Спосіб одержання сполуки платини (іі) з днк в розчині

Винахід відноситься до сполук платини(П) з високомолекулярною дезоксирибонуклеїновою кислотою (ДНК), що мають біологічну активність, яка виражена їх протипухлинною властивістю, та можуть бути застосовані в фармакології для одержання хіміотерапевтичних засобів лікування гематологічних захворювань. Відомий спосіб одержання протипухлинної сполуки платини(П) з високомолекулярною ДНК в розчині, який включає змішування нативної ДНК, яка виділена з селезінки великої рогатої худоби, не вміщує ушкоджених генів та характеризується молекулярною масою 7-17мДа, з водним розчином хлориду та цитрату (Cyt) натрію (цитратно-сольовим), повільне нагрівання (10С за хвилину) суміші ДНК і цитратно-сольового розчину до температури 78,0 ± 0,50С, розчинення цис-дихлородиаммінплатини (ДДП) у попередньо нагрітому до температури 78,0 ± 0,50С цитратно-сольовому розчині, змішування попередньо підготованих розчинів у таких кількостях, що мольне співвідношення ДДП, ДНК, натрію хлориду та натрію цитрату відповідає співвідношенню 6:4:30:3, з наступним термостатуванням суміші при температурі 78,0±0,5°С протягом 15-20 хвилин та її о холодженням до кімнатної температури. Одержана сполука платини(ІІ) з ДНК у розчині характеризується параметрами УФ-спектра поглинання: l max = 266,2 ± 0,1 нм та Е266,2=10000 ± 100л.моль-1см -1. [Пат.СРСР №1813089, C07F15/00, A61K31/295]. Використання у відомому способі високомолекулярної ДНК, що має природне походження, яка не вміщує ушкоджених генів та характеризується молекулярною масою 7-17мДа, дозволяє одержати сполуку платини(ІІ) з ДНК в розчині, яка ефективно пригнічує розмноження злоякісних клітин різноманітних солідних пухлин, але має порівняно невисоку цитотоксичність при дії на лейкозні клітини та не пригнічує достатньо ефективно розмноження злоякісних клітин крові людини. В основу винаходу поставлена задача розробки способу одержання сполуки платини(П) з високомолекулярною ДНК в розчині, який за рахунок застосування ДНК іншої молекулярної маси, іншого походження та вмісту ушкоджених генів філадельфійської хромосоми дозволяє одержати сполуку платини(ІІ) з ДНК в розчині, яка має підвищену цитотоксичність по відношенню до лейкозних клітин та здатна ефективно інгібувати розмноження клітин, які переродилися в злоякісні в результаті ушкодження генів організму і утворення філадельфійської хромосоми. Задача вирішується способом одержання сполуки платини(П) з високомолекулярною ДНК в розчині, який включає змішування ДНК з цитратно-сольовим розчином, повільне нагрівання (10С в хвилину) суміші ДНК і цитратно-сольового розчину до температури 78,0 ± 0,50С, розчинення цис-дихлородиаммінплатини у попередньо нагрітому до температури 78,0 ± 0,50С цитратно-сольовому розчині, змішування попередньо підготованих розчинів в таких кількостях, що мольне співвідношення ДДП, ДНК, натрію хлориду і натрію цитрату відповідає співвідношенню 6:4:30:3, з послідуючим термостатуванням суміші при температурі 78,0 ± 0,50С протягом 15-20хв. та її о холодженням до кімнатної температури, в якому, в відповідності з винаходом, використовують генно-інженерну ДНК, яка вміщує ушкоджені гени філадельфійської хромосоми і яка характеризується молекулярною масою 0,30-0,50мДа. Генно-інженерну ДНК синтезували з допомогою зворотної транскриптази M-MLV на матричній РНК, яка виділена із лейкозних клітин людини К562, ампліфікували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції та встановлювали в ній наявність гену філадельфійської хромосоми, як описано у відомих методиках [Г.Д.Телегєєв та інш. Біополімери і клітина, 2001, том 17, №4, с.298], а потім очищали з допомогою хлороформому, осаджували етанолом та висушували на повітрі згідно з [Маниатис Т. и др. Молекулярное клонирование. — М.: Мир, 1984. — с.403]. Характеристики генно-інженерної ДНК наведені в таблиці І, де вони порівнюються з характеристиками природної ДНК, виділеної із селезінки великої рогатої худоби. Таблиця 1 Характеристика Положення максимума УФ-спектра поглинання, l max нм Температура плавлення, 0С Молекулярна маса, мДа Наявність генів філадельфійської хромосоми Природна ДНК Генно-інженерна ДНК 258,0 258,0 78,0 7-17 78,0 0,30 - 0,50 не виявлені виявлені Використання генно-інженерної ДНК з характеристиками, наведеними в таблиці 1, в способі одержання сполуки платини(ІІ) описано в прикладах 1 та 2. Приклад 1. 0,100мг генно-інженерної ДНК з молекулярною масою 0,30мДа змішували з 0,075мл водного цитратно-сольового розчину, що включав 15ммоль/л NaCl+1,5ммоль/л Na3Cyt, і суміш нагрівали в термостаті до 78,00С зі швидкістю 10С за хвилину. 0,135мг ДДП розчиняли в 0,075мл попередньо нагрітого до 78,00С цитратно-сольовому розчині з тією ж концентрацією солей натрію. Розчини ДНК і ДДП змішували, суміш термостатували 15 хвилин при 78,00С, охолоджували до кімнатної температури і визначали параметри УФспектру поглинання: l max та Е. Приклад 2. 0,200мг генно-інженерної ДНК з молекулярною масою 0,50мДа змішували з 0,150мл водного цитратно-сольового розчину, суміш нагрівали в термостаті до 78,50С зі швидкістю 10С за хвилину. 0,270мг ДДП розчиняли в 0,150мл попередньо нагрітого до 78,50С цитратно-сольовому розчині. Попередньо приготовані розчини ДНК і ДДП змішували, суміш термостатували 20 хвилин при 78,50С, охолоджували до кімнатної температури і визначали параметри УФ-спектру поглинання. Умови параметрів синтезу сполуки платини з генно-інженерною ДНК в розчині і характеристики одержаної сполуки наведені в таблиці 2. Таблиця 2 Приклад №п/п 1 2 3 4 Характеристика умов синтезу Молекулярна маса, мДа 0.30 0.50 0.50 0.46 Температура синтезу, 0С 78,0 78,5 78,0 77,5 Час термос татування 15 20 20 15 Характеристика сполуки, одержаної в розчині Emax, l max , нм л. моль -1см -1 266,1 10050 266,2 10000 266,1 9980 266,3 10000 Дослідження біологічної активності сполук платини з генно-інженерною ДНК в розчині проводили на клітинах К562, які являють собою еритробластну фазу розвитку хронічної мієлоїдної лейкемії, в порівнянні з біологічною активністю сполуки платини з природною ДНК. Досліди проводили на суспендованих культурах клітин в об'ємі 20мл. Культури інкубували при 37 0С в атмосфері 5% вуглекислого газу. Середовище росту для культивованих клітин вміщувало 90% середовища RPMI 1640, 10% ембріональної телячої сироватки, 2мМ Lглутаміну, 100од/мл пеніціліну, 200мкг/мл стрептоміцину. Культуральні середовища з концентрацією 20000кл/мл обробляли сполуками платини(П) з ДНК в розчині, одержаними по відомому способу та способу, що заявляється, в дозах 10, 50 та 100нг/мл. Через 48 годин інкубації клітин в присутності сполук платини оцінювали показники, які характеризують реакцію клітин на введення сполук: цитотоксичність, яку визначали по дозі, що викликає загибель 50% клітин (3К50), кількість живих та мертвих клітин, яку підраховували в камері Горяєва, індекс виживання, який розраховували із співвідношення між кількістю живих та мертвих клпин в культурі, і відсоток клітин, які загинули, використовуючи співвідношення (NK –N0)/NK -100%, де NK і N0 кількість живих клітин в контрольній та дослідній культурах, відповідно, через 48 годин від початку експерименту. Результати проведених досліджень біологічної активності сполук платини з ДНК в розчині, одержаних по відомому способу та способу, що заявляється, наведені в таблиці 3. Таблиця 3 № досліду Введений препарат 1 контроль 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Розчин сполуки платини(ІІ) з ДНК по прототипу Розчин сполуки платини(ІІ) з ДНК по прикладу 1 Розчин сполуки платини(ІІ) з ДНК до прикладу 2 Розчин сполуки платини(ІІ) з ДНК по прикладу 3 Розчин сполуки платини (II) з ДНК по прикладу 4 Доза, нг/мл 10 50 100 10 50 100 50 100 50 100 50 100 3К50, нг/мл >100 20 20 20 20 Кількість клітин через 48 Індекс год після введення виживання препарату, 104 кл/мл живих мертвих 4,95 0,05 99,9 3,93 2,17 1,80 3,75 2,32 1,62 3.57 2,47 1,46 2,90 2,40 1,20 0,76 1,36 0,55 0,05 0,92 0,05 0,74 1,32 0,56 Відсоток клітин, які загинули 1 21 25 29 42 85 99 85 0,08 0,90 0,09 98 0,78 1,38 0,56 84 0,06 0,88 0,07 99 0,72 1,30 0,55 86 0,07 0,90 0,08 99 З даних таблиці 3 видно, що цитотоксичність сполуки платини(ІІ) з генно-інженерною ДНК, яка характеризується 3К50=20нг/мл, суттєво ви ща, ніж у сполуки платини (II) з природною ДНК, для якої 3К50>100нг/мл. Аналіз решти даних таблиці 3 показує, що в порівнянні з культурою контролю, яка індукувалася на протязі 48 годин без будь-якої обробки, в культурах клітин, оброблених сполуками платини, кількість живих клітин падає, а мертвих - зростає, суттєво зменшується індекс виживання та збільшується відсоток загиблих клітин. Проте в дослідах №№2-4, в яких досліджувалися культури клітин, оброблених сполукою платини(ІІ) з природною ДНК, кількість живих клітин перевищує кількість мертвих, індекс виживання не падає нижче 1, а при змінюванні дози від 10 до 100нг/мл, тобто в 10 разів, він зменшується від 1,80 до 1,46, тобто всього в 1,2 рази, при цьому відсоток загиблих клітин збільшується тільки від 21% до 29%. В дослідах №№5-13, де досліджувалися культури, оброблені сполукою платини(ІІ) з генно-інженерною ДНК, кількість живих клітин перевищує кількість мертвих тільки в досліді №5, де доза сполуки платини складала 10нг/мл. При збільшенні дози в 10 разів кількість живих клітин стала значно меншою, ніж мертвих, індекс виживання впав від 1,20 до 0,05, тобто зменшився більше, ніж в 20 разів, а відсоток загиблих клітин збільшився від 42 до 99. Таким чином, аналіз результатів біологічних досліджень дозволяє зробити висновок про те, що використання в способі одержання сполуки платини(ІІ) з ДНК такої ДНК, яка є продуктом генної інженерії, дозволяє створити сполуку, яка має підвищену цитотоксичність по відношенню до лейкозних клітин і здатна ефективно інгібувати їх розмноження, чого не вдається досягнути при використанні природної ДНК в відомому способі.