Спосіб виявлення контамінації медичного обладнання та інструментарію патогенними вірусами з парентеральним шляхом передачі

Винахід стосується медицини і може бути використаний для виявлення вірусів на інструментах та медичному обладнанні, які багаторазово використовують в хір ургії, гінекології, ендоскопії, відділеннях гемодіалізу та які часто виступають факторами парентеральної передачі інфекційних хвороб (вірусні гепатити, герпетична інфекція, СШД). Відомий спосіб культивування вірусів на культурі клітин. Цей спосіб є основним при вірусологічних та епідеміологічних дослідженнях ентеро", рота- та аденовірусів [1]. Однак, культивація на культурі клітин інших збудників, зокрема вірусів гепатиту В (HBV), С (HC V), Дельта (HDV), а також герпесвірусів (HSV) та вірусу імунодефіциту людини (HIV), обмежується лише науково-дослідними лабораторіями. Практичному використанню цього способу перешкоджає те, що культивації піддаються переважно адаптовані до культури лімфоїдних клітин варіанти цих вірусів, а для "диких" штамів вірусів HBV, HC V, HD V, HSV, HIV цей спосіб не може бути використаний [2]. Відомий спосіб індикації вищезгаданих вірусів шля хом виявлення їх нуклеїнових кислот за допомогою полімеразної ланцюгової реакції [3]. Такий спосіб здебільше використовується для дослідження біологічного матеріалу, отриманого від хворих (кров, слина і т.п.), де збудник персистує і розмножується. Першим і визначальним етапом полімеразної ланцюгової реакції є виділення загальної (баластної) маси нуклеїнових кислот, у якій, завдяки відповідним етапам реакції, ідентифікують нуклеїнову кислоту конкретного збудника. Проте цей спосіб не може бути придатним для виявлення контамінації медичного обладнання та інструментарію через надто малу кількість досліджуваного матеріалу, тобто недостатню кількість баластних нуклеїнових кислот, що може бути виділена і візуалізована на першому етапі традиційної полімеразної ланцюгової реакції; фактично відсутній субстрат, у якому слід шукати вірусспе-цифічну нуклеїнову кислоту певного збудника. Втрата досліджуваного матеріалу відбувається ще на етапі виділення нуклеїнових кислот. Іншою можливою причиною нестабільності результатів полімеразної ланцюгової реакції, особливо при дослідженні РНК-вмісних вірусів, є присутність у досліджуваному матеріалі хімічних речовин (наприклад гепарин), що інактивують ревертазу - фермент, необхідний для виконання цієї реакції. В основу винаходу поставлене завдання забезпечити можливість виявлення патогенних вірусів на медичному обладнанні та інструментарії. Поставлене завдання досягається тим, що у способі виявлення контамінації медичного обладнання та інструментарію патогенними вірусами з парентеральним шляхом передачі, який полягає у проведенні забору матеріалу, додаванні лізуючого розчину для лізису білкових та полісахаридних фракцій, виділенні нуклеїнових кислот, проведенні ампліфікації та оцінці результатів, згідно з винаходом, забір матеріалу проводять на баранячу плазму крові, лізуючий розчин додають на стадії забору матеріалу і виключають присутність в матеріалі інгібіторів ревертази. Забір проб здійснюється на баранячу плазму крові - речовину, яка виступає у ролі сорбенту вірусспецифічних нуклеїнових кислот і водночас не може бути контамінованою жодним з досліджуваних вірусів, оскільки ці тварини не сприйнятливі до них. При використанні баранячої плазми крові виділення нуклеїнових кислот покращується також завдяки явищу співосадження нуклеїнових кислот, що зменшує втрати досліджуваного матеріалу. Крім того, спосіб виділення передбачає додаткові заходи, що захищають від руйнування нуклеїнових кислот досліджуваних вір усів н уклеазами та запобігають інактивації ферменту ревертази - виключення з досліджуваного матеріалу інгібіторів ревертази та додавання лізуючого розчину на етапі забору проб, а не на етапі виділення нуклеїнових кислот. Завдяки принципово новому способу одержання досліджуваного матеріалу та виділення нуклеїнових кислот, стало можливим використання полімеразної ланцюгової реакції, яка до цього давала нестабільні і невідновні результати. Запропонований спосіб дозволяє виявляти віруси з об’єктів зовнішнього середовища, на яких їх кількість є меншою, ніж поріг чутливості традиційних методів (культура клітин), а також відсутні баластні нуклеїнові кислоти - субстрат, у якому можна шукати вірус специфічну нуклеїнову кислоту традиційним методом полімеразної ланцюгової реакції. Таким чином, завдяки запропонованому способу, з'явилась можливість перевіряти якість стерилізаційної обробки медичного обладнання та інструментарію і запобігати зараженню хворих під час виконання медичних маніпуляцій. Спосіб здійснюють таким чином. Мазки з об'єктів зовнішнього середовища забирають ватними тампонами, змоченими у фізіологічному розчині і занурюють у флакони з плазмою баранячої крові. Це створює умови для співосадження нуклеїнових кислот баранячої плазми та досліджуваних вірусів і дозволяє на наступних етапах працювати вже з таким об'ємом нуклеїнових кислот, що вимірюється не окремими молекулами, а стає доступним візуальному контролю. У разі, якщо матеріал забирають з об'єктів з високою активність нуклеаз (наприклад, руки медперсоналу), до баранячої плазми з досліджуваними мазками відразу додають рівний об'єм лізуючого розчину для інактивації ферментів, що р уйнують нуклеїнові кислоти. Для виявлення РНК-вмісних вірусів (HCV, HDV, HIV) необхідно виключити присутність на досліджуваних об'єктах (в тому числі у крові, що контактує з цим обладнанням), речовин-інгібіторів ревертази - ферменту, який забезпечує зворотну транскрипцію виділених нуклеїнових кислот у наступних етапах полімеразної ланцюгової реакції. Наприклад, при дослідженні діалізних машин на забрудненість вірусом гепатиту С не можна використовувати антикоагулянт гепарин, який є інгібітором ревертази. У цьому випадку для проведення гемодіалізу, хворим можна призначати інший антикоагулянт, наприклад, з групи інгібіторів серинових протеіназ - нафамостату мезілат. Може також бути використаний цитрат. Але при використанні цитрату у хворих виникають навантаження натрієм та лугом. Для їх компенсації гемодіаліз слід проводити з використанням низько натрієвого безбуферного діалізату, що не повинен містити кальцію. Протипоказом до застосування цитрату є печінкова недостатність, при якій метаболізм цитрату знижений. Коли матеріал отримано, наступним етапом є виділення нуклеїнових кислот з досліджуваних зразків. Завдяки використанню методики забору матеріалу на баранячу плазму, працюють з достатньо великою кількістю нуклеїнових кислот, маючи можливість візуально спостерігати за усіма етапами її виділення. Наступні етапи полімеразної ланцюгової реакції подібні до тих, що виконують при традиційній роботі з біологічним матеріалом. У пробірку об'ємом 1,5мл вносять 100мкл досліджуваного зразка (баранячої плазми із забраними мазками), додають 400мкл лізуючого реагенту, перемішують та інкубують 5 хвилин при 65°С. Після інкубації у пробірку додають 20мкл суспензії сорбенту. Суміш стр ушують на ротаторі 10 хвилин, додають 800мкл сольового буфер у та центрифугують 10сек. при 500g. Супернатант видаляють, зберігаючи осад. Відмивання осаду з сорбованою нуклеїновою кислотою проводять тричі. Осад підсушують 2хв. при 65°С, після чого його суспендують в 100мкл елюіруючого буфер у за допомогою вортекса та інкубують при кімнатній температурі 15хв. Суспензію центрифугують при 1200g. Супернатант, що містить нуклеїнові кислоти, переносять в пробірку для проведення ампліфікації. Наступний етап - проведення ампліфікації. Полімеразну ланцюгову реакцію проводять у 50мкл реакційної суміші. В пробірки для ампліфікації вносять реагенти, що утворюють стійку трьохфазну систему. На дно пробірки - 15мкл суміші буферу, дезокси-нуклеотид-трифосфатів, олігнуклеотидів та термостабільної ДНК-полімерази (TaqPol), друга фаза - мінеральне масло (Dmoil) 20мкл, верхня фаза 15мкл нуклеїнових кислот, виділених з досліджуваних зразків. У дві пробірки замість нуклеїнової кислоти проби вносять відповідно позитивний та негативний контролі. Проби встановлюють у блок ампліфікатора та проводять ампліфікацію в режимі послідовно зв'язаних програм. Термальний профіль програм індивідуальний для певного збудника та відповідає умовам конкретної тест-системи. Для виявлення у досліджуваних зразках нуклеїнових кислот РНК-вмісних вірусів (HCV, HDV, HIV) перед етапом ампліфікації необхідно провести реакцію зворотної транскрипції. Для цього у 10мкл реакційної суміші, яка містить буфер, зворотну транскриптазу та гексануклеотиди, вносять 10мкл виділеної з досліджуваних зразків РНК. Додають 40мкл розігрітого до 65°С дінойла. Пробірки інкубують 40 хв. при 42°С. Підвищити чутливість полімеразної ланцюгової реакції дозволяє її модифікація - "nested" PCR (nsPCR). Ампліфікація при nsPCR складається з двох етапів: 1) у пробірки з продуктом реакції зворотної транскрипції поверх дінойлу додають по 15мкл суміші буферу, дезокси-нуклеотид-трифосфатів, зовнішніх праймерів Д1 і Д2 та термостабільної ДНК-полімерази; проводять ампліфікацію першої стадії полімеразної ланцюгової реакції; 2) до реакційної суміші додають пару внутрішніх праймерів ДЗ та Д4 і знов проводять ампліфікацію. Термальні профілі - відповідно до інструкції виробника тест-системи. Детекцію нуклеїнових кислот проводять у 1,5% агарозному гелі. Облік результатів проводять на екрані УФ-трансілюмінатора при довжині хвилі 302нм. По наявності специфічного фрагменту ампліфікації роблять висновок про присутність вірусу в досліджуваному матеріалі. У пробі з пробірки з позитивним контролем візуалізується жовта смужка приблизно на відстані 5см від місця внесення проби. У пробі з пробірки з негативним контролем такої смужки не спостерігається. Про наявність нуклеїнових кислот певного збудника у досліджуваних зразках говорять у разі наявності жовтої смужки у досліджуваних пробах на одному рівні зі смужкою позитивного контролю. Приклад. Запропонований спосіб було використано для дослідження контамінації вірусом гепатиту В (HBV) апаратів для гемодіалізу "штучна нирка" та інших об'єктів у залах гемодіалізу, що стикаються з кров'ю пацієнтів. Проби забирали з наступних вузлів апаратів "штучна нирка": вхідний штуцер діалізатора вихідний штуцер діалізатора венозний кінець кров'яної системи артеріальний кінець кров'яної системи а також з таких об'єктів: робочі поверхні маніпуляційних столів руки середнього медперсоналу, що виконує підключення хворих до апарату. Кожна вищевказана проба забиралася двічі - до сеансу гемодіалізу (дезінфіковані машини) і після сеансу гемодіалізу (машини, що не піддавались дезінфекції). Оскільки мета дослідження не передбачала оцінку контамінованості кожної окремої машини, проби з ідентичних вузлів різних машин об'єднувались у спільний зразок і досліджувались методом полімеразної ланцюгової реакції у п улах. Окремі об'єкти досліджувались 2-3-кратно. Загальна кількість досліджених проб і зразків, а також частота позитивних результатів представлена у таблиці. З таблиці видно, що з 22 досліджених зразків з різних об'єктів залів гемодіалізу присутність вірусу гепатиту В (HBV) було виявлено у 6 зразках (27,3%). Загальна кількість досліджених проб, що входили до складу цих зразків - 152. Оскільки частина з них, як згадувалось вище, досліджувалась у пулах, діапазон ймовірної частоти контамінації досліджуваних об'єктів склав від 3,9% (якщо у п улі позитивним був лише 1 зразок) до 17,8% (якщо у п улі позитивними були усі зразки). Найчастіше вірус гепатиту В (HBV) вдавалось виявити на об'єктах, що не піддавались стерилізації 38,5%. В тому числі, - ви хідний штуцер діалізатора (5,3-21% досліджених проб), венозний кінець кров'яної системи (10,5-47,4% досліджених проб), робочі поверхні маніпуляційних столів (6,6-33 %). HBV-DNA було виявлено у 50% зразків змивів з рук середнього медперсоналу взятих під час підключення ними хворих до апарату "штучна нирка". Вірусну контамінацію вдалось констатува ти навіть в одному з дев'яти зразків, отриманих після стерилізаційної обробки діалізних машин, а саме - з венозного кінця кров'яної системи. Від загальної кількості досліджених проб, що забирались із стерильного обладнання, частота виявлення позитивних зразків лежить у діапазоні 1,6%-6,3%. Таблиця До стерилізації III IV V 3 1 2 19 10 10 2 0 1 І зразків 2 проб 15 зразків 0 II 3 19 1 0 1-4 2-9 0 1-5 1-5 0 33,3 5,3-21 66,6 10,547,4 0 0 50 1050 50 6,633 Всього обстежено Всього в ияв лено проб позитив них Частота зразків в ияв лення позитив них (%) проб 0 VI 2 15 1 Разом Після стерилізації II III IV 2 3 1 15 19 10 0 I 0 Всього 9 64 1 22 152 6 1-4 6-27 5-23 0 0 38,5 0 0 33,3 0 0 11,1 27,3 5,7-26 0 0 5,3-21 0 0 1,6-6,3 3,9-17,8 1-4 0 V 1 5 0 Разом 13 88 5 І 2 15 0 0 Умовні позначення стовпчиків І, II, IIІ, IV, V, VI І вхідний штуцер діалізатора II вихідний штуцер діалізатора III венозний кінець кров'яної системи IV артеріальний кінець кров'яної системи V руки середнього медперсоналу, що виконує підключення хворих до апарату VI робочі поверхні маніпуляційних столів Таким чином, встановлено, що після сеансів гемодіалізу значна частина вузлів апарату "штучна нирка" залишається контамінованою патогенними вірусами з парентеральним шляхом передачі. І тільки якісна стерилізаційна обробка дозволяє запобігти поширенню небезпечних захворювань. Однак, як видно з дослідження, формально проведена стерилізація не дозволяє бути певним щодо її якості. У цій ситуації особливого значення набуває контроль якості стерилізації медобладнання, що стає можливим при використанні описаної методики. Особливу увагу слід приділяти запобіганню контамінації патогенними вірусами рук медперсоналу, яка становить загрозу здоров'ю не тільки медичних працівників, але і пацієнтів, що ними обслуговуються. Джерела інформації: 1. Филдс Б., Найп Д. / Вирусология. - Москва: Мир, 1989. - Т. 1. – 314 с. 2. Nakajima N., Hijikata M., Yoshikura H., Shimizu Y.K. Characterization of long-term cultures of hepatitis С vims. // J. Virol., -1996, - N 70,- P. 3325-3329. 3. Randall К. Saiki, David H. Gelfand, Кату В. Mullis et all. Primer-Directed Enzymatic Amplification ofDNA with a Thermostable DNA Polymerase // Science. -1988.-vol. 239.-P.487-491.