Спосіб діагностики helicobacter pylori та визначення його чутливості до антибіотиків

Спосіб діагностики Helicobacter pylori та визначення його чутливості до антибіотиків, що включає біопсію слизової оболонки антрального відділу шлунка під час гастродуоденоскопії або інтраопераційно, емульгування біопсійного матеріалу, посів отриманого розчину на середовище, паралельний посів для визначення чутливості до антибіотиків, подальше інкубування посівів, оцінку результатів дослідження, який відрізняється тим, що після біопсії біоптат емульгують у пробірці, що U 1 3 рійних мікророзведень в бульйоні, при якому виконують біопсію зі слизової оболонки антрального відділу шлунка під час гастродуоденоскопії або інтраопераційно, біопсійний матеріал транспортується у мікробіологічну лабораторію у тіогліколевому середовищі, у мікробіологічної лабораторії біопсійний матеріал емульгують у 0,5мл фізіологічного розчину протягом 1хв. Потім дві краплі гомогенізованого розчину наносять на поверхню селективного 10 % кров'яного агару (селективність середовища досягається додаванням антибіотика ванкоміцину). Посів проводять суцільним газоном за допомогою бактеріологічного шпателя. Паралельно проводять визначення чутливості HP до антибіотиків диско-дифузним методом або методом серійних розведень в бульйоні (згідно наказу МОЗ України №167 від 5.04.2007 "Про затвердження методичних вказівок "Визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів"). Посіви інкубують у анаеростаті з дотриманням мікроаерофільних умов і температури 37 °C протягом семи діб із щоденним спостереженням за наявністю росту HP. При отриманні росту ідентифікацію HP виконують за допомогою культурального, бактеріоскопічного та біохімічного методів (прямий уреазний, оксидазний та каталазний тести). Результати дослідження на чутливість HP до антибіотиків оцінюють у разі застосування дискодифузного методу вимірюванням зони затримки росту, а при використанні методу серійних розведень - визначенням ступеню помутніння у дослідних пробірках [5]. Однак, і даний спосіб має недоліки: у процесі виконування посіву матеріалу на середовище та розміщення паперових дисків можливий контакт мікроорганізму з атмосферним киснем, що може приводити до пригнічування росту HP та отримання псевдонегативного результату, оскільки HPмікроаерофіл, дуже чутливий до умов перебування. Спосіб потребує тривалого часу (7 діб), тому не може використовуватися як експрес-метод; для інтерпретації його результатів необхідні мікробіолог, спеціальна апаратура та реактиви. Задача, яку вирішує корисна модель, що заявляється, полягає в удосконаленні способу діагностики HP та визначення чутливості HP до антибіотиків шляхом використовування стрипованої стрічки, дослідні лунки якої заповнені антибіотиками, та використання сироваткового середовища з вмістом індикатора бромтимолового синього з метою індикації наявності метаболізму HP. Технічний результат буде полягати в покращанні результатів лікування хворих на хелікабактер-асоційовані захворювання шлунка та ДПК. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі, що включає біопсію слизової оболонки антрального відділу шлунка під час гастродуоденоскопії або інтраопераційно, емульгування біопсійного матеріалу посів отриманого розчину на середовище, паралельний посів для визначення чутливості до антибіотиків, подальше інкубування посівів, оцінку результатів дослідження, згідно з корисною моделлю, після біопсії біоптат емульгують у пробірці, що містить стерильний сироватковий бульйон, індикатор бромтимоловий синій та 67341 4 антибіотик ванкоміцин, потім отриманий емульгат інокулюють у лунки стрипованої стрічки, що містять досліджувані антибіотики у рідкій формі або у формі "насичених паперових дисків" та у лунку контролю наявності HP (не містить антибіотик), а у лунку контролю стерильності середовища (не містить антибіотик) інокулюють сироватковий бульйон з індикатором та ванкоміцином, лунки стріпу заклеюють клейкою стрічкою, після чого останній інкубують у термостаті при 37 °C протягом 24-72 годин, наявність HP визначають за зміною кольору вмісту лунки діагностики HP на синій в процесі інкубації, оцінка результатів дослідження на чутливість до антибіотиків виконують по наявності кольорової реакції у лунках, що містять антибіотик, відсутність кольорової реакції свідчить про наявність чутливості до антибіотика. Відмінними ознаками корисної моделі є те, що посів біопсійного матеріалу здійснюють у стерильний сироватковий бульйон, що містить індикатор бромтимоловий синій, та антибіотик ванкоміцин. Характерною рисою HP є те, що в процесі метаболічної активності він змінює кислотність середовища в лужний бік, для інших мікроорганізмів, що персистують на слизової оболонці шлунка, характерна зміна рН середовища у кислий бік. Саме індикатор бромтимоловий синій дозволяє визначити зміни рН середовища в лужний бік (синє забарвлення). Наявність антибіотика ванкоміцину робить середовище високо селективним, так як ванкоміцин - антибіотик широкого спектра дії, який пригнічує ріст більшості мікроорганізмів та не діє на HP [2]. Крім того, інкубування здійснюють у стрипованій стрічці, лунки якої заклеюють клейкою смужкою. Герметизація лунки останньою, дозволяє створити в ній мікроаерофільні умови без застосування газогенеруючих пакетів та не потребує застосування для інкубації анаеростату. Визначення наявності HP та його чутливості до антибіотиків здійснюється за наявності або відсутності кольорової реакції у лунках стрипу, тобто для читання результатів не потрібен мікробіолог, спеціальне обладнання та реактиви. За відомими літературними даними, такий спосіб діагностики HP та визначення його чутливості до антибіотиків невідомий. Запропонований спосіб здійснюється наступним чином. Виконують біопсію слизової оболонки антрального відділу шлунка під час гастродуоденоскопії або інтраопераційно. Біопсійний матеріал емульгують у пробірку, що містить стерильний сироватковий бульйон (рецептура згідно наказу МОЗ України №167 від 5.04.2007), індикатор бромтимоловий синій (згідно рецепту Лабінської А.С. [4]), та додатково антибіотик ванкоміцин. Піпеткою із стерильними наконечниками інокулюють по 0,01мл отриманої бактеріальної суспензії в дослідні лунки стрипованої стрічки, у які попередньо вносять досліджувані антибіотики у рідкій формі (по принципу мікророзведень в концентрації 1000,0мкл/мл і вище (розрахунок кількості антибіотика виконують за формулою: 5 маса (м г)  67341 6 об' єм розчинника (м л) * необхідна концентрац (м кг/мл) ія , активність субстанції (вміст антибіотик (мкг / мг )) у в об'ємі 0,1мл робочого розчину антибіотика. У разі застосування антибіотика у формі "насичених паперових дисків" (за принципом диско-дифузного методу) об'єм бактеріальної суспензії, що інокулюється, складає 200мкл. У лунку контролю наявності HP інокулюють 200мкл бактеріальної суспензії. У лунку контролю сироваткового бульйону з індикатором (не містить антибіотик) інокулюють 200мкл сироваткового бульйону з індикатором та ванкоміцином. Лунки стрипу заклеюють клейкою смужкою. Після чого стрип інкубують у термостаті при температурі 37 °С протягом 24-72 годин. Наявність HP визначають за зміною кольору вмісту лунки контролю наявності HP на синій в процесі інкубації. У разі відсутності зміни кольору на синій або при зміні кольору на будь-який інший результат дослідження на HP вважають негативним. Оцінку результатів дослідження на чутливість до антибіотиків виконують за наявності кольорової реакції у лунках, що містять антибіотик: відсутність кольорової реакції свідчить про чутливості мікроорганізму до антибіотика. Зміна кольору середовища на синій свідчить про стійкість HP до антибіотиків. Наявність кольорової реакції у лунці контролю сироваткового бульйону свідчить про порушення техніки виконання тесту, результат у цьому разі вважається недійсним. За період з 2004 по 2011pp. в клініці кафедри хірургії №2 НМУ запропонований спосіб було застосовано у 102 хворих на неускладнену виразкову хворобу шлунка та ДПК, також на перфоративну виразку ДПК. Для контролю ефективності запропонованого способу застосовувався спосіб прототип (бактеріологічний), в зв'язку з тим, що його чутливість та специфічність сягає 100 %. Чутливість розробленогоспособу склала 96 %, специфічність 92 %. Незважаючи на нижчу інформативність запропонованого способу по відношенню до прототипу, слід зазначити, що останній дозволяє одержати результат тільки на 7 добу, та потребує спеціального обладнання (анаеростат, газогенеруючі пакети для створення мікроаерофільних умов), що обмежує його використання. Отримання результату через 24-72 години дає можливість використовувати запропонований спосіб як експрес-метод діагностики HP та дослідження чутливості HP до антибіотиків. Чутливість та специфіч Комп’ютерна верстка Н. Лисенко ність відомих методів експрес-діагностики HP не перевищує 40 % [1]. Таким чином, застосування запропонованого способу дозволить забезпечити покращання результатів лікування хворих на хелікабактерасоційовані захворювання шлунка та ДПК за рахунок удосконалення діагностики наявності HP та визначення його чутливості до антибіотиків. Список використаної літератури: 1. Бухарин Э.М. Межбактериальные взаимодействия / Бухарин Э.М., Усвяцов Б.Я., Хрустудинова Л.М. // Журнал микробиологии, эпидемиологии, иммунобиологии.-2003. - №4. - С.3-8. 2. Ивашкин В.Т. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. / Ивашкин В.Т., Мегро Ф., Лапина Т.Л. // М.: "Триада-Х", 1999-255стр. 3. Исаева Г.Ш. Резистентность Н. Pylori к антибактериальным препаратам и методы еѐ определения / Исаева Г.Ш. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия.-2010. - Т.12. № .-57-66. 4. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований Издание 4-е, переработанное и дополненное. / Лабинская А.С. // М.: "Медицина", 1978.-394с. 5. Наказ МОЗ України №167 від 5.04.2007 "Про затвердження методичних вказівок "Визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів". 6. Циммерман Я.С. Гастродуоденальные заболевания и Helicobacter pylori-инфекция: общее обозрение проблемы / Циммерман Я.С. // Клиническая медицина, 2009. - №5. - С.9-15. 7. Meiferthemer P. Current concept in the management of Helicobacter pylori infection: the Maastricht III Consensus Report / Meiferthemer P., Megraud F., O'Morain C. et al. // Gut.-2007.-56. - P.772781 8. Montogomeri E.A., Martin D.F. Peura D.A. // Am. J. Clin. Pathol.-1988. - Vol. 90, N 5. - P.606-609. 9. Wong W.M. Lansoprazol, levofloxacin and amoxicillin triple therapy vs. quadruple therapy as second-line treatment of resistant Helicobacter pylori infection / Wong W.M., Gu Q., Chu K.M., et al. // Aliment Pharmacol. Ther.-2006. - Vol. 23. - № 3. P.421-427. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601