (20-22°С) протягом 20хв. зразки об'ємом 1мл у пластикових контейнерах заморожували в морозильній камері побутового холодильника «Мінськ-18»(-18°С) і зберігали при цій температурі 1 добу. Розморожували зразки на водяній лазні при 22-25°С. Відмивання еритроцитів від кріозахисного середовища проводили шляхом центрифугування у два етапи: спочатку 0,6М розчином і потім 0,15М розчином NaCl. 5 60437 Гемоліз клітин після зберігання при -18°С протягом 1 доби і розморожування, визначений за методом [5], склав 7,6±0,4%. Таким чином, запропонований спосіб кріоконсервування еритроцитів бугая дозволяє підвищити рівень збереженості еритроцитів при використанні різних низькомолекулярних кріопротекторів і різних швидкостей заморожування. Джерела інформації: 1. Mazur P., Miller R.H., Leibo S.P. Survival of frozen-thawed bovine red cells as a function of the permeation of glycerol and sucrose // Journal of Membrane Biology.-1974,-Vol. 15, №1.-P.137-158. 2. Денисова О.Н., Жегунов Г.Ф. Замораживание эритроцитов домашних животных в жидком Комп’ютерна верстка Н. Лиcенко 6 азоте до -196°С под защитой проникающих и непроникающих криопротекторов // Ветеринарная медицина. - 2006. - С.115-121. 3. Денисова О.М. Кріочутливість еритроцитів різних видів ссавців: Автореф. дис. ... канд. біол. наук. - Харків, 2006.- 20с 4. Дорогов А.В. Теоретическое обоснование и практическое применение новых лечебных препаратов АСД в медицине. Сборник. Отчет о научнопрактической работе поликлиник хозрасчетных учреждений Росгорздравотдела.- М., 1956.-С.48. 5. Клінічна лабораторна діагностика: Навч. посібник / Аксененко Л.П., Баркоган З.С., Гетте З.П. та ін.; За ред. Базарнової М.А., Гетте З.П. - К.: Вища шк., 1994.-С.186-187. Підписне Тираж 24 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601