Інгібітор цитомегаловірусу людини 2 – b

Пропонований винахід відноситься до області медицини, а саме до антивірусних препаратів, а також до областей вірусології і молекулярної біології, де може бути застосований у наукових дослідженнях. Відомі сполуки, що мають протицитомегаловірусну дію - ациклічні аналоги нуклеозидів: цидофовір, ацикловір, ганцикловір, пенцикловір [1, 2]. Насьогодні, найбільш широко з цієї серії препаратів для лікування цитомегаловірусу людини використовують ганцикловір 9-(1,3-дигідрокси-2-пропоксиметил)гуанін. Протицитомегаловірусну дію має також антисенс-олігонуклеотид - фомівірсен. Форміат фосфорної кислоти фоскарнет [3], який теж широко використовується у лікувальній практиці CMV, належить до іншого класу сполук. Але за результатом, який досягають, найбільш близьким до пропонованого винаходу є фоскарнет – СО5РNа3×6Н2О. Недолік згаданих речовин полягає у тому, що вони токсичні, до них швидко розвивається резистентність вірусу, та високі ціни згаданих препаратів. Аномальний нуклеозид 6-азацитидин (2 - b - D - рибофурано зил - 5 - аміно- 1,2,4 - триазин - 3(2Н ) - он - сполука 1 - стр уктурний аналог піримідинових нуклеозидів, синтезовано як потенційний протипухлинний агент. В основу пропонованого винаходу покладено задачу застосування за новим призначенням сполуки нуклеозидної природи -6-азацитидину, яка має низьку токсичність у поєднанні зі значною протипухлинною, антимікоплазменною і антиаденовірусною дією та високою біодоступністю. Обмежена (Незначна) кількість протицитомегаловірусних препаратів робить пропонований винахід актуальним, щодо розширення арсеналу лікарських засобів активних по відношенню до цього вірусу. Поставлена задача вирішується визначенням ефективності інгібіторної дії сполуки 1 -2 - b - D - рибофурано зил - 5 - аміно - 1,2,4 - триазин - 3(2Н) - ону - щодо цитомегаловірусу людини. Технічний результат - виявлення у сполуки 1 інгібіторних властивостей щодо цитомегаловірусу людини на рівні ганцикловіру (аналог). Суть методики визначення пригнічення CMV. Антивірусн у активність сполуки (1) оцінювали по здібності до пригнічення інфекційної активності вірусу в культурі клітин. Існує тісний причинно-наслідковий зв'язок між технічним результатом і сукупністю суттєвих признаків. Виявлено об'єктивний вплив сполуки (1) на активність цитомегаловірусу людини. Завданням винаходу є пошук такого засобу, що інгібує реплікацію цитомегаловірусу на рівні аналога, ганцикловіру. Поставлена мета досягається застосуванням сполуки (1) наступної формули Суть винаходу пояснюється графічними матеріалами, де показано залежність пригнічуючої дії сполуки 1 на інфіковані CMV клітини від її концентрації. Винахід ілюструється наступними прикладами. Приклад 1 Синтез 2 - b - D - рибофурано зил - 5 - аміно- 1,2,4 - триазин - 3(2Н) - ону (сполука 1). Сполуку 1 отримували спрощеним методом "силільної конденсації" в два етапи [4]. Перший етап включає реакції силілювання і подальшого каталітичного глікозилювання азапіримідинової основи 4-тіо-6-азаурацилу перацильованим сахаром; реакції проводяться одночасно, в одному реакторі. На слідуючому етапі ацильований 4-тіо-6-азануклеозид амінували безавтоклавним способом [5, 6] і видаляли захисні групи з рибозного залишку. До суспензії 1,29г (10мМол) 4-тіо-6-азаурацилу і 3,18г (10мМол) тетраацетилрибофуранози у 60мл ацетонитрилу при перемішуванні додають 1.65мл (8мМол) гексаметилдисилазана, 2,0мл (16 мМол) триметилхлорсилана і 1,8мл (15мМол) тетрахлориду олова. Розмішування реакційної суміші продовжують при кімнатній температурі на протязі 3-4 годин (контроль ТХС в системі хлоформ-метанол, 14:1) до завершення синтезу. Обробка реакційної суміші стандартна: після додавання 5мл етанолу, суміш випаровують до сиропу. Потім додають 100мл хлороформу і обробляють послідовно водою (3´50мл), насиченим розчином ацетата натрію (3´50мл) і знову водою (3´50мл). Органічний шар випаровують до сиропу і заливають 70мл насиченого розчину аміака у метанолі. Суміш витримують (три доби - у холодильнику, решту - при кімнатній температурі) до завершення амонолізу і деацилювання. Одержують 1,6г азацитидину з т.пл. 225-227°С. З маточника додатково виділяють 0,15г продукту. Кристалізують з водного етанолу. Одержаний препарат по спектральним характеристикам (УФ і ЯМР) ідентичний еталонному зразку. Приклад 2 Антицитомегаловірусна активність сполуки 1. Антивір усну активність сполуки 1 оцінювали за впливом низки концентрацій сполуки 1 на цитомегаловірусну інфекцію у культурі диплоїдних фібробластів легень ембріона людини. Середовище росту відбирали і на клітинний моношар вносили вірус із різною множинністю інфікування від 0,0001 до 0,01БУО/кл. Адсорбцію вірусу проводили протягом 1 години при 37°С. Після адсорбції вірус відбирали, клітини відмивали середовищем 199 і вносили досліджувані сполуки у концентраціях: 50мкг/мл, 100мкг/мл, 500мкг/мл, 1000мкг/мл та 3000мкг/мл. Розчини готувались на середовищі, що містило 2% ембріональної телячої сироватки. У кожному досліді передбачалися контроль цитомегаловірусу, який брали із тією ж інфекційною множинністю та контроль клітин. Усі проби інкубували при 37°С в присутності 5% СО2, протягом 9 діб. Інгібіторний ефект сполуки 1 оцінювали по здатності до пригнічення інфекційної активності вірусу у культурі клітин. Інфекційну активність вірусу визначали за підрахунком вірусспецифічних бляшок. Виявлення бляшок проводили за допомогою суміші моноклональних антитіл до вірусних антигенів (ІЕр72 та рр65). Антивір усну дію сполуки 1 на репродукцію ЦМВ людини визначали по зменшенню кількості інфікованих клітин у порівнянні із контролем. (фіг.1). Результати дослідження подані у процентах. Мінімальна інгібуюча доза (ІД50), яка зменшувала кількість неінфікованих клітин на 50% дорівнювала, як було визначено, - 24000мкг/мл. Мінімальна інгібуюча концентрація (МІК) при множинності інфікування (МІ) 0,001БУО/кл складала 100мкг/мл, а при МІ 0,0001БУО/кл - 50мкг/мл. Індекс селективності (ІC) сполуки 1 визначали по відношенню ІД50 до МІК (Таблиця 1). Як видно із наведених даних, сполука 1 має високий індекс селективності (240-480) і в ряді концентрацій інгібує цитомегаловірус на 2 lg. Усе викладене вище свідчить про непересічну інгібіторну активність сполуки 1, щодо цитомегаловірусу людини і перспективність цієї сполуки для створення відповідного противірусного хіміотерапевтичного препарату. Розширення арсеналу лікарських засобів відносно цього захворювання може зменшити проблему лікування мутантних, резистентних до існуючих хіміопрепаратів, форм цитомегаловірусу людини. Таблиця 1 Індекс селективності сполуки 1 Сполука Сполука(1) Ганцикловір Фоскарнет Контроль Індекс селективності, 1C 240-480 100-1000 400-500 ------- Джерела інформації: 1. Clyde S., Crumpacker M.D. Ganciclovir// The New England Journal of Medicine, Sept.,1996.- V.335.- №10. Р.721-729. 2. Alejio Erice. Resistance of Human Cytomegalovirus to Antiviral Drugs// Clinical Microbiology Reviews.- April 1999.- V.12.- №2.- P.286-297. 3. Irene G. Sia and Robin Pa Tel New strategis for Prevention and Therapy of Cytomegalovirus Infection and Disease in Solid - Organ Transplant Recipients, // Clinical Microbiology Reviews. -Jan., 2000.- P.83-121. 4. A .c. 1625881 A 1, СССР. Способ получения 6-азацитидина. А.С.Шаламай, С.С. Огнянник, И.В.Алексеева, B.C. Гончаренко //Открытия. 1991, №5. 5. Алексеева И.В., Сидоров Г.В., Шаламай А.С. и др. Синтез тритиймеченых 6-азауридина и 6-азацитидина // Методы молекулярной биологии -Киев: Наукова думка, 1986. -С.52-58. 6. Алексеева И.В., Пальчиковская Л.Г.,Шаламай А.С. и др. Синтез и биологическая активность N1замещенных 6-азацитозинов// Химико-фармацевтич. журн. -1994. -№4. -С.16-18.