Спосіб інкапсулювання антибіотиків в липосоми

Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности, и касается способа инкапсулирования антибиотиков в липосомы. В последние годы пристальный интерес исследователей, работающих в биологии, медицине и смежных областях науки, направлен на изучение липосом. Относительная устойчивость в биологических средах, высокая биодеградируемость структурных липидов, возможность широко варьировать фармакокинетику липосом с направленным транспортом препаратов в патологический очаг, протективное действие липосомальной мембраны - все эти свойства липосом позволяют рассматривать их как перспективную лекарственную форму для лечебных и диагностических препаратов. Наиболее близким к заявляемому является способ получения липосом, содержащих антибиотик [1], заключающийся в смешивании раствора лецитина с рартвором антибиотика, содержащего эктерицид, эмульгировании смеси с последующим ее упариванием и суспендированием осадка в эктерициде. Однако, известный способ не применим в случае необходимости одновременного инкапсулирования антибиотиков с различными физико-химическими свойствами. В основу изобретения поставлена задача создания способа инкапсулирования антибиотиков в липосомы, в котором путем раздельного предварительного растворения различных антибиотиков обеспечивается одновременное включение в липосомы растворимых и нерастворимых антибиотиков и за счет этого достигается расширение спектра терапевтического воздействия лекарственных средств в липосомальной форме с одновременным снижением возможности аллергенного и токсического их воздействия на организм за счёт исключения из липосомальной композиции ПАВ. Поставленная задача решается тем, что в способе инкапсулирования антибиотиков в липосомы путем смешивания органического раствора лецитина с раствором антибиотика, содержащего эктерицид, эмульгирования смеси, ее упаривания и суспендирования осадка в эктерициде, согласно изобретению, перед смешиванием нерастворимый антибиотик предварительно растворяют в органическом растворителе, а растворимый - в эктерициде. В результате осуществления способа достигается возможность одновременного включения в липосомы антибиотиков с различными физико-химическими свойствами. При этом достигается полная совместимость препаратов в лмпосомэльной форме при одновременном повышении устойчивости липосом как в широком диапазоне рН, так и при значительном нагревании. Способ осуществляется следующим образом. Приготавливают раствор лецитина в диэтиловом эфире или хлороформе, содержащем водонерастпоримый антибиотик (концентрация лецитина 25-35г/л). Добавляют к полученному раствору 0,3-0,4 объемов эктерицида, содержащего водорастворимый антибиотик. Далее обрабатывают полученную смесь ультразвуком (частота 44кГц, 5 раз по 3с с интервалом между обработками 60с при 0°С). Отгонку органического растворителя осуществляют в вакууме при остаточном давлении 10-20мм рт.ст. на роторном испарителе при 15-25°С. Затем получают стандартные по размеру лмпосомы путем их фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор 500нм. После этого проводят трехкратную отмывку стандартизованных по размеру липосом центрифугированием-ресуспендированием при 20000об/мин и температуре 0°С в течение 20мин. Степень включения антибиотиков в липосомы определяют после разрушения липосом тритоном Х-100 по соответствующим для эти х препаратов методикам. Расчет проводят по следующей формуле: M - 100 K= x Mo где K - степень включения лекарственного вещества в липосомы, %; Mx - количество вещества, обнаруженного после разрушения, г; Mo - количество вещества, включаемого в липосомы, г. Полученные липосомы характеризуются повышенной стабильностью в процессе хранения, устойчивостью к температурному фактору и изменяющимся в широком диапазоне значения рН, более эффективным внутренним объемом, также липосомы не требуют консервантов для обеспечения стерильности. Пример 1. Способ получения липосомальной формы рифампицина (нерастворимый антибиотик). 50мг рифампицина растворяют в 8,5мл хлороформа. В этом же растворе растворяют лецитин, полученный упариванием 10%-спиртового раствора лецитин-стандарта (производство Харьковского НПО "Биолипид") при остаточном давлении 10-20мм рт.ст. и 40-45°С. К полученному раствору добавляют 1,5мл эктерицида и диспергируют ультразвуком с частотой 44кГц 5 раз по 30с и интервалом между озвучиваниями 60с. Операции проводят при 0°С. Отгонка органического растворителя производится при остаточном давлении 10-20мм рт.ст, на роторном испарителе. Полученные липосомы продавливают через мебранный фильтр с диаметром пор 500нм. Фильтрат центрифугируют при 20000об/мин в течение 20мин при 0°С. Супернатант сливают, осадок ресуспендируют в 10мл эктерицида. Операцию центрифугирования и ресуспендирова-ния повторяют 3 раза. После удаления супернатанта осадок липосом разбавляют зктерицидом до концентрации 10г/л, в пересчете на фосфолипид, Результаты изучения липосом, полученных предлагаемым способом и аналогом, представлены в табл.1 и 2. Из табл. 1 видно, что липосомы, полученные предлагаемым способом, устойчивы в более широком диапазоне значений рН - от 2 до 10. Это позволяет инкапсулировать лекарственные вещества, растворимые и устойчивые при значениях рН ниже 6. Предлагаемый способ позволяет значительно увеличить эффективный внутренний объем липосом, а именно с 0,98±0,025 до 1,60±0,010мг/г (табл.1). Повышается устойчивость липосом к нагреванию. Липосомы, полученные предлагаемым способом, устойчивы при нагревании до 95°С (табл. 2). Это дает возможность более упрощенно подходить к условиям длительного хранения липосом. Степень включения антибиотика в липосомы по предлагаемому способу составила 90,0±2,0%. Пример 2. Способ получения липосомальной формы гентамицина. 1мл 10% спиртового раствора лецитин-стандарта (производство Харьковского НПО "Биолипид") растворяют в диэтиловом эфире до концентрации 30г/л, после чего к раствору добавляют 1,5мл раствора гентамицина сульфата в эктерициде с концентрацией 15,0г/л. Последующую обработку проводят по примеру 1. Результаты изучения липосом представлены в табл.1 и 2. Из табл.1 видно, что липосомы, полученные предлагаемым способом, устойчивы в диапазоне значений рН - от 2 до 10. Предлагаемый способ позволяет значительно увеличить эффективность внутренний объем лмпосом, а именно с 0,96±0,020 до 1.62±0,010мл/г. Пример 3. Способ получения липосомальной формы рифампицина и гентамицина сульфата (одновременное включение). 50 мг рифампицина растворяют в 8.5мл хлороформа. В этом же растворе растворяют лецитин, полученный упариванием 10% спиртового раствора лецитин-стандарта (производство Харьковского НПО "Биолипид" при остаточном давлении 10-20мм рт.ст. до концентрации 30г/л, после чего к раствору добавляют 1,5мл раствора гентамицина сульфата в эктерициде с концентрацией 15,0г/л. Последующую обработку проводят по примеру 1. Полученные предлагаемым способом липосомы устойчивы в диапазоне значений рН от 2 до 10. Липосомы устойчивы к нагреванию: температура разрушения липосом 95°С. Предлагаемый способ позволяет получать липосомы с эффективным внутренним объемом 1,64±0,10мл/r. Таблица 1 Включае мые антибиот ики Рифампи цин Гентами цин Рифампи цин + Рентами цин размер липосо м, нм суммарный объем в нутренней в одной фазы, мл/г коэффициент выхода глюкозы С14. %сут Св ойства липосом устойчив ост сохранность ьк при седиментац лиофилиии зации 490±80 500±10 0 1,60±0.010 0,011±0.0013 Устойчив ы 1.62±0.010 0.012±0,0015 480±70 1.64±0.010 0,010±0.0014 Включаемые антибиотики Рифампицин Гентамицина сульфат Рифампицин+Гентамицина сульфат Рифампицин+Гентамицина сульфат сохранность при хранении рН разр уше ния темпер атура разруш ения, °С 96±1,0 85±2,0 2 95 Устойчив ы 95±0.5 85±2,0 2 95 Устойчив ы 97±1.5 86±2,0 2 95 Сравниваемые включения Предлагаемый Прототип 1 Предлагаемый Прототип 2 Предлагаемый Прототип 1 Прототип 2 Таблица 2 Степень включения, % 90,0±2,0 60,0±1,0 93,0±1,0 68,0±1,0 87,5±1,0 90.1±1,