Спосіб визначення сполученої активності принаймі чотирьох пар антибіотиків

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ определения сочетанной активности нескольких пар антибиотиков, согласно которому одинаковые по размеру субстраты с антибиотиков размещаются на некотором расстоянии (равном или несколько большем суммы радиусов зон задержки антибиотиков каждой пары) друг от друга на поверхности засеянной культурой микроорганизмов плотной питательной среды. При этом субстрат с одним из антибиотиков пары размещается в центре питательной среды, субстраты с другими антибиотиками, каждый из которых образует пару с центральным, - вокруг последнего. После инкубирования можно выявить характер взаимодействия зон задержки роста культуры между парами субстратов с антибиотиками. Так, если вокруг субстратов пары образуются две независимые зоны задержки роста - эффект аддитивный (нейтральный). Если наблюдается "урезывание" зон в частях, которыми они обращены друг к другу, можно говорить об антагонизме. Если зоны сливаются, образуя "мост", наблюдается синергизм, то есть сочетанная активность (1). Тем не менее данный способ из-за порядка размещения субстратов на поверхности среды не позволяет использовать принцип радиальности и автономности микробиологических реакций на отдельных секторах диффузии антибиотиков в области их сочетанного действия, благодаря которому можно выявить наличие или отсутствие эффекта сенсибилизации. Сенсибилизация - это новое понятие в учении о сочетанном действии химиотерапевтических веществ на устойчивые или слабочувствительные культуры микроорганизмов к данным химиотерапевтическим веществам, а также, когда культура микроорганизмов устойчива к одному химиотерапевтическому веществу и чувствительна к другому химиотерапевтическому веществу. При этом феномене одно химиотерапевтическое вещество сенсибилизирует культуры к действию на нее второго химиотерапевтического вещества. Сенсибилизация увеличивает активность препарата в десятки раз. Разница между синергидным действием и сенсибилизирующим действием заключается в том, что при синергидном действии оба компонента сочетания должны действовать на культуру микроорганизмов, тогда происходит взаимное усиление действия. Если один компонент не действует, то и сочетание не дает нужного эффекта. При сенсибилизации один компонент сочетания усиливает действие другого, сам оставаясь на прежнем уровне действия. В основу изобретения поставлена задача разработать способ определения сочетанной активности, который благодаря особому порядку размещения субстратов с антибиотиками на поверхности питательной среды, позволил бы наряду с сочетанной активностью определять наличие или отсутствие эффекта сенсибилизации. Поставленная задача решается тем, что в способе определения сочетанной активности по меньшей мере четырех пар антибиотиков, предусматривающем размещение одинаковых по размеру субстратов с антибиотиками на некотором расстоянии друг от друга на поверхности засеянной культурой микроорганизмов плотной питательной среды, инкубирование и выявление характера взаимодействия зон задержки роста культуры между парами субстратов с антибиотиками, по которому судят о наличии или отсутствии сочетанной активности, отличающийся тем, что субстраты с одним из антибиотиков пары размещают по S-образной линии на расстоянии один от другого, равном 1,0-1,5 диаметра субстрата, а субстраты с другими, антибиотиками - по обе стороны от упомянутой S-образной линии так, чтобы расстояние между субстратами пар антибиотиков равномерно увеличивалось, причем расстояние между наименее удаленными субстратами пары составляет 1,0-1,5 диаметра субстрата, а между наиболее удаленным -не менее 4 диаметров. Пример конкретного выполнения способа. Осуществление изобретения возможно в любой баклаборатории. В чашку Петри наливается расплавленный и остуженный до50°С питательный агар с добавлениями, необходимыми для роста исследуемых микроорганизмов (глюкоза, кровь, сыворотка и т.д.). После застывания и выдерживания чашки 20-30 мин в термостате лри температуре 37°С пастеровской пипеткой наносят на поверхность среды 3-4 капли взвеси одномиллиардной суточной агаровой культуры исследуемого микроорганизма и растирают стерильным шпателем по всей поверхности питательной среды. На поверхность засеянной питательной среды кладут пинцетом диски заводского приготовления с химиотерапевтическими веществами. Если нет дисков заводского приготовления, можно их приготовить самим (Навашин СМ., Фомин Н.П. "Справочник по антибиотикам, Москва, "Медицина", 1974 г., с. 41) или применить метод лунок, либо фарфоровых стаканчиков, заполняя их раствором химиотерапевтических веществ определенной концентрации, соответствующей содержанию дисков. На засеянную чашку Петри кладут диски, содержащие определенное химиотерапевтическое вещество, к примеру - 5, которое располагают S-образно на расстоянии 7-9 мм друг от друга (фиг. 1). С четырех сторон кладут диски с другими химиотерапевтическими веществами, к примеру - 6, 10,13,18. Используют принцип постепенного удаления дисков в сочетаниях химиотерапевтических веществ. Для быстроты работы можно пользоваться трафаретом. Чашка инкубируется в термостате 18-24 часа. На фиг. 1 видны увеличения зон задержки роста микроорганизмов в сочетаниях 6-5, 10-5, 18—5 и 5-13. Около 13-го имеется небольшая зона задержки роста микроорганизмов по направлению к 5-му. Имеется общая большая зона задержки роста в сочетаниях 6-5 и 10-5, так как сенсибилизирующий эффект просматривается в этих двух сочетаниях. Контролем 5-го может служить 4-й диск сверху и часть зоны задержки роста 6-го, не в области сочетанного действия 6-5 (фиг. 1). В сочетании 10-5 контроль будет радиус задержки роста, 10-ым - находящийся не в области сочетанного действия 10-5, контролем 5-го - тот же 4-й диск сверху. В зоне сочетанного действия 185 контролем является радиус зоны задержки роста 18-го не в области сочетанного действия химиотерапевтических веществ, контроль 5-го - тот же. Сенсибилизация в сочетаниях 5-13 значительная, так как радиус задержки роста микроорганизмов в области 13-го равен 6мм, сам диск 6 мм и радиус задержки роста микроорганизмов с противоположной стороны должен быть 6 мм. Итого диаметр зоны задержки роста 13 будет равняться 18 мм, что говорит о чувствительности культуры к данному сочетанию. Фигура 2 представляет чашку Петри, засеянную культурой, выделенной от больной С. по результатам антибиотикограмм нечувствительная к антибиотикам. Для того, чтобы поставить исследование на одной чашке Петри, мы несколько модифицировали наблюдение, используя те же основные принципы, применяемые в нашей работе, с той лишь разницей, что мы применили не 4 сочетания и антибиотикограмму, не к 5-ти химиотерапевтическим веществам, а б сочетаний и антибиотикограммы к 7-ми химиотерапевтическим веществам. Не имея результатов антибиотиграммы, такие наблюдения проводить нежелательно, т.к. при чувствительности культуры к химиотерапевтическим веществам будет тяжело, а иногда невозможно учесть результаты. Мы описываем эту фигуру, чтобы с одной стороны была видна радиальность и автономность микробиологических реакций на отдельных секторах диффузии химиотерапевтических веществ; с другой стороны, чтобы более четко показать сенсибилизацию микроорганизмов один химиотерапевтическим веществом к другому, когда оба химиотерапевтические вещества не действуют на выделенную культуру. На фигуре 2 видна радиальность и автономность микробиологических реакций на отдельных секторах диффузии химиотерапевтичвских веществ. На фигуре 2 сенсибилизация хорошо просматривается в сочетаниях 10-5,27-5,14-5 и радиальность и автономность микробиологических реакций в сбчетании 27-5. На фигуре 2, где S-образно размещены два химиотерапевтических вещества: в верхней части размещен 5-й, в нижней - 4 диска 10-го. В связи с нечувствительностью культуры к химиотерапевтическим веществам были исследованы 6 разных сочетаний, но лучше использовать 4 сочетания (фигура 1), если неизвестна чувствительность микрофлоры, для получения четких результатов. На фигуре 2 наблюдается сенсибилизация культуры, не чувствительной к химиотерапевтическим веществам в сочетании 27,5, где отчетливо виден сектор зоны задержки роста микроорганизмов в области 5го. В области сочетания 10,5 виден серповидный участок зоны задержки роста; в области 5-го 10-й не действует на культуру, в сочетаниях: 10-14 к 14-му, 10-й не действует, 24-й не действует на культуру и не сенсибилизирует, 17-й дает самостоятельную небольшую зону задержки микроорганизмов. В данном опыте исследовалось 6 сочетаний химиотерапевтическйх веществ. Максимальная зона задержки роста микроорганизмов между сочетаниями химиотерапевтическйх препаратов указывает на увеличение титра сочетаний в отношении исследуемой культуры, для уточнения можно оттитровать методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде (МПБ), титруя одно химиотерапевтическое вещество на фоне суббактериостатической дозы второго. Например, мономицин на фоновой дозе устойчивого тетрациклина. В области S-образно расположенных дисков, где нижние 4 диска 10-го, а вверху расположены диски 5-го, видна зона задержки роста аналогичная сочетания 10-5. Таким образом, применение предлагаемого способа создает возможность выяснить чувствительность выделенной культурой больного к 5-ти химиотерапевтическим веществам и к различным сочетаниям химиотерапевтическйх веществ в каждом отдельном случае. Применение способа на 3-х чашках Петри дает возможность исследовать 12 сочетаний химиотерапевтическйх веществ и определить чувствительность к 15-ти химиотерапевтическим веществам. Можно увеличить количество чашек. Сенсибилизация микроорганизмов одним химиотерапевтическим веществом к другому препятствует образованию устойчивых форм микроорганизмов к химиотерапевтическим веществам, а наоборот, как явствует из фигур 1-2 повышает их чувствительность к химиотерапевтическим веществам. Это явление может быть использовано для консервирования продуктов питания для лечения людей, животных и птиц, для прироста веса животных, может быть использована в борьбе с эпидемиями, вызванными устойчивыми микроорганизмами к химиотерапевтическим веществам. При помощи этого способа нами была обнаружена новая закономерность радиальности и автономности микробиологических реакций на отдельных секторах диффузии химиотерапевтическйх веществ в области сочетанного их действия.