Спосіб одержання іммобілізованого ферменту із фітазною активністю

Спосіб одержання іммобілізованого ферменту із фітазною активністю, який передбачає підготування ферменту, іммобілізацію його на носії та висушування, який відрізняється тим, що для металохелатної іммобілізації фітази використовується носій сапоніт, модифікований хлоридом феруму (III), а для стабілізації нативної молекули ферменту з міцнофіксованим кальцієм додається розчин хлориду кальцію. (19) (21) u201106009 (22) 13.05.2011 (24) 25.11.2011 (46) 25.11.2011, Бюл.№ 22, 2011 р. (72) БІТЮЦЬКИЙ ВОЛОДИМИР СЕМЕНОВИЧ, МЕРЗЛОВ СЕРГІЙ ВІТАЛІЙОВИЧ (73) БІТЮЦЬКИЙ ВОЛОДИМИР СЕМЕНОВИЧ, МЕРЗЛОВ СЕРГІЙ ВІТАЛІЙОВИЧ 3 групи кислих амінокислот, фенольні гідроксили залишків тирозину, спиртові гідроксильні групи залишків серину та треоніну, вільні сульфгідрильні групи залишків цистеїну, аміногрупи залишків лізину. Наявність у структурі ферменту кальцію забезпечує стабілізаційну конформацію під час металохелатної адсорбції. Для іммобілізованої форми характерний зсув оптимуму рН-стабільності в кислу сторону, що має практичне значення під час використання гетерогенного каталізатора як кормової добавки. Поставлена задача вирішується тим, що пропонується композитний біокаталізатор для розщеплення фітату, який включає використання ферменту фітази та твердого носія на поверхні якого іммобілізована фітаза, носієм є модифікований алюмосилікат. Спосіб роз'яснюється наступним прикладом його виконання. Приклад 1. 1. Зважують 2 г неорганічного носія (сапоніт), поміщають у колбу ємністю 50 мл. 2. Додають 15 мл 10 % (маса/об'єм) хлориду феруму (III) та витримують за температури 30 °C протягом однієї години за умови постійного струшування. 3. Видаляють залишковий розчин хлориду феруму (III). 4. Промивають активований носій дистильованою водою. 5. Висушують промитий носій протягом 24 год. за температури 100 °C, охолоджують за кімнатної температури. 6. До активованого носія додають розчин фітази, який містить 0,2-0,4 г білка в ацетатному буфері (0,1-0,2 М, рН=4,5-5,5) в присутності 0,05-1,0 М хлориду кальцію і інкубують суміш протягом 1824 год. при 4 °C, піддаючи суміш перемішуванню через кожні 3-4 год. 7. Видаляють розчин, який містить незв'язаний фермент. 8. Промивають іммобілізований фермент ацетатним буфером (0,2 М, рН=4,5) в присутності 0,05-1,0 М хлориду кальцію, а після цього буфером без хлориду кальцію. 9. Залишкову масу переносять в колби. Наступна стадія складається із висушування препарату за кімнатної температури без доступу прямого сонячного світла. Дослідженнями залежності активності фітази від рН реакціонного середовища встановлено (див. діаграму), що для іммобілізованої форми характерний зсув оптимуму рН-стабільності в кис 65115 4 лу сторону на 1,5-2,5 од. рН, що має практичне значення під час використання гетерогенного каталізатора як кормової добавки. Фермент фітазної дії, іммобілізований металохелатним методом на сапоніті зберігає більшу активність ферменту на 7,7-42,3 % відносно нативної форми ферменту фітазної дії в залежності від значень рН. Таким чином, винахід дозволяє отримати іммобілізовану фітазу на природному алюмосилікатному носії сапоніті, яка може бути використана в кормовиробництві. Широке виробниче значення запропонованого способу конструювання стабілізованого ферменту фітази очевидне, оскільки він дає можливість, використовуючи поклади вітчизняних мінералів, отримувати стійкий фермент із фітазною активністю для виробництва білково-мінеральновітамінних добавок і комбікормів для сільськогосподарських тварин та птиці. Запропонований спосіб вписується в технологію виготовлення з використанням біотехнологічних підходів біологічно активних речовин як кормових добавок до раціонів сільськогосподарських тварин та птиці. Використання запропонованого прийому має наукове та господарсько-економічне значення. Джерела інформації: 1. Копко І.Є. Фосфорні сполуки у тканинах курей за дії мікробної фітази та аліментарних чинників / І.Є. Копко. -Автореф. дисерт. на здоб. наук. ступ. канд. біол. наук. - Львів, 2005.-17 с. 2. Рекомендації щодо одержання та використання екзогенної іммобілізованої глюкоамілази у годівлі молодняку великої рогатої худоби / М.В. Зубець, В.Г. Герасименко, М.О. Герасименко та ін. - Біла Церква, 1999.-10 с. 3. Герасименко В.Г. Порівняльна характеристика біотехнологій конструювання стабілізованої фітази на сапоніті та цеолітовмісному базальтовому туфі / В.Г. Герасименко, С.В. Мерзлов, Г.В. Мерзлова // Технологія виробництва і переробки продукції тваринництва. Збірник наукових праць. Біла Церква, 2009. - Вип. 1 (67) - С. 70-73. 4. Вивчення фізико-хімічних та біохімічних властивостей фітази Ладозим проксі з метою її модифікації та підвищення ефективності використання як кормової добавки / С.В. Мерзлов, B.C. Бітюцький, О.М. Мельниченко та ін. // Технологія виробництва і переробки продукції тваринництва: 36. наук. Праць / Білоцерків. держ. аграр. ун-т. Біла Церква, 2010. - Випуск 4 (77). С.13-17. 5 Комп’ютерна верстка І. Скворцова 65115 6 Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601