Спосіб одержання протипухлинної вакцини та спосіб лікування онкологічних хворих

Винахід, що заявляється, відноситься до медицини, а саме до онкології, стосується технології одержання протипухлинних засобів і може використовуватися для лікування онкологічних хворих. Проблема пухлинного росту є однією з найактуальніших в сучасній медицині. Спостереження клініцистів, які помічали затримку росту пухлин у хворих бе шихою чи іншими інфекційними захворюваннями поклали початок дослідженням, спрямованим на вивчення можливостей застосування в онкології бактерій та їх продуктів. З того часу не припиняються роботи, спрямовані на пошуки біологічно активних речовин мікробного і тканинного походження для лікування злоякісних новоутворень. Дослідження з вивчення біології пухлинного росту дали цінну інформацію для більш цілеспрямованого застосування імунотерапевтичних методів на основі антигенів пухлин, що індук ують реакцію-відповідь організму. В області імунотерапії раку спочатку використовувалися вбиті радіацією або лізовані пухлинні клітини, котрі пізніше почали застосовуватися з вбитими чи живими клітинами BCG, Cor. parvum та ін. мікроорганізмами. Використовуючи мікробні клітини, було відкрито їх імуностимулюючі властивості, або іншими словами - ад'ювантну активність. Адже ідеальна вакцина, не тільки протиракова, повинна забезпечувати тривалий захист від захворювання, однак не завжди можливо його отримати. Для виправлення цього недоліку, до вакцин різного походження додають різні ад'юванти. Відомо, що для підвищення ефективності лікування хворих на колоректальний рак з ад'ювантним компонентом терапії доцільно використовувати допоміжні засоби, необхідні для відновлення імунної системи, підвищення протипухлинної резистентності та покращення якості життя лікованих пацієнтів. Це досить важливо і на це звертають особливу увагу в схемах сучасної терапії. Відомі на сьогодні експериментальні та клінічні дані вказують на дуже великий спектр протипухлинних вакцин, котрі використовуються в клінічній практиці. Позитивні результати одержано зарубіжними онкологами при застосуванні протипухлинних вакцин при лікуванні хворих на колоректальний рак [1-3]. Відомі також експериментальні та клінічні дані по ефективності профілактики рецидивів та метастазів за допомогою вітчизняної протипухлинної аутовакцини [4,5]. Відмічено стимулюючий вплив вакцини на функції клітинного і гуморального імунітету. Найбільш близьким аналогом до способу одержання протипухлинної вакцини, є спосіб одержання протипухлинної аутовакцини шляхом промивання пухлинної тканини стерильним фізіологічним розчином, її подрібнення, оброблення пухлинних клітини у співвідношенні 1:10 фільтратом культуральної рідини мікроорганізму Bac.subtilis B-7025, інкубації суміші в термостаті при 37°С протягом 1 години, періодично струшуючи. Після закінчення інкубації вакцину перевіряють на стерильність та життєздатність пухлинних клітин [6]. Однак не завжди є можливість одержати пухлинний матеріал для аутовакцини. Тому до цього часу актуальним залишається питання про вибір антигену, загального для пухлин різного походження, котрий може стати основою для створення універсальної протиракової вакцини, хоча б в межах одного чи кількох типів пухлин. В основу способу одержання протипухлинної вакцини, що заявляється, поставлено задачу розширення арсеналу вакцин для лікування онкологічних хворих, забезпечуючи вакцинацію при відсутності аутологічного матеріалу. Поставлена задача вирішується тим, що для одержання протипухлинної вакцини використовують гомогенат ембріональної тканини людини, який обробляють у співвідношенні 1:4 фільтратом культуральної рідини мікроорганізму B.subtilis B-7025. Відомо про здатність ембріональних антигенів суттєво впливати на у хід пухлинного процесу [7]. Було показано наявність ембріональних антигенів (ЕА) в різних пухлинах гризунів і їх здатність індукувати імунологічну відповідь у пухлиноносія, яка виражалася появою протипухлинних цитотоксичних антитіл і лімфоцитів. Імунізація сингенними ембріональними клітинами мишей і хом'яків різних ліній викликала резистентність до сингенних пухлин індукованих вірусом SV-40, аденовірусами 7 і 31 типів, вірусом лейкозу Раушера [8]. В дослідах інших авторів імунізація сингенних хом'яків клітинами лімфовузлів вагітних самок викликала резистентність до пухлин індукованих вірусом SV-40 [9]. При імунізації дорослих перепелів тканинами 10-13 денних перепелинних ембріонів виявлена цитотоксична активність спленоцитів по відношенню до клітин, трансформованих вірусом саркоми Рауса чи метилхолантреном [10]. Необхідно відмітити, що була встановлена здатність екстрактів, одержаних із 10добових ембріонів хом'яків (оброблених ЗМ КС1) індукувати резистентність до сарком, індукованих SV-40 чи аденовірусом 7 типу у випадку експресії пухлинами ЕА чи схожих з ними онкофетальних антигенів (ОФА), тим самим була виявлена здатність ЕА до індукції протипухлинного трансплантаційного імунітету. Як видно з вищенаведеного матеріалу ОФА можуть експресуватися в пухлинах різного гістогенезу. Це відповідно відкриває перспективи використання їх в якості універсальних специфічних імуногенів. Суть способу одержання протипухлинної вакцини полягає в тому, що протипухлинну вакцину одержують з ембріонального гомогенату, який отримують з ембріонів людини (строком розвитку від 5 до 12 тижнів, при виконанні медичного аборту) шляхом промивання фрагментів ембріональної тканини стерильним фізіологічним розчином, подрібненням та її гомогенізацією. Одержаний гомогенат перевіряють на наявність вірусу гепатиту, цитомегаловірусу, герпесу, хламідій, мікоплазм, збудників венеричних захворювань та ігі. При одержанні результатів про відсутність збудників інфекції, гомогенат з'єднують у співвідношенні 1:4 з фільтратом культуральної рідини штаму B.subtilis B-7025. Суміш інкубують в термостаті (37°С) протягом 1 години при періодичному струшуванні. Всі етапи приготування протипухлинної вакцини проводять в асептичних умовах, стерильність вакцини визначають шляхом висіву її на м'ясопептонний бульйон. Одержана таким способом вакцина призначена для лікування онкологічних хворих при 1-1У стадії захворювання у яких після операції за певних причин не змогли взяти або зберегти пухлинний матеріал, та/або для хвори х зі злоякісними пухлинами, у яких процес захворювання прогресує після традиційних методів лікування (хірургічне лікування, поліхіміотерапія та променева терапія). Найбільш близьким аналогом до способу лікування онкологічних хворих, є спосіб специфічної імунотерапії хворих колоректальним раком, яку проводять через 7-10 днів після радикального вилучення пухлини хворим аутовакциною, одержаною в результаті обробки пухлинних клітин фільтратом культуральної рідини штаму B.subtilis B-7025, шляхом підшкірного 3-разового введення в сумарній дозі 9мл з інтервалом 7 діб з наступними однократними ревакцинаціями через 1 та 6 місяців [11]. В основу способу лікування онкологічних хворих, поставлено задачу створення такого способу лікування протипухлинною вакциною, щоб забезпечити підвищення протипухлинної резистентності організму для досягнення збільшення тривалості та покращення якості життя лікованих пацієнтів. Поставлена задача вирішується тим, що створено спосіб лікування онкологічних хворих протипухлинною вакциною, що включає 7-кратне підшкірне введення вакцини в зростаючо-зменшувальному режимі з повторним проведенням 1-5 курсів через 1-6 місяців. Дозу вакцини для лікування підбирали і контролювали за допомогою реакції гіперчутливості уповільненого типу (РГУТ), тобто визначали ступінь розвитку реакції на введення антигену вакцини у пацієнтів [12]. Дана реакція свідчить про формування клітинного імунітету і використовується в клінічній імунології. Позитивна РГУТ розцінюється як сприятлива прогностична ознака і корелює з активністю Т-лімфоцитівхелперів периферійної крові у хворих з різними пухлинами, котрі є необхідними для генерації специфічних протипухлинних лімфоцитів. РГУТ проводили шляхом внутрішньошкірного введення протипухлинної вакцини в кількості 0,1мл, ступінь її розвитку визначали через 24 години після введення. Реакцію оцінювали як позитивну у випадку появи ерітеми діаметром 4-5см. Було встановлено, що найкраща відповідь РГУТ співпадала з заявленими нами дозами вакцини. Попередні експериментальні та клінічні дані показали, що ти тр специфічних антитіл та активність клітинефекторів протипухлинного імунітету знижуються через 1-6 місяців після вакцинації, і тому в цей термін проводили повторні курси лікування. Суть способу лікування онкологічних хворих полягає в тому, що одержану вакцину вводять підшкірно 7кратно з інтервалом 1 тиждень в сумарній дозі 16мл в зростаючо-зменшувальному об'ємі - 1мл, 2мл, 3мл, 4мл, 3мл, 2мл, 1мл на один курс лікування, з повторним проведенням 1-5 курсів через 1-6 місяців. Після вакцинації у пацієнтів не спостерігали ніяких побічних реакцій. Основними критеріями ефективності лікування були якість і тривалість життя лікованих пацієнтів. Суть винаходу пояснюють 4 приклади конкретного виконання: Приклад 1. Протипухлинну вакцину одержують з ембріонального гомогенату, який отримують з ембріонів людини (строком розвитку 5-12 тижнів, при виконанні медичного аборту) шляхом промивання фрагментів ембріональної тканини стерильним фізіологічним розчином, подрібненням та її гомогенізацією. Одержаний гомогенат перевіряють на наявність вірусу гепатиту, цитомегаловірусу, герпесу, хламідій, мікоплазм, збудників венеричних захворювань та ін. При одержанні результатів про відсутність збудників інфекції, гомогенат з'єднують у співвідношенні 1:4 з фільтратом культуральної рідини штаму B.subtilis B-7025. Суміш інкубують в термостаті (37°С) протягом 1 години при періодичному струшуванні. Всі етапи приготування протипухлинної вакцини проводять в асептичних умовах, стерильність вакцини визначають шляхом висіву її на м'ясопептонний бульйон. Приклад 2. Хворий За-ка A.M., 28 років. Діагноз: дрібноклітинний рак легені (стадія IV). З 2.09.2000р. по 25.01.2001р. пройшов три курси поліхіміотерапії (доксорубіцин, цисплатин, циклофосфан, вінкрістін) в комбінації з променевою терапією. На фоні лікування відмічено прогресування захворювання (зафіксовано рентгенологічно). В Інститут звернувся 3.10.2001р. в зв'язку з болями в легенях та збільшенням лімфовузлів. Хворому було проведено вакцинотерапію за схемою: 7-кратно з інтервалом 7 діб в зростаючозменшувальному об'ємі - 1мл, 2мл, 3мл, 4мл, 3мл, 2мл, 1мл на один курс лікування, з повторним проведенням курсів через 1, 4 та 6 місяців. Після проведення вакцинації стан хворого значно покращився, зникли болі в легенях, розміри лімфовузлів прийшли до норми, з'явився апетит, хворий став набирати вагу, розвиток пухлинного процесу було з упинено (10.08.2002 зафіксовано рентгенологічно). На 20.08.03 хворий знаходився під наглядом без проявів прогресування хвороби. Приклад 3. Хворий Ха-мон В.О., 48 років. Діагноз 5.04.2000р: аденокарцинома сигмовидної кишки, стадія T3N0 M0 , проведене хірургічне лікування. Протягом 6-ти місяців хворий отримував курс поліхіміотерапії. В наш інститут звернувся 19.04.2001р. в зв'язку з болями в пахових лімфовузлах та їх збільшенням і болями в печінці. При ультразвуковому дослідженні виявлено метастази в печінці (1,2x1,8см і 0,7x1,0см). Хворому було проведено вакцинотерапію за схемою: 7-кратно з інтервалом 7 діб в зростаючо-зменшувальному об'ємі -1мл, 2мл, 3мл, 4мл, 3мл, 2мл, 1мл на один курс лікування, з повторним проведенням курсу через 1, 3 та 5 місяців. Після проведення вакцинації стан хворого значно покращився, зникли болі в печінці, розміри лімфовузлів прийшли до норми, хворий став набирати вагу, розвиток пухлинного процесу було зупинено (10.08.2002р. зафіксовано рентгенологічно). На 20.10.03р. хворий знаходився під наглядом без проявів прогресування хвороби. Приклад 4. Хвора М-ло Н.І., 1955р.н. (47 років). Діагноз: рак яєчника, стадія III (T3N0 M0), кл.гр.П. Операція 08.12.1999р.- видалення пухлини правого яєчника, резекція сальника. Патогістологічне заключения: низькодиференційована аденокарцинома. Проведено 4 курси поліхіміотерапії (доксорубіцин, цисплатин, карбоплатін), відмічена сильна інтоксикація (втрата апетиту, похудіння, слабість, застої в області кишечника). На фоні лікування відмічено прогресування захворювання. 6.03.2000р. огляд проктолога: між прямою кишкою та піхвою виявлені рецидиви рака яєчника - пухлина 8,0х7,0см, в прямій кишці - пухлина 3,0х4,0см. 9.03.2000р. і 11.03.2001р. при мамографії діагностовано інфільтративний рак лівої молочної залози, стадія II Б (T2N1 M0) кл.гр.П, на протязі року прогресування не відмічено, стабілізація процесу. 5.03.2001р. Комп'ютерна томографія показала рецидиви рака яєчника (вузлові пухлини: справа 6,0х5,0см, зліва - 3,0х4,2см з кальцинозом - (ступінь кальцинації зростає); виявлено метастаз (1,0x1,0см) в правій долі печінки. В Інститут звернулася 20.03.2001р. в зв'язку з болями в печінці та кишечнику. Хворій було проведено вакцинотерапію за схемою: 7-кратно з інтервалом 7 діб в зростаючо-зменшувальному об'ємі - 1мл, 2мл, 3мл, 4мл, 3мл, 2мл, 1мл на один курс лікування, з повторним проведенням курсів через 1, 2, 3, 4, 5 , 6 місяців. Після проведення вакцинації стан хворої значно покращився, зникли болі в печінці та кишечнику, з'явився апетит, хвора почала набирати вагу, розвиток пухлинного процесу за даними рентгенологічного обстеження було зупинено, відмічена стабілізація процесу. На 04.07.03 хвора знаходилася під наглядом без проявів подальшого прогресування хвороби. Отже застосування протипухлинної вакцини для лікування онкологічних хворих, ви готовленої з ембріональної тканини та фільтрату культуральної рідини штаму B.subtilis B-7025, приводить до некрозу пухлин, стабілізації процесу захворювання, попередження рецидивів і метастазів, покращення якості та збільшення тривалості життя лікованих пацієнтів. Таким чином, результати ефективності лікування протипухлинною вакциною, що заявляється, свідчать про перспективність і доцільність застосування її для лікування онкологічних хвори х у яких неможливо одержати пухлинний матеріал для аутовакцини. Джерела інформації 1. Hoover H.C. Jr., Brandhorst J.S., Peters L.C., Surdyke M.G., Takeshita Y., Madariaga J., Muenz L.R., Hanna M.G. Jr. Adjuvant active specific immunotherapy for human colorectal cancer: 6.5-year median follow-up of a phase III prospectively randomized trial. J Clin Oncol 1993; 11(3): 390-9. 2. Vermorken J.B., Claessen A.M., van Tinteren H., et al. Active specific immunotherapy for stage II and stage III human colon cancer: a randomised trial. Lancet 1999;353(9150):345-50 3. Harris J.E., R yan L., Hoover H.C. Jr., et al. Adjuvant acti ve specific immunotherapy for stage II and III colon cancer with an autologous tumor cell vaccine: Eastern Cooperative Oncology Group Study E5283. J Clin Oncol 2000; 18(1):148-57 4. Затула Д.Г. Микроорганизмы, рак и противоопуъхолевый иммунитет. Киев: Наук.думка, 1985. - 248с. 5. Патент 10555 України, МПК А61К35/74. Спосіб специфічної імунотерапії онкологічних хворих після радикальної операції / Потебня ГП, Загадарчук НЛ, Ситенко ВК, Кикоть ВО; №93005385; Заявл. 5.08.93; Опубл. 11.10.99; Бюл №6. 6. Патент 57869 України. МПК7 А61К 35/12, 35/74 на винахід „Спосіб одержання протипухлинної аутовакцини" /Потебня ГП., Лісовенко ГС, Черемшенко НЛ., Танасієнко ОА.,Че хун ВФ. №2001064158; Заявл. 15.06.01; Опубл. 15.07.03; Бюл №7. 7. Coggin J.H., Andersson N.G. Embryonic and fetal antigens in cancer cells // In: Developmental aspects of carcinogenesis and immunity (Ed. T.King). -New York Acad Press. -1974. -P.173-175. 8. Coggin J.H., Andersson N.G. Cancer, differentiation and embryonic antigens -some central problems // Ad v.Cancer Res. -1974. - 19, N 1. -P. 105-116. 9. Girardi Α., Repucci P., Dierlam P. et. al. Prevention of simian virus 40 tumors by hamster fetal tissues: influence of parity status of donor females on immimogenecity of fetal tissues and on immune cell cytotoxicity // Proc.Nat.Acad.Sci.USA -1973. -70, N 1. - P.183-186. 10. Bauer H., Ignjatovic J., Rubsamen H. et. al. Transformation as sociated cell surface antigens in virus and chemically transformed avian cells // Med.Microbiol.Immunol. -19.77. - 164, N 1. - P.197-205. 11. Патент 47308 України, МПК7 А61К 35/74. „Спосіб специфічної імунотерапії хворих колоректальним раком". /Потебня ГП, Кикоть ВО, Колесник ОО, Лісовенко ГС, Черемшенко НЛ, Чехун ВФ. №2001117503 Заявл. 02.11.01. Опубл. 17.06.02. Бюл.№6,2002. 12. Hoover НС Jr, Surdyke Μ, Dangel RB, Peters LC, Harma MG Jr. Delayedcutaneous hypersensitivity to autologous tumor cells in colorectal cancer patients immunized with an autologous tumor cell: Bacillus CalmetteGuerin vaccine. Cancer Res 1984; 44(4): 1671-6.