Спосіб стимуляції синтезу вітаміну в12 симбіотичною мікробною популяцією у торфі

Винахід належить до галузі біотехнології, зокрема до способів підвищення вмісту вітаміну В12 у торфосировині для виготовлення кормових добавок для сільськогосподарських тварин, а саме до способів стимулювання життєдіяльності симбіотичної мікробної асоціації та здатності її до синтезу вітаміну В12 в торфосировині. Винахід може бути застосований на птахівницьких і тваринницьких підприємствах з різними формами власності, в першу чергу таких, які розташовані поблизу торфородовищ, і скерований на одержання торфосировини для кормових добавок, збагачених вітаміном В12, та препаратів для корекції обміну речовин відгодівельної сільськогосподарської птиці, підвищення ефективності відгодівлі, стійкості до захворювань, підвищення продуктивності і якості продукції. Збагачений вітаміном В12 торф'яний біосубстрат можна використовувати також для одержання водорозчинної фракції торфу з можливим наступним використанням як торфового пійла, яке містить вітамін В12, для тварин і птиці. На даному етапі розвитку біотехнології відомі способи використання мікроорганізмів для синтезу вітаміну В 12 з наступним застосуванням у медицині, ветеринарії, харчовій промисловості, годівлі сільськогосподарських тварин і птиці з метою корекції обміну речовин, підвищення імунітету, продуктивності і покращення якості продукції. Ці способи передбачають: - використання штамів мікроорганізмів-продуцентів вітаміну В 12 на спеціальних середовищах (Воробьева Л.И., Стоянова Л.Г., Алексеева М.А. Пути использования пропионовокислых бактерий // Микробные метаболиты. Под ред. проф. Д.Г. Звягинцева. - Из-во Московского университета. 1979. - С.88-102; Микробный синтез биологически активных соединений //Сбор. научн. трудов Института микробиологии АН БССР. - Минск, 1976); - використання субстратів природного походження, як середовища з різними біологічно активними сполуками, для заселення відповідними мікроорганізмами з метою одержання вітаміну В 12 (Микробные ценозы торфяных почв и их функционирование. // Под ред. акад. Мишустина Е.М. Минск: «Наука и техника», 1983. - 180с.; Наумова Г.В. Торф в биотехнологии. - Минск: «Наука и техника, 1987. - 80с.; Новинка - біоторф'яне добриво. - Вісник НААН України, 2000. - №5. - C.53); - використання біосубстратів із природною симбіотичною мікробною асоціацією для стимулювання мікробіологічних процесів в цілому за допомогою відповідних факторів для підвищення вмісту різних мікробних метаболітів, в тому числі і вітаміну В12 (Микробы и их метаболиты. - Минск: «Наука и техника», 1974. - 124с.; Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. - М.: Изд. «Мир», 1987. - С.196-242). Недоліком зазначених способів є недостатня їх ефективність. Одні з них є технологічно енергомісткі і дорогі, що понижує можливість використання способу для забезпечення потреб тварин і птиці вітаміном В 12. В інших випадках не задовольняється повністю потреба мікроорганізмів у сполуках, які забезпечують підвищений синтез вітаміну B12. Найбільш близьким по суті до способу, що заявляється, є спосіб оптимізації умов життєдіяльності мікроорганізмів торфу, які природно в ньому існують, з метою підвищення синтезу ними вітаміну В12, викладений у матеріалах дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук (Гвоздь О.О. Автореферат дисертації "Изменение содержания витаминов В 1 и B12 и аминокислот в процессе биотехнологической обработки торфа с применением сульфата натрия и их влияние на некоторые биохимические показатели и продуктивность цыплят-бройлеров". - Львов, 1992). Відомий спосіб включає інкубацію торф'яної маси протягом трьох діб при температурі 25°С, зволоженої до 60% водним розчином сульфату натрію (Na2SО4х10Н2О) у кількості 0,3% від маси торфу. Спосіб забезпечує активування мікробіологічних процесів, збільшення числа мікроорганізмів, вирощених на м'ясо-пептонному агарі (МЛА) до 687,5х103клітин/г, вмісту вітамінів В12 у торфосировині до 4,59мкг/г сирої речовини, а у водорозчинній фракції торфу до 3,15мг/л. Недоліком відомого способу є недостатня його ефективність, оскільки він не забезпечує створення оптимальних умов для симбіотичної асоціації мікроорганізмів, які є продуцентами вітаміну В12 у масі торфу в процесі інкубації, що понижує якість одержаного таким способом біосубстрату. Запропонований спосіб усуває недоліки прототипу, краще стимулює мікробіологічні процеси в торфі і в більшій мірі забезпечує збільшення мікробних клітин та підвищення вмісту вітаміну В 12 у торфосировині, зв'язку з чим В12-вітамінна цінність торфу значно зростає. В основу винаходу покладено завдання створити ефективний технологічно простий і дешевий спосіб активізації підвищення вмісту вітаміну В12 доступний для виконання на підприємствах, в установах та господарствах по відгодівлі тварин і птиці, які використовують природні субстрати як джерело біологічно активних сполук у ветеринарії та інших галузях народного господарства, в першу чергу тих, які забезпечені торфосировиною. Технічний результат досягають активуванням мікробіологічних процесів шляхом додавання до маси торфу з високим ступенем розкладання органічної речовини водними розчинами сульфату натрію в кількості 0,3% і хлориду кобальту в кількості 0,5мг/кг торфу (в перерахунку на сиру речовину), ретельним перемішуванням компонентів зволоженої торфової маси та інкубуванням при температурі 25°С протягом трьох діб. Заявлений спосіб забезпечує активування мікробіологічних процесів, внаслідок чого у масі торфу зростає вміст вітаміну В12 до 6,74мкг/г на сиру речовину, а число мікроорганізмів - до 786,6х103клітин/г. Відомо, що вітамін В12 міститься у таких природних субстратах як торф, мул, сапропель, які використовують як нетрадиційні кормові добавки в годівлі тварин і птиці, згодовування яких сприяє накопиченню цього вітаміну в організмі, що сприяє підвищенню приростів живої маси та покращенню якості отриманої продукції. Стимулювання мікроорганізмів, які є продуцентами вітаміну В12, веде до зростання його вмісту. Регуляція біосинтезу вітаміну В12 у мікроорганізмів-продуцентів вивчена недостатньо. Відомо, що їх здатність синтезувати вітамін В12 залежить від присутності у середовищі кобальту, який входить до складу цього вітаміну і є центральною частиною у структурі його молекули. При відсутності кобальту мікробіологічний синтез ціанкобаламіну припиняється. При внесенні до середовища сполук кобальту синтез вітаміну В 12 значно посилюється, що супроводиться збільшенням його вмісту. Накопичення вітаміну В12 в торфі відмічено при внесенні сполук сірки (Палфій Ф.Ю. Симбіотична мікрофлора - основа біохімічної еволюції. - Матеріали наукового читання. - Львів, 1995. - С.9-13). Зволоження торф'яної маси розчином сульфату натрію в поєднанні з хлоридом кобальту створює у масі торфу оптимальні умови для розвитку і функціонування симбіотичних мікроорганізмів, які продукують вітаміну В12. Внесення у торф’яну суміш хлориду кобальту на фоні сульфату натрію сприяє кращій активації мікробіологічних процесів, оскільки кобальт є додатковим фактором, який стимулює життєдіяльність мікроорганізмів - активних продуцентів ціанкобаламіну, і цей вітамін у більшій мірі накопичуються в торфі в процесі інкубації зі сульфатом натрію та хлоридом кобальту. При проведенні патентно-інформаційного пошуку авторами і заявником знайдено технічне рішення (Гвоздь О.О. Автореферат дисертації "Изменение содержания витаминов В1 и В12 и аминокислот в процессе биотехнологической обработки торфа с применением сульфата натрия и их влияние на некоторые биохимические показатели и продуктивность цыплят-бройлеров". - Львов, 1992), яке містить найбільшу кількість ознак, спільних із заявленим рішенням: використання торфу з високим ступенем розкладу органічної сировини для стимулювання життєдіяльності симбіотичної мікробної асоціації і збільшення вмісту біологічно активних сполук, зокрема вітаміну В12, зволоження торф'яної маси водним розчином сульфату натрію в кількості 0,3% від загальної маси торфосировини, перемішування зволоженої маси, інкубування при температурі 25°С протягом трьох діб. Але наявність зазначених ознак, спільних з прототипом, не забезпечує технічний результат, який досягається заявленим способом. Технічних рішень, які б повністю співпадали із заявленим - не виявлено. Це дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого технічного рішення критерію винаходу «новизна». У джерелах патентної і науково-технічної інформації не знайдено технічних рішень, в яких були б описані відомості про ознаки, які відрізняють заявлений спосіб від прототипу і забезпечують досягнення технічного результату (у торф'яну масу одночасно з розчином сульфату натрію вносять водний розчин хлориду кобальту в кількості 0,5-1,5мг/кг торфу-сирцю). Отже, заявлене технічне рішення не випливає явним чином з рівня техніки, що дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого способу критерію винаходу «винахідницький рівень». Винахід може бути застосований на птахівницьких і тваринницьких підприємствах з різними формами власності, в першу чергу таких, які розташовані поблизу торфородовищ, і скерований на одержання торфосировини для кормових добавок та препаратів, збагачених вітаміном В 12 та мікробним білком, для корекції обміну речовин відгодівельної сільськогосподарської птиці, підвищення ефективності відгодівлі, стійкості до захворювань, підвищення продуктивності і якості продукції. Збагачений вітаміном В12 торф'яний біосубстрат можна використовувати також для одержання водорозчинної фракції торфу з можливим наступним використанням як торф'яного пійла, яке містить вітамін В12, для тварин і птиці. Заявлений спосіб належить до галузі біотехнології, зокрема до способів стимулювання мікробіологічних процесів у біологічному середовищі з метою підвищення синтезу біологічно активних сполук - мікробних метаболітів, а саме, вітаміну В12 і тому відповідає критерію винаходу «промислова придатність». Таким чином, заявлене технічне рішення є новим, промислово придатним і має винахідницький рівень, тобто відповідає всім умовам патентоспроможності винаходу відповідно до ст.7 розділу II закону України «Про охорону прав на винаходи і корисні моделі» №1771 - III - 2000p. Заявлений спосіб збагачення торф'яної маси біологічно активними сполуками мікробного походження та мікробною масою здійснюють наступним чином: 1. Торфосировину - низинний торф природної вологості (40-45%) з високим ступенем розкладу органічної речовини (40-50%) готують у кількості, необхідній для одержання запланованої ваги біосубстрату, очищують від сторонніх предметів і нерозкладених рослинних решток, розкладають рівномірним шаром на підготовленій заздалегідь площадці і залишають на добу, після чого поміщають у відповідні резервуари, в яких буде проводитись перемішування внесених компонентів. 2. Торфосировину зволожують водним розчином сульфату натрію (Na2SО4х10Н2О) в кількості 0,3% діючої речовини з додаванням розчину хлориду кобальту (СоСl2х10H2О) в кількості 0,5-1,5мг/кг торфосировини, доводячи вологість висхідної маси до 60%, і ретельно перемішують. 3. Підготовану до інкубування торфосировину переносять у відповідний хімічний посуд (наприклад, хімічні склянки), в яких проводять інкубування, закривають їх поліетиленовою плівкою, щоб уникнути випаровування і не допускати до різкого зменшення вологості у торф'яній масі, поміщають у термостат чи сушильну шафу (нами було використано термостат "Флора"), виставляють температурний режим на рівні 25°С. 4. Інкубування при температурі 25°С здійснюють протягом трьох діб, при цьому компоненти періодично ретельно перемішують. 5. Готовий біосубстрат перевіряють на наявність біологічно активних речовин: вітаміну В12, а також підраховують кількість мікробних клітин за загально прийнятими методиками і зберігають до реалізації. Ефективність заявленого способу і його переваги перед прототипом і розрахунок граничних норм додатково внесеного компоненту - розчину хлориду кобальту підтверджені прикладами конкретного виконання способу. Приклад 1. В умовах лабораторії Науково-дослідного інституту фізіологічних основ підвищення продуктивності сільськогосподарських тварин Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького було виготовлено три партії субстрату на основі торфу за схемою, наведеною у таблиці 1. І партія - контроль - перед інкубуванням торфосировина була зволожена лише водою до 60% вологості, II партія - прототип - перед інкубуванням була зволожена розчином сульфату натрію у кількості 0,3% від загальної маси торфосировини в партії, III, IV, V партії - дослідні - після зволоження розчином сульфату натрію в кількості 0,3% від загальної маси сировини в усіх дослідних партіях в кожну з них додався розчин СоСl2х10Н2О в різних кількостях: в ІІІ-ю (мінімальна) - 0,5мг/кг торфу в IV-y (середня) - 1,0мг/кг торфу в V-y (максимальна) - 1,5мг/кг торфу від кількості торфосировини в партії. Таблиця 1. Схема виготовлення біологічно активного середовища № Елементи виготовлення І партія II партія Дослідні проби п/п 1. 2. 3. Торфо-сировина - при вологості, % Зволоження перед інкубуванням до вологості, % - водою - розчином Na2SО4 в % від маси торфу - з додаванням розчину СоСl2х10Н2О в мг/кг сирого торфу Інкубування при Т25°С тривалість, діб 40-50 40-50 III партія 40-50 IV партія 40-50 V партія 40-50 60 60 60 60 60 X 0,3 0,3 0,3 0,3 0,5 1,0 1,5 25 3 25 3 25 3 25 3 25 3 Вологість торфосировини в усіх партіях доводили до 60%. Усі партії, що виготовляли, поміщали у хімічні колби, переносили у термостат і утримували при температурі 25°С протягом трьох діб, періодично ретельно перемішуючи їх вміст. Вологість торфосировини в усіх партіях доводили до60%. У взірцях з усіх виготовлених партій визначали вміст окремих макро- і мікроелементів і вміст вітаміну В12 за загально прийнятими методиками. Результати проведених досліджень наведені в таблицях 2 і 3. Заявлений спосіб забезпечує нагромадження у складі біосубстрату мікробних клітин - 786,6клітин/г та вітаміну В12 - 6,34мкг/г натуральної речовини торфу. Таблиця 2. Вміст деяких мікро- та макроелементів та сирого протеїну у торфі до інкубації, М±m Показники, одиниці виміру n=3 Вміст елементів у сирому торфі, М±m 2,30±0,170 18,00±0,88 10,00±1,026 380,00±2,060 1,20±0,126 18,00±0,406 140,00±3,604 1,90±0,120 8,28±0,238 Na, г/кг К, г/кг Са, г/кг Fe, мг/кг Сu, мг/кг Zn, мг/Kr Мn, мг/кг Co, мг/кг Сирий протеїн, % З даних, представлених у таблиці 2, видно, що вміст кобальту у торфі становив 1,90мг/кг сирої речовини. Присутність кобальту у торфі дає можливість стимулювати мікробіологічний синтез вітаміну В12 без внесення сполук кобальту до середовища. Внесення у масу торфу хлориду кобальту в більшій мірі стимулює синтез вітаміну В12 внаслідок підвищення включення мікроорганізмами кобальту у склад цього вітаміну, про що свідчить підвищення вмісту вітаміну В12 у торфі. Таблиця 3. Якість біосубстрату на основі торфу, М±m Показники, одиниці виміру Кількість мікроорганізмів в торфі, клітин/г Вміст вітаміну В12, мкг/г сирого торфу n=3 Виготовлені партії І контроль 125,3х10 3 2,56±0,600 II прототип 678,5х10 3 4,59±0,390 Дослідні IV III 810,2х10 3 5,860±3,424* 786,6х10 3 6,34±3,386* V 828,3х103 6,10±2,630 Як видно з даних таблиці 3, вміст вітаміну В12 у торфі, який інкубували з сульфатом натрію та хлоридом кобальту, є вищий, ніж у торфі, інкубованому без кобальту. Отже, заявлений спосіб підвищення вмісту В 12 і збільшення кількості мікробних клітин методом стимулювання мікробіологічних процесів у торфі забезпечує збільшення вмісту вітаміну В12, кількості мікробних клітин шляхом активування мікрофлори торфу за допомогою зволоження та інкубування з сульфатом натрію та хлоридом кобальту протягом трьох діб при температурі 25°С.