b-фенілетиламід 2-метил-4-оксі-5-ізопропілсукцинанілової кислоти, що проявляє антиоксидантну активність

Винахід стосується нової біологічно активної сполуки, а саме - b-фенілетиламіду 2-метил-4-оксі-5ізопропілсукцинанілової кислоти формули NHCO(CH2)2 CONH(CH2 )2 HO , що проявляє антиоксидантну активність і може бути використаний у медицині, конкретно при лікуванні порушень, які виникають внаслідок підвищення перекисного окислення ліпідів. Відомо, що стерично навантажені феноли, які містять алкільні групи в ортоположенні до гідроксильної, є ефективними уловлювачами вільних радикалів і використовуються в якості стабілізаторів фотодеструкції полімерів [1]. Алкілфеноли з подібними властивостями представляють певний інтерес і як потенційні терапевтичні засоби для корекції метаболічних порушень при таких захворюваннях, як ішемічна хвороба серця, атеросклероз, діабет, в патогенезі яких суттєву роль відіграють кисневі радикали [2, 3]. Серед похідних фенолу, яким притаманні антиоксидантні властивості, в медичній практиці найбільш застосованим є a-токоферолу ацетат (вітамін Е) [4], який обрано в якості аналога за дією. Задача винаходу - одержання нової біологічно активної сполуки в ряду похідних фенолу з високою антиоксидантною активністю та низькою токсичністю. Поставлена задача вирішується тим, що запропоновано нову біологічно активну сполуку - b-фенілетиламід 2метил-4-оксі-5-ізопропілсукцинанілової кислоти формули NHCO(CH2 )2CONH(CH2)2 HO , що проявляє антиоксидантну активність. В результаті оцінки гострої токсичності b-фенілетиламіду 2-метил-4-оксі-5-ізопропілсукцинанілової кислоти за експрес-методом Прозоровського [5] встановлено, що за умов вн утрішньочеревного введення у мишей ЛД50 складає більше 8г на кг маси тіла, що за класифікацією Сидорова К. К. [6] дозволяє віднести її до гр упи практично нешкідливих речовин. Технічний результат: Розширення арсеналу низькотоксичних сполук з виразною антиоксидантною дією. Спосіб одержання b-фенілетиламіду 2-метил-4-оксі-5-ізопропілсукцинанілової кислоти подано на схемі: O NH 2. HCl + HO (1) O (2) O NHCO(CH2) 2COOH i-PrOH (C 2H5) 3N - HCl (CH 3COO )2O (3) -H 2O HO O NHCO(CH 2) 2CONH(CH2) 2 N + 2 O CH 3COO (4) (6) CH2CH 2NH2 HO (5) + (CH 2)NHCO CH 3 Приклад 1. Одержання b-фенілетиламіду 2-метил-4-оксі-5-ізопропілсукцинанілової кислоти. 2,02г (0,01моль) гідрохлориду амінотимолу (1) кип'ятять 30хв у 10мл ацетону, осад відфільтровують, додають до нього 1,05г (0,0125моль) янтарного ангідриду (2), 25мл ізопропанолу та 1,01г (1,4мл, 0,01моль) триетиламіну і кип'ятять 3,5год. Із реакційного розчину відганяють при зниженому тиску розчинник, до в'язкого залишку додають 10мл оцтового ангідриду, кип'ятять 1,5год. Після повного вилучення з реакційної маси надлишку оцтового ангідриду за допомогою вакууму кристалічний залишок перекристалізовують із суміші вода-ізопропанол, одержують імід (4) з виходом 2,17г (75%). До виділеної кількості іміду (4) додають 2,3г (0,019моль) b-фенілетиламіду (5) (співвідношення реагентів 1:2,5 відповідно), нагрівають при слабкому кип'ятінні 30хв. Одержаний в'язкий продукт розчиняють у метанолі і обережно додають до нього розбавлений розчин хлористоводневої кислоти (до рН=4¸5) до з'явлення осаду. Кремовий аморфний осад діаміду (6) відфільтровують. Вихід напівпродукту (іміду) (4) 2,17г (75%), т.пл.185-187°С; бруто-формула: C16H19NO4 ; знайдено, %: С 64,8; Н 6,2; N 4,75; розраховано, %: С 66,4; H 6,6; N 4,80. ІЧ спектр у таблетках KBr, n см -1: 2964-2872, 1788, 1760, 1708, 1220, 1200. Спектр ЯМР 1H (ДМСО-d6 , 300МГц), d м.д. (кількість протонів, мультиплетність, КССВ, Гц): 7,07 (Ar-H, 1Н, с.), 7,01 (Ar-H, 1Н, с.), 2,96 (СН, 1Н, м.), 2,83 (СН2, 2Н, с.), 2,81 (СН3, 2Н, с.), 2,30 (СН3, 3Н, с.), 2,00 (СН3СОО, 3Н, с.). Сигнали СН 3 протонів ізопропільного фрагменту перекриті сигналами розчинника. Вихід цільового продукту (діаміду) (6) 2,13г (58%), т.пл.175-178°С; бруто-формула: C22H28N2O 3; знайдено, %: С 71,9; Н 7,7; N 7,5; розраховано, %: С 71,7; H 7,6; N 7,6. ІЧ спектр у таблетках KBr, n см -1: 3268, 3092, 2960-2868, 1648. Спектр ЯМР 1Н (ДМСО-d6 , 300МГц), d м.д. (кількість протонів, мультиплетність, КССВ, Гц): 8,95 (NH, 1Н, p.c.), 8,88 (NH, 1Н, p.c.), 7,82 (ОН, 1Н, с.), 7,21 (Ar-H, 5H, м.), 6,94 (Ar-H, 1Н, с.), 6,57 (Ar-H, 1Н, с.), 2,71 (CH 2, 2Н, т.), 2,38 (СН2, 2Н, т.), 2,01 (СН3, 3Н, с.), 1,10 (СН3, 6Н, д., J=7,2). Сигнали СН протону ізопропільного фрагменту та двох СН2 гр уп перекриті сигналами розчинника. Приклад 2. Визначення антиоксидантної активності b-фенілетиламіду 2-метил-4-оксі-5-ізопропілсукцинанілової кислоти. Дослідження in vitro проводили на моделі окислення ліпопротеїнів яєчного жовтка. b-фенілетиламід 2-метил4-оксі-5-ізопропілсукцинанілової кислоти додавали до розчину ліпідів у дозах 10, 50 та 100мкМ та проводили інкубацію при 37°С. Рівень МДА (малонового діальдегіду) визначали методом спектрофотометрії, загальну антиоксиданту активність розраховували в відсотках зниження вмісту МДА порівняно з контрольною пробою [7]. Встановлено, що антиоксидантна активність b-фенілетиламіду 2-метил-4-оксі-5-ізопропілсукцинанілової кислоти підвищувалася дозозалежним чином при її використанні в діапазоні концентрацій від 10 до 100мкМ (табл.1.). Розрахована концентрація речовини, яка гальмує процеси ПОЛ на 50 % (С50), дорівнювала 60мкМ. Таблиця 1 Загальна антиоксидантна активність речовин, отримана на моделі окислення ліпопротеїнів яєчного жовтка, (X±Sx) Концентрація речовин, мкМ 10 50 100 Загальна антиоксидантна активність, % b-фенілетиламіду 2Вітамін метил-4-оксі-5Е ізопропілсукцинанілової кислоти 23,7±2,1 37,4±2,0 43,3±1,2 50,4±6,0 76,8±1,7 93,4±7,0 Антиоксидантну активність b-фенілетиламіду 2-метил-4-оксі-5-ізопропілсукцинанілової кислоти in vivo оцінювали за вмістом кінцевого продукту перекисного окислення ліпідів - МДА в печінці щурів популяції Вістар з однодобовим токсичним гепатитом [8]. Патологію відтворювали одноразовим пероральним введенням 25% масляного розчину чотирихлористого вуглецю, який є активним прооксидантом. b-фенілетиламід 2-метил-4-оксі5-ізопропілсукцинанілової кислоти застосовували перорально в дозі 50мг на кг маси тіла за 2 години до та через 2 години після введення гепатотоксину. Контрольні тварини отримували за аналогічною схемою розчинник. В якості препарату порівняння застосовували відомий антиоксидант - вітамін Е. Рівень МДА в гомогенатах печінки визначали методом спектрофотометрії через 24 години після початку експерименту. Антиоксиданту активність розраховували в відсотках зниження вмісту МДА в порівнянні з групою, що отримувала плацебо [9]. В результаті дослідження b-фенілетиламіду 2-метил-4-оксі-5-ізопропілсукцинанілової кислоти на моделі токсичного гепатиту у щурів було виявлено її здатність гальмувати ПОЛ на (60,2±7,1)%, що достеменно перевершувало фармакологічну дію вітаміну Е (табл.2.). Таблиця 2 Вміст малонового діальдегіду у гомогенатах печінки щурів з токсичним гепатитом, (X±Sx), n=10 Група тварин % зниження Вміст МДА, МДА по ммоль/г відношенню до плацебо 51,7±10,2 59,0±5,7 148,6±15,0 82,5±4,6 44,5±4,4 Інтактний контроль Плацебо Вітамін Е b-фенілетиламід 2метил-4-оксі-559,2±10,6 ізопропілсукцинанілової кислоти 60,2±7,1 Таким чином, проведені дослідження біологічної активності b-фенілетиламіду 2-метил-4-оксі-5ізопропілсукцинанілової кислоти свідчать про наявність у неї виразних антиоксидантних властивостей, що в поєднанні з низькою токсичністю обґрунтовує перспективність її застосування для корекції патологій, які обумовлені підвищеним рівнем вільних радикалів. Використана література 1. Horikoshi H., Yoshioka Т., Kawasaki Т. Annu. Rep. Sankyo Res. Lab. - 1994. -Vol. 46. - P. 1-57. 2. Пат. 5827898 US, МІЖ 6 А 61 К 31/05. Use ofbisphenolic compounds to treat type II diabetes / A. S. Khandwala, Luo Jian (US), (Shaman Pharmaceuticals, Inc., US). - №726,591; Заяв. 07.10.96; Опубл. 27.10.98. 3. Балаболкин М.И. Клебанова Е.М. Роль окислительного стресса в патогенезе осложнений диабета // Пробл. эндокринол. - 2000. - №5. - С.29-34. 4. Компендиум 2001/2002 - лекарственные препараты. / Под ред. В.Н. Коваленко, А.П. Викторова. - К.: Морион, 2001. - 1462с. 5. Прозоровский И.Б., Прозоровская М.П., Демченко В.М. Экспресс-метод определения средней эффективной дозы и ее ошибки // Фармакология и токсикология. -1978. - №4. - С. 497-502. 6. Сидоров К. К. О классификации токсичности ядов при парентеральных способах введения // Токсикология новых промышленных химических веществ / Под ред. А.А. Летавета и B.C. Саноцкого. - М.: Медицина, 1973. Вып. 13. -158с. 7. Оценка антиокислительной активности плазмы крови с применением желточных липопротеинов / Г. И. Клебанов, И. В. Бабенкова, Ю. О. Теседкин и др. // Лаб. дело. - 1985. - №2. - С. 59-62. 8. Поздняков В., Иванов H. Изменение функционального состояния у крыс при воздействии четыреххлористого углерода // Токсикология новых промышленных химических веществ. - М., 1979. - Вып. 15. С. 87-90. 9. Стальная И. Д., Гаришвили Г. Т. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы биохимии. - 1977.-№5. - С. 77-78.