Спосіб виготовлення гістологічних препаратів овоцитів і зигот ранніх стадій розвитку

1. Спосіб виготовлення гістологічного препарату овоцитів або зигот ранніх стадій розвитку, який включає підготовку біологічного матеріалу до фіксації шляхом відмивання його розчином цитрату натрію, розміщення на знежиреному предметному склі, видалення надлишків відмиваючої ріди 3 75953 4 досліджень, в парах формаліну, в фіксаторі Карповністю співпадали з ознаками заявленого спонуа. Для цього предметне скло з краплею білка, в собу не знайдено. середині якої знаходиться овоцит або ембріон, Це дозволяє зробити висновок про відповідщільно закривають у бюкс з абсолютним спиртом. ність заявленого технічного рішення критерію "ноВ парах абсолютного спирту крапля білка фіксувизна". ється 10-15 хвилин. Зафіксовану краплю білка В джерелах патентної і науково-технічної інобережно за допомогою скальпеля знімають з формації не знайдено відомостей про способи скла і вносять у 100° спирт на 15-20 хвилин. Потім виготовлення гістологічних препаратів овоцитів і матеріал переносять в спирт-ксилол (15 хвилин) і зигот ранніх стадій розвитку, які б містили ознаки, ксилол до повного просвітління. Просвітлені краплі що відрізняють заявлений винахід від прототипу: переносять в ксилол-парафін (1:1) на 12 годин і надлишки відмиваючої рідини усувають фільтрупотім заливають в парафін. Отримані препарати вальним папером, а в якості фіксатора використоготові для фарбування. вують 7-8%-ний розчин поліакриламідного гелю, Зазначений спосіб трудомісткий, вимагає триякий наносять на біологічний матеріал розміщений валої обробки досліджуваного матеріалу, дотрина предметному склі в дозі 0,05-0,1мл, при цьому, мання умов фіксації та заливання у парафін. Можчерез 20-25 хвилин, після полімеризації, препарат ливі артефакти, викликані фіксацією (зміни форми досліджують, а фарбування здійснюється попереі клітинних структур овоцитів та зигот). днім внесенням барвника в фіксатор. Запропонований нами спосіб передбачає приОтже, заявлене технічне рішення не випливає життєву фіксацію матеріалу в синтетичному сереявним чином з рівня техніки, що дозволяє зробити довищі - поліакриламідному гелі (7-8%-ному). При висновок про відповідність заявленого рішення цьому, спосіб забезпечує скорочення часу пригокритерію винаходу "винахідницький рівень". тування гістологічних препаратів високої якості, а Заявлений спосіб може бути використаний у поліакриламідний гель здатний проникати у клітигалузі біології та сільського господарства, а саме ни, не змінює структури і органели клітин, дозвогістології, репродуктивній біотехнології, досліляє проводити прижиттєве фарбування клітин, дженнях і оцінці овоцитів та зигот на ранніх стадіях шляхом внесення барвника безпосередньо в гель, розвитку в біотехнологічних центрах та господарсзабезпечує фіксацію протягом 20-25 хвилин. Одтвах з різними формами власності і тому відповіночасно предметне скло з полімером, в якому задає критерію "промислова придатність". фіксовані клітини або зиготи, служить гістологічТаким чином заявлене технічне рішення є ноним препаратом. вим промисловопридатним і має винахідницький В основу винаходу покладено завдання створівень, тобто відповідає всім умовам патентної рити об'єктивний, доступний і швидкий спосіб фікспроможності винаходу відповідно до [статті 7 росації та приготування гістологічних препаратів зділу II Закону України "Про охорону прав на винаовоцитів та зигот ранніх стадій розвитку. ходи і корисні моделі" (№1771-III, 2000p.)]. Технічний результат досягають тим, що надДля реалізації заявленого винаходу необхідно лишки відмиваючої рідини усувають фільтрувальприготувати поліакриламід-ний гель 7-8%-ної конним папером, а в якості гелеподібного фіксатора центрації. Овоцити або зиготи наносять на обезвикористовують 7-8%-ний розчин поліакриламіджирене предметне скло. При наявності "бруду" ного гелю, який наносять на матеріал, розміщений залишків клітин кумулюсу або середовищ культина предметному склі в кількості 0,05-0,10мл на вування, овоцити або зиготи ранніх стадій розвитодин препарат, витримують 20-25 хвилин для поку відмивають в 0,9%-ному розчині цитрату натрію, лімеризації і отримують гістологічний препарат для чого наносять декілька крапель даного розчидля досліджень, а фарбування препарату здійсну на предметне скло, переносячи послідовно клінюють внесенням барвників у фіксатор. тини з одної краплі чистого розчину в іншу. Після Спосіб ґрунтується на здатності поліакриламідосягнення бажаної чистоти матеріалу, який буде дного гелю проникати через мембрани овоцитів і фіксуватися, фільтрувальним папером видаляють зигот, полімеризуватись, утворюючи однорідний надлишок рідини та наносять на один препарат прозорий гель, який фіксує овоцити та зиготи. Од0,05-0,1мл (краплю) поліакриламідного гелю (7ночасно, предметне скло, на якому проведена 8%-ного) на овоцити або зиготи ранніх стадій розполімеризація гелю з клітинами служить гістологівитку. Через 20-25 хвилин гель полімеризується і чним препаратом. фіксує досліджуваний матеріал. Предметне скло При проведенні заявником патентнона якому проведена полімеризація гелю із зафікінформаційного пошуку знайдено технічне рішення сованими овоцитами або зиготами служить гістов якому є ряд суттєвих ознак спільних із заявленим логічним препаратом. ["Методических рекомендаций по культивироваДля підтвердження ефективності заявленого нию ооцитов и фолликулов коров" под. ред. Голуспособу в умовах лабораторії відтворення Інститубева А.К., Ленинград, ВНИИР и ГСЖ. 1989. 36с.] ту біології тварин УААН виготовлені гістологічні спосіб включає підготовку овоцитів і зигот до фікпрепарати овоцитів і зигот ранніх стадій розвитку сації, шляхом відмивання розчином цитрату надвома способами: заявленим і відомим (прототип). трію, видалення надлишків відмиваючої рідини, При виготовленні гістологічних препаратів фіксацію матеріалу в гелеподібному фіксаторі і враховувалася загальна тривалість виготовлення фарбування. препаратів, тривалість фіксації, кількість якісних Однак, даних суттєвих ознак не достатньо для препаратів (збереження форми та структур кліодержання технічного результату заявленого рітин). Отримані дані подані в Таблиці 1. шення. Технічних рішень, які б за сукупністю ознак 5 75953 6 Таблиця 1 Ефективність заявленого способу виготовлення гістологічних препаратів ооцитів і зигот ранніх стадій Показники, од. виміру Виготовлено препаратів, шт Якісних препаратів, шт Із них: збережена форма і структура, шт.: ооцитів зигот Тривалість виготовлення препарату, год Тривалість фіксації, хв Дані Таблиці 1 свідчать про перевагу заявленого способу перед прототипом. Про високу якість виготовлених за новим способом гістологічних препаратів ооцитів і зигот ранніх стадій свідчать наведені рисунки: 1) фіксація овоцитів і зигот ранніх стадій у суміші метанолу і льодяної оцтової кислоти (Фіг.1а, б, в, г) - виявлено втрату форми клітин, розрив клітинної мембрани, вихід вмісту клітини в позаклітинний простір. 2) фіксація у синтетичному середовищі 0,075мл (крапля) поліакриламідного гелю (7,5%ного) нанесена на овоцити і зиготу (бластоцисту; Фіг.2а, б, в) - форма і структури клітин збережені, Комп’ютерна верстка М. Ломалова Відомий спосіб (прототип) 120 80 53 27 12-12,5 45-60 Новий спосіб 170 165 64 101 0,4-0,5 20-25 добре видно ядро, клітинну мембрану, клітини кумулюс-гранульозного оточення овоцита. При фіксації зигот (бластоцисти; Фіг.2в) у синтетичному середовищі - 7,5%-ному поліакриламідному гелі форма збережена, розрізняємо окремі клітини зиготи. Таким чином, при візуальному порівнянні рисунків (препаратів) овоцитів і зигот ранніх стадій розвитку переважають за якістю отримані при використанні заявленого способу виготовлення гістологічних препаратів овоцитів і зигот ранніх стадій розвитку - фіксація у розчині поліакриламідного гелю. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601