Набір для визначення активності нетрипсиноподібних протеїназ в біологічних рідинах

Винахід відноситься до біохімії і може бути використано у біології та медицині для наукових досліджень і клінічній практиці. Відомий Набір реактивів для визначення первинних ароматичних амінів у розчинах і біологічних рідинах (див. Пат. РФ №2097762, G01N33/48, А61В19/02), який містить у відповідних упаковках наважку три хлороцтової кислоти, яка при розчиненні у 50мл дистильованої води дає розчин, що приводить до осаду білків, смужки паперу із натрієм азотнокислим, які пристосовані до утворення розчину для діазотування безпосередньо перед аналізом (ex tempore), наважку амонію сульфамінокислого, котра при розчиненні у 25мл дистильованої води дає розчин для зв'язування залишку натрію азотнокислого, розчин N-(1)-нафтилетилендіамінодигідрохлориду для утворення забарвленої азосполуки, смужки паперу, що містять 0,018мкмоль стандартного аміну, який аналізують. Використання набору дозволяє спростити проведення аналізу і підвищити його точність, але він призначений тільки для визначення ароматичних амінів. Відомий спосіб визначення активності протеїназ або їх інгібіторів в біологічних рідинах (див. Пат. РФ №1655991, С12Q1/37), прототип, який містить полістироловий планшет, що іммобілізований маркерним ферментом, який комплексно пов'язано із субстратом протеолітичної реакції, а саме альбуміном сироватки бика, препарат протеїнази - трипсин, фосфа тний буфер для приготування робочого розчину протеїнази, контрольного матеріалу і дослідних проб для аналізу, детергент для приготування миючої рідини, цитратами буфер, ортофенілендіамін і гідроперит для виявлення залишкової активності маркерного ферменту. Чутливість способу становить - 10-9-10-10г. Недоліком відомого способу є складність здійснення етапу підготовки: приготування комплексу маркерного ферменту та субстратного білка і його іммобілізація на поверхні полістиролових плашок, що потребує використання спеціальних реагентів, обладнання, високої кваліфікації оператора. Крім того, відомий спосіб не передбачає визначення активності нетрипсиноподібних протеїназ (НТПП), що може бути використано в якості критерію прогнозу розвитку, перебігу захворювань різного походження та контролю ефективності лікування. В основу винаходу поставлена задача розробки набору, за допомогою якого можна було б специфічно та простим способом визначати активність НТПП у біологічних рідинах. Поставлена задача вирішується у наборі для визначення активності НТПП у біологічних рідинах, який містить полістироловий планшет, що іммобілізований маркерним ферментом, який комплексно пов'язаний із субстратом протеолітичної реакції, препарат протеїнази, фосфатний буфер для приготування робочого розчину протеїнази, контрольного матеріалу і дослідних проб для аналізу, детергент для приготування миючої рідини, цитратний буфер, ортофенілендіамін і гідроперит для виявлення залишкової активності маркерного ферменту. Згідно з винаходом відрізняючими ознаками є те, що: - набір додатково містить інгібітор трипсину із сої для пригнічення активності трипсиноподібних протеїназ, - усі компоненти надані у окремих упаковках при наступному складі компонентів: препарат протеїнази (трипсин - 1мг), фосфатний буфер - 12,5мл, детергент - 0,75мл, цитратний буфер - 6мл, ортофенілендіамін - 2мг або 1 таблетка, гідроперит - 1 таблетка, інгібітор трипсину із сої - 1мг. Додатково наявність у наборі інгібітору трипсину із сої обумовлено тим, що він пригнічує активність трипсиноподібних ферментів, які здатні розщеплювати навіть глобулярні білки, такі як маркерний фермент. Вміст та певна кількість компонентів у наборі забезпечує оптимальні умови для здійснення способу визначення активності НТПП у біологічних рідинах (40 зразків у дублікаті). Виконання любого методу складається з 2-х основних етапів: приготування реагентів, які необхідні для проведення аналізу і серії послідовних операцій здійснення методики. Від якості виконання 1-го етапу роботи в значній мірі залежить кінцевий результат аналізу. Необхідна точність вимірювань, спеціальне обладнання, висока кваліфікація оператора. З метою підвищення точності і порівнянності результатів для багатьох методів, які передбачають масові дослідження, виготовляють відповідні реагенти в спеціалізованих лабораторіях і реалізують у вигляді наборів. Придбання повного комплекту реагентів у наборі звільняє від пошуку необхідних компонентів по каталогах різних фірм-виробників та постачальників. Крім того, придбання окремих компонентів у необхідній лімітованій кількості для проведення серії аналізів потребує надлишкових фінансових витрат. Дослідження по запропонованому набору були проведені в Інституті терапії АМН України. Розрахунки комплектування наборів перевірено лабораторними іспитами. Використання запропонованого рішення забезпечує спрощення способу, зменшення витрат на придбання реагентів, розширення області застосування, високу відтвореність способу (не менш 95%). Набір складається із наступних компонентів: - Плашка, яка іммобілізована маркерним ферментом, що комплексно пов'язано із альбуміном сироватки бика. - Флакон №1 - детергент, твін-20 (0,75мл). - Флакон №2 - фосфатний буфер (10-15мл). - Флакон №3 - цитратний буфер (6мл). - Флакон №4 - ортофенілендіамін (2мг або 1 таблетка). - Флакон №5 - препарат протеїнази (1мг трипсину). - Флакон №6 - 0,0025н НСl (1мл). - Флакон №7 - інгібітор трипсину із сої (1мг). - Гідроперит (1 таблетка). Аналіз здійснюють за інструкцією, яка надається до набору. Приготування реагентів із набору: 1. Готують миючу рідину: 0,5мл детергенту із флакону №1 додають до 1л дистильованої води. 2. Готують фосфатний буфер: рідину із флакону №2 доводять до 250мл дистильованою водою і додають 0,25мкл детергенту із флакона №1. 3. Відмивають плашку 2-3 рази дистильованою водою, яка містить детергент. 4. Готують ви хідний розчин протеїнази та контрольний матеріал (на льоду): Препарат протеїнази із флакону №5 (трипсин), спочатку розчиняють у 1мл 0,0025н НСl. Потім 160мкл розчину додають до 19,84мл фосфатного буферу, який містить детергент, - вихідний розчин. Надалі проводять серію послідовного розведення вихідного розчину за наступною схемою: Таблиця №№ Концентрація, Буфер, Протеїназа, станд Розв едення мкг/мл мл мл артів 1 0 1,0 2 0,005 1:9 № 4 1,8 0,2№ 4 3 0,01 1:9 № 5 1,8 0,2№ 5 4 0,05 1:3 № 6 1,2 0,4№ 6 5 0,1 1:9 № 7 1,8 0,2№ 7 6 0,2 1:19 № 8 1,9 0,1№ 8 1:7 0,2 в ихідного 7 1,0 в ихідного 1,4 розчину розчину 1:1 0,75 8 4,0 0,75 в ихідного в ихідного розчину розчину 5. Готують інгібітор трипсину із сої безпосередньо перед використанням: у флакон №7 додають 1мл фосфа тного буферу, який приготовлено раніше по п.2, вихідний розчин. Потім розводять: у 100000 разів, наприклад, спочатку у 100 (50:4950мкл), потім у 1000 разів (50:49950мкл). 6. Готують суміш для виявлення залишкової активності маркерного ферменту: цитратний буфер із флакону№3 розводять у 2 рази дистильованою водою, додають ортофенілендіамін із флакону №4 або таблетку, потім - гідроперит (готується суміш перед використанням). Проведення аналізу: 1. Окремо на титрувальній дошці готують дослідні зразки (n=40): зразки плазми/сироватки крові людини розводять у 250 разів фосфатним буфером, наприклад, шляхом послідовного розведення у 25 та 10 разів (до 960мкл буферу додають 40мкл сироватки, потім до 180мкл буферу - 20мкл 1-го розведення сироватки). Зразки слини людини, сироватки крові та цитозолю тканин щурів розведення не потребують. 2. Вносять у лунки титрувальної дошки контрольний матеріал. 3. Проводять реакцію пригнічення активності трипсиноподібних протеїназ доданням до дослідних зразків 1:1 розчину інгібітор трипсину із сої, інкубують 5 хвилин при 37°С. 4. Проводять протеолітичну реакцію розщеплення іммобілізованого маркерного ферменту, який комплексно пов'язано із білковим субстратом: вносять у лунки полі стиролових плашок (по 100мкл) контрольний матеріал та дослідні зразки, що приготовлені по п. 3 та інкубують 15 хвилин при 37°С. 7. Усувають реакційну суміш шля хом відмивання плашки як вказано раніше. 8. Готують 50 % сірчану кислоту (у набір не входить). 9. Визначають залишкову активність іммобілізованого маркерного ферменту додачею суміші, що приготовлена з цитратного буферу, ортофенілендіаміну та гідропериту. Інкубують протягом 3-5 хвилин. 10. Зупиняють реакцію додачею по 50мкл у лунку 50% сірчаної кислоти. 11. Визначають оптичну щільність розчинів при 490нм за допомогою мікроспектрофотометра. 12. Будують калібровану криву за результатами вимірювань контрольних зразків та розраховують активність НТПП за відповідною формулою (показано у прикладі). Можливість здійснення аналізу з використанням запропонованого набору підтверджується прикладом. Приклад 1. Визначення НТПП у сироватці крові людини. Приготування реагентів із набору: 1. Готують миючу рідину: 0,5мл детергенту із флакону №1 додають до 1 л дистильованої води. 2. Готують фосфатний буфер: рідину із флакону №2 доводять до 250мл дистильованою водою і додають 0,25мкл детергенту із флакона №1. 3. Відмивають плашку 2-3 рази дистильованою водою, яка містить детергент. 4. Готують ви хідний розчин протеїнази та контрольний матеріал (на льоду): Препарат протеїнази із флакону №5 (трипсин) спочатку розчиняють у 1мл 0,0025 н НСl. Потім 160мкл розчину додають до 19,84мл фосфатного буферу, який містить детергент, - вихідний розчин. Контрольний матеріал готують шляхом серії послідовного розведення вихідного розчину за схемою, яка представлена у Табл. 1. 5. Готують інгібітор трипсину із сої безпосередньо перед використанням: у флакон №7 додають відповідно 1мл фосфатного буферу, що приготовлено раніше по п. 2, - вихідний розчин. Потім розводять у 100000 разів, наприклад, спочатку у 100 (50:4950мкл), потім у 1000 разів (50:49950мкл). 6. Готують суміш для виявлення залишкової активності маркерного ферменту: цитратний буфер із флакону №3 розводять у 2 рази дистильованою водою, додають ортофенілендіамін із флакону №4 або таблетку, потім гідроперит (готується суміш перед використанням). Проведення аналізу: 1. Окремо на титрувальній дошці готують дослідні зразки (n=40): зразки сироватки крові людини розводять у 250 разів фосфатним буфером, наприклад, шляхом послідовного розведення у 25 та 10 разів (до 960мкл буферу додають 40мкл сироватки, потім до 180мкл буфер у - 20мкл 1-го розведення сироватки). 2. Вносять у лунки титрувальної дошки контрольний матеріал. 3. Проводять реакцію пригнічення активності трипсиноподібних протеїназ додаванням до дослідних зразків 1:1 розчину інгібітор трипсину із сої, інкубують 5 хвилин при 37°С. 4. Проводять протеолітичну реакцію розщеплення іммобілізованого маркерного ферменту, який комплексно пов'язано із білковим субстратом: вносять у лунки полістиролових плашок (по 100мкл) контрольний матеріал та дослідні зразки, що приготовлені по п. 3 та інкубують 15 хвилин при 37°С. 7. Усувають реакційну суміш шля хом відмивання плашки як вказано раніше. 8. Готують 50 % сірчану кислоту (у набір не входить). 9. Визначають залишкову активність іммобілізованого маркерного ферменту додачею суміші, що приготовлена з цитратного буферу, ортофенілендіаміну та гідропериту. Інкубують протягом 3-5 хвилин. 10. Зупиняють реакцію додачею по 50мкл у лунку 50 % сірчаної кислоти. 11. Визначають оптичну щільність розчинів при 490нм за допомогою мікроспектрофотометра. 12. Будують калібровану криву за результатами вимірювань контрольних зразків та розраховують активність НТПП за формулою: С зал. × 250 × 4 × 1000 (г/л год.), 1000000 де: С зал. - концентрація НТПП, яка визначена по каліброваній кривій, мкг/мл, 250 - розведення зразків сироватки крові людини, 4 - коефіцієнт перерахунку на 1 годину, 1000 - коефіцієнт перерахунку на 1л, 1000000 - коефіцієнт перерахунку у грами. Висновок: Вказаний приклад підтверджує можливість спрощення постановки аналізу активності НТПП у біологічних рідинах. Технічний результат: Використання винаходу у порівнянні з прототипом забезпечує спрощення проведення біохімічного аналізу, зменшення витрат на придбання реагентів у 250 разів, розширення області застосування. Відтвореність способу не менш 95%.