Спосіб виділення кристалічної каротиноїдної сполуки з мікробної каротиноїдвмісної біомаси

Цей винахід належить до області каротиноїдних сполук, що продук уються мікробами. Засновки винаходу В нинішній час кристали β-каротину з високим ступенем чистоти(96% або вище) одержують за допомогою хімічного синтезу.. При одержанні з природного джерела, β-каротин більшою частиною перебуває в формі олійного екстракту(пальмове масло, масло з водоростей). Хоча кристали β-каротину можна також одержати з природних джерел, таких як овочі(наприклад, морква) або мікроорганізмів(наприклад, водорості(Dunaliella) або гриби(Blakeslea)), сучасні способи одержання відносно чистих кристалів із зазначених натуральних джерел мають важливі недоліки. Очистка кристалів β-каротину з природних джерел включає., екстракцію β-каротину з зазначеного джерела за допомогою підхожого екстрагента з подальшими можливими додатковими етапами очищення до досягнення бажаної чистоти. Екстракцію проводять за допомогою різних екстрагентів: органічних розчинників, таких як етилацетат, бутилацетат, гексан; рослинних олій або надкритичних рідин, таких як пропан, етилен, СО2. Потім, після екстракції розчинником з зазначеного природного джерела, можна безпосередньо кристалізувати βкаротин з одержаного екстракту, наприклад, шляхом випарювання розчинника. Головний недолік процедури екстракції розчинником полягає в тому, що кристали β-каротину спочатку повинні бути розчинені в розчиннику, а потім, після відділення залишку біомаси від β-каротин-вмісного розчинника, β-каротин знов має бути кристалізовано. Крім того, цілком можуть відбутися значні втрати βкаротину. Для запобігання застосуванню більших кількостей розчинника, необхідних для розчинення β-каротину, було б бажано виділити з мікробної біомаси β-каротин або будь-який інший каротиноїд безпосередньо в кристалічній формі. Цей винахід описує спосіб виділення каротиноїдної сполуки з мікробної біомаси. Спосіб відповідно до цього винаходу застосовний до мікробної біомаси, в якій каротиноїдної сполуки наявні в кристалічній формі. Згідно з способом за цим винаходом кристали каротиноїдів безпосередньо виділяються з мікробної біомаси. Важливою перевагою способу відповідно до цього винаходу є відсутність необхідності у використанні великих кількостей розчинника. Зокрема, кількість розчинника, що застосовується в способі відповідно до цього винаходу, істотно нижча, порівняно з більшою кількістю розчинника, яка необхідна для розчинення каротиноїду при застосуванні звичайної процедури екстракції розчинником. Спосіб відповідно до цього винаходу, по суті, містить стадії руйнування клітинних стінок мікробів, відділення клітинного дебрису від залишку, що містить каротиноїди, промивання мікробної біомаси або зруйнованих клітин, або каротиноїд-вмісного залишку розчинником, підхожим для вилучення ліпіду, флотування каротиноїдних кристалів у воді і, по необхідності, подальше очищення кристалів. Наступні стадії способу відповідно до цього винаходу описані більш докладно. Мікроорганізмами, що містять каротиноїди, можуть бути бактерії, дріжджі, гриби або водорості. Більш прийнятно, каротиноїд-вмісний мікроорганізм являє собою дріжджі, гриби або водорості. Ще більш прийнятно, якщо це будуть дріжджі роду Phaffia, гриб ряду Mucorales aбo водорості роду Dunaliella. Мікробну каротиноїд-вмісну біомасу одержують у будь-який підхожий спосіб вирощування в ферментері каротиноїд-продукуючих мікроорганізмів, зазначених вище. Мікробна біомаса, яку застосовують в рамках способу відповідно до цього винаходу, може бути у вигляді вологого клітинного осаду або в сухому вигляді. З міркувань економії більш прийнятно використовува ти вологий клітинний осад. Суха біомаса, наприклад, може бути у пресованій формі, як описано в W0 97/36996. Руйнування клітин можна здійснити згідно з методиками, відомими фахівцям у цій галузі. Руйн ування може бути фізичним(механічним), ферментативним і/або хімічним. Більш прийнятно руйнувати клітини в механічні способи. Наприклад, механічне руйнування можна здійснити шляхом гомогенізації мікробної біомаси в гомогенізаторі під високим тиском або з використанням кульового млину, або за допомогою ультразвуку. Хімічне руйнування може відбуватися при низьких або високих значеннях рН або при доданні розчинника, такого як октанол. Ферментативне руйнування може мати місце при дії ферменту або суміші ферментів, які розщепляють складові оболонки мікробної клітини. Для ефективного руйнування клітин вміст сухої речовини в біомасі зазвичай складає приблизно від 10 до приблизно 200г/л. Зручно, щоб ферментативний бульйон використовувався відразу після ферментації і містив суху речовину в концентрації приблизно 50г/л. Коли вихідним матеріалом є суха біомаса, зазначену біомасу змішують з достатньою кількістю води до досягнення вмісту сухої речовини від приблизно 10г/л до приблизно 200г/л, як вказано вище. Для збільшення виходу в способі виділення відповідно до цього винаходу до маси зруйнованих клітин перед будь-якими подальшими стадіями обробки може бути необов'язково доданий органічний розчинник, який не змішується з водою. Залежно від способу руйнування, що застосовується, цей розчинник додається до, під час або після руйнування клітин. Наприклад, якщо клітини руйнуються гомогенізацією, розчинник, більш прийнятно, додають після руйнування. Масло або розчинник додаються в кількості від 1% до 100% від кількості суспендованої біомаси або від маси зруйнованих клітин, більш прийнятно, від 3% до 10% від суспендованої біомаси або від маси зруйнованих клітин. Підхожими органічними розчинниками, що не змішуються з водою, є, наприклад, масло, гексан або етилацетат. До маси зруйнованих клітин, більш прийнятно, додають масло. Наприклад, підхожими маслами є рослинні олії, такі як соєва олія. Значна частина клітинного дебрису вилучається з маси зруйнованих клітин декантуванням або центрифугуванням. Більш прийнятно застосовувати центрифугування. В результаті центрифугування утворюється твердий верхній, рідкий середній і твердий нижній шар, так що верхній твердий шар, що містить кристали каротиноїду, називається також каротиноїд-вмісним залишком. На даній стадії втрати каротиноїду дуже невеликі. Твердий верхній шар з каротиноїд-вмісним залишком, який в основному складається з кристалів каротиноїду, клітинних ліпідів і залишків клітинного дебрису, необов'язково промивають один або більше разів водою для додаткового вилучення клітинного дебрису. Зазначена вода може містити сіль, наприклад, хлорид натрію. Концентрація солі може становити до 25%(за масою). Спосіб винаходу додатково включає стадію промивання підхожим розчинником для вилучення істотної частини клітинних ліпідів і, необов'язково, будь-якого масла, що додається до цієї стадії до зруйнованих клітин. Підхожим розчинником для вилучення ліпідів є розчинник, що змішується з ліпідами і з водою, в якому кристали каротиноїду мають низьку розчинність. Більш прийнятно, зазначений розчинник являє собою низькомолекулярний спирт, такий як метанол, етанол, ізопропанол, або ацетон. Ще більш прийнятно, зазначений розчинник являє собою етанол. Слід зазначити, що кількість розчинника, необхідна для вилучення ліпідів, істотно нижча, ніж кількість розчинника, необхідна для екстракції каротиноїду з мікробної біомаси. В більш прийнятному втіленні винаходу каротиноїд-вмісний залишок , одержаний після відділення клітинного дебрису, промивають зазначеним підхожим розчинником для вилучення ліпідів. Це промивання проводять шляхом перемішування каротиноїд-вмісного залишку протягом зручного часу, наприклад, приблизно 10 хвилин, з зазначеним розчинником і виділення твердого нижнього шару. Можна повторити це промивання з зазначеним розчинником один і більше разів. В іншому втіленні винаходу ліпід може вилучатись з мікробної біомаси до руйнування клітин. Ця альтернатива особливо придатна у випадку, якщо вихідний матеріал біомаси знаходиться в сухій формі. Як правило, суху біомасу суспендують у вибраному розчиннику в кількості 10 - 400г біомаси на літр розчинника. Для збільшення кількості ліпідів, що вилучаються, може застосовуватись підвищена температура, наприклад, 50°С. Оброблену таким чином біомасу відділяють від ліпід-вмісного розчинника фільтруванням або центрифугуванням. Таку обробку необов'язково повторюють. Промивання, що обговорюється в даному винаході, включає стадію суспендування або перемішування матеріалу, що промивається, в підхожій кількості вибраного розчинника і стадію декантування або центрифугування з подальшим виділенням відповідного шару. Кристали, одержані після вилучення клітинного дебрису і ліпідів, суспендують у воді, що веде до флотування каротиноїдних кристалів. Флотування кристалів покращується при пропусканні через суспензію бульбашок газу. Звичайно при циклічній процедурі пропускання газу триває, доки нижній шар значною мірою не знебарвиться. Природа використовуваного газу не має значення, і ним може бути, наприклад, повітря або азот. Слідом за даною стадією флотування кристали виділяють центрифугуванням або декантацією. У цьому випадку кристали, які знаходяться у верхньому шарі, відділені від залишкового клітинного дебрису, що знаходиться в нижньому шарі, проміжним рідким шаром. Флотування кристалів можна покращити, якщо вода, яка застосовується для суспендування неочищених кристалів, містить сіль або масло. Таким чином, вода може необов'язково містити сіль, таку як хлорид натрію, і/або рослинну олію, таку як соєва олія. Концентрація солі може становити до 25%(за масою), а масла - до 2%. Більш прийнятно, у воді, в якій суспендують кристали каротиноїдів, міститься масло. Неочищені кристали, одержані після промивання(промивань) в розчиннику і флотування кристалів, висушують або додатково очищають до бажаного ступеня чистоти. Стадії додаткової очистки можуть включати стадії додаткових промивань підхожим розчинником. Наприклад, подальшу обробку кристалів розчинником, в якому кристали каротиноїдів слабо розчиняються. Така обробка розчинником включає стадії перемішування в зазначеному розчиннику неочищених каротиноїдних кристалів протягом часу, достатнього для розчинення забруднення, фільтрування кристалів і промивання кристалів кілька разів свіжим розчинником. Зазначене перемішування можна проводити при будь-якій температурі в межах порядку 20 - 80°С. У випадку, коли перемішування проводиться при відносно підвищеній температурі, суміш перед фільтруванням кристалів краще охолодити. Дану обробку необов'язково повторюють один раз, так що при повторній обробці можна використовува ти той самий, що і в перший раз, або інші розчинники. Після заключної стадії промивання залишки розчинника випарюють. Підхожими для додаткової очистки розчинниками є ті, в яких каротиноїд має низьку розчинність, наприклад, максимум 1г/л при 25°С. Більш прийнятно, розчинник являє собою воду або органічний розчинник, рН води не є критичним фактором, хоча більш прийнятним є рН нижчий від 7. Ще більш прийнятно, рН води становить 4 - 6. Органічний розчинник, більш прийнятно, являє собою нижчий спирт або нижчий ефір цього спирту з карбоновою кислотою, в яких під нижчим розуміють від 1 до 5 вуглецевих атомів, або ацетон. Найбільш прийнятно, органічний розчинник являє собою етанол або етилацетат. Спосіб відповідно до цього винаходу має перевагу в тому, що він може застосовуватись до будь-якого мікроорганізму, в якому каротиноїд знаходиться здебільшого в кристалічній формі. Більш прийнятно, спосіб відповідно до цього винаходу здійснюють з використанням мікроорганізму, в якому вміст каротиноїду в кристалічній формі становить, принаймні, 50%, ще більш прийнятно, якщо він складає, принаймні, 60%, і найбільш прийнятно, якщо він складає, принаймні, 70%. Особливо неполярні каротиноїди знаходяться в клітині здебільшого в кристалічній формі в зв'язку з їх низькою розчинністю в клітинному середовищі. Прикладами неполярних каротиноїдів є фітоєн, який міститься, наприклад, в деяких штамах Phaffa rhodozima, або β-каротин, який наявний, наприклад у Blakeslea trispora або в Phycomyces hlakesleanus. Кристали каротиноїду, одержані з застосуванням способу відповідно до цього винаходу, мають високу чистоту і успішно використовуються в харчови х продуктах, а також у фармацевтичних і косметичних композиціях. Приклад 1 Пряме виділення кристалів β-каротину з Blakeslea trispora 2 літри ферментативного бульйону Blakeslea trispora, який містить 0,164%(за масою) β-каротину, двічі гомогенізували під тиском 800 - 1000 бар. Після центрифугування суміші верхній шар змішували з 750мл демінералізованої води. Суміш центрифугували і верхній шар знову змішували з 750мл демінералізованої води. Після центрифугування суміші верхній шар перемішували з 750мл етанолу протягом 5 хвилин. Після центрифугування верхній шар декантували. Нижній шар послідовно промивали 4 рази етанолом(як описано раніше) і перемішували з 700мл демінералізованої води(стадія 1) протягом 10 хвилин, що веде до флотування кристалів. Кристали, одержані після центрифугування, висушували під вакуумом. Приклад 2 Флотування в присутності солі або масла Замість демінералізованої води на стадії 1 додавали 25%(за масою) водний розчин хлориду натрію або воду, яка містить 1% соєвої олії. Цей прийом дає змогу одержати більш високий загальний вихід βкаротину. Приклад 3 Подальше очищення кристалів β-каротину 7г суспензії кристалів, одержаної після кінцевого центрифугування(див. приклад 1) змішували з 45мл демінералізованої води. Після центрифугування до верхнього шару додавали 300мл етанолу, перемішували і центрифугували. Верхній шар декантували, до нижнього шару додавали 300мл етанолу і перемішували. Знову декантували верхній шар, після чого нижній шар(тістоподібна маса, що містить кристали) перемішували з 20мл етилацетату при 50°С протягом 30 хвилин в атмосфері азоту. Суспензію охолоджували до 5°С протягом 30 хвилин. Кристали послідовно відфільтровували, промивали двічі 5мл етанолу при 5°С і перемішували з 20мл етанолу при 50°С протягом 30 хвилин в атмосфері азоту. Суспендію охолоджували до 20°С впродовж 30 хвилин. Кристали відфільтровували, промивали двічі 5мл етанолу і висушували під вакуумом при кімнатній температурі, що дає вихід 1,22г β-каротину з чистотою 93,9% згідно з даними ВЕРХ(92,8% транс β-каротину і 1,1% 13-цис β-каротину). Загальний вихід становив 35%.