Спосіб зберігання біосенсорів на основі ферментів

Спосіб зберігання біосенсорів на основі ферменту глюкозооксидази шляхом застосування низьких температур, який відрізняється тим, що біосенсори повільно охолоджують до -196°С в присутності 60% розчину гліцерину, після чого занурюють у рідкий азот і зберігають. (19) (21) a200512549 (22) 26.12.2005 (24) 25.09.2007 (46) 25.09.2007, Бюл. № 15, 2007 р. (72) Грищенко Валентин Іванович, Нардід Олег Анатолійович, Розанова Катерина Дмитрівна, Науменко Євгенія Йосипівна, Щетинський Мирослав Ігорович, Дзядевич Сергій Вікторович, Солдаткін Олексій Петрович, Єльська Ганна Валентинівна (73) ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ, ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ 3 80485 4 вали відгуки відповідних біосенсорів на додавання індикатор термомеханічної напруги, характеризу1мМ розчину глюкози, що є тестом на біологічну ється більш високою інтенсивністю у системах, активність глюкозооксидази. За результатами, схильних до кристалізації, ніж у системах, що наведеними у таблиці (8,10), величини відгуків склуються. 60% концентрація гліцерину не є токсичною у порівнянні з більшими концентраціями, і співпадають у межах похибки експерименту (63±7 водночас дозволяє зменшити конформаційні зміни та 65±8, відповідно). і зберегти ферментативну активність. Крім того, Приклад 2 витримування біосенсорів, де ферменти знахоБіосенсори на основі глюкозооксидази готувадяться в іммобілізованому стані на поверхні фізили згідно прикладу 1. Зберігали протягом 6 місяців чного перетворювача, з кріопротектором такої і 1 року за заявленим способом і за прототипом концентрації також не оказує токсичної дії на фер(Табл.8-12) Як показали наші дослідження, після мент (Табл., 1-3). Швидке заморожування біосенперших двох додавань 1 мМ розчину глюкози весорів до -196 °С є руйнівним у порівнянні з повільличини відгуків біосенсорів (Табл.8, 9) співпадають ним (Табл., 4, 5). Результати цих досліджень було в межах похибки експерименту (63±7 та 60±8, відпокладено в основу винаходу. повідно), але після наступних додавань (Табл.10) Спосіб пояснюється наступними прикладами. відгук був зовсім відсутній, в той час, як біосенсоПриклад 1 ри, що зберігалися за температур рідкого азоту, Дослідження проводили, використовуючи біозалишались у робочому стані навіть при більш ніж сенсори на основі глюкозооксидази. Іммобілізацію 30 додавань (Табл.8). Після зберігання біосенсорів глюкозооксидази на поверхню фізичного перетвопри вищезгаданих умовах, біосенсори, що зберігарювача біосенсорів проводили в БСА (бичачий лися протягом 1 року при +4°С за прототипом сироватковий альбумін) мембрані у насичених (Табл.12), перестають повністю працювати (відгук парах глутарового альдегіду (ГА) протягом 25відсутній), в той час, як величина відгуку біосенсо30хв., після чого біосенсори зі сформованими біорів, що зберігалися 1 рік за температур рідкого мембранами занурювали на 20-30хв. у 10мМ фоазоту (Табл.11), співпадає з величиною відгуку сфатний буфер для відмивки від залишків ГА і біосенсорів, що зберігалися протягом 6 місяців стабілізації базового сигналу. Для проведення (Табл.8). вимірювань біосенсори занурювали у комірку об'Приклад 3 ємом 2мл з 10 мМ фосфатним буфером, рН 7.4. Біосенсори на основі глюкозооксидази готуваРеєстрацію відгуків біосенсорів на додавання 1 мМ ли згідно прикладу 1. Для порівняння заморожурозчину глюкози проводили за експериментальвання з 60% розчинами гліцерину (Табл.6) і 1,2 ною схемою установки для роботи з кондуктометпропандіолу (Табл.7) біосенсори занурювали в ричними ферментними біосенсорами [5]. Зроблені окремі пластикові контейнери, після чого повільно і протестовані біосенсори, після повільного замо(1-5°С/хв.) заморожували до -196°С. За результарожування з 60% розчином гліцерину до -196°С, тами, наведеними у Таблиці, більш ефективним занурювали у рідкий азот низькотемпературного для подальшого зберігання біосенсорів на основі сховища. Після зберігання протягом 6 місяців і 1 глюкози було використання 60% розчину гліцерироку біосенсори повільно відігрівали на водяній ну. бані при +20 °С, та 3-разово відмивали у 10мМ фосфатному буфері протягом 30 хв. Далі вимірюТаблиця Вплив швидкості заморожування, кріопротекторів, та умов зберігання на величину відгуку біосенсорів Зразки досліджень 1. Контроль 2. + 60% розчин гліцерину 3. + 60% розчин 1,2 пропандіолу 4.Швидке заморожуваня без кріопротектора до -196°С 5.Повільне заморожуваня без кріопротектора до -196°С 6.Повільне заморожуваня з 60% розчином гліцерину до -196°С 7.Повільне заморожуваня з 60% розчином 1,2 пропандіолу до -196°С 8. Зберігання протягом 6 місяців у рідкому азоті з 60% розчином гліцерину після повільного заморожування і відігріву (1-30 додавань). 9. Зберігання протягом 6 місяців при +4°С після перших двох додавань 10. Зберігання протягом 6 місяців при +4° С після наступних додавань 11. Зберігання протягом 1 року у рідкому азоті з 60% розчином гліцерину після повільного заморожування і відігріву 12. Зберігання протягом 1 року при + 4°С Відгук біосенсора, % 100±3 91±5 95±5 0 23±4 68±7 46±7 63±7 60±8 0 65±8 0 5 80485 6 1993-1999. Джерела інформації: 4. A.S.Santos, et.al. Hyghly table amperometric 1. Авторське свідоцтво СРСР № 943280, bioenor for ethanol based on Meldola's blue adsorbed C12N11/00, А61К37/48, 1982. on silica gel modified with niobium oxide// Journal of 2. Y.I. Korpan, S.V. Dzyadevich, V.P. Zharova, Electroanalytical Chemistry.- 2003.-347.-P.135-142. A.V. El'skaya Conductometric biosensor for ethanol 5. О.П.Солдаткін Розробка наукових та техноdetection based on whole yeast cells// Укр. біологічних засад створення електрохімічних біосенхім.журн.-1994.-66, №1.-Р.78-82. сорів для потреб медицини, біотехнології та охо3. P.V. Climent, M.L.M. Serralheiro, M.I.F.Rebelo рони навколишнього середовища.Development of a new amperometric biosensor Дис.докт.біол.наук.- Київ, 1998.-С.88. based on polyphenoloxidase and polyethersulphone membrane // Pure Appl. Chem. 2001.-V.73, №12.-Р. Комп’ютерна верстка В. Клюкін Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601