Спосіб іммобілізації ферментів у біосенсорах з використанням фотополімерного матеріалу

Спосіб іммобілізації ферментів у бюсенсорах з використанням фотополімерного матеріалу, який включає полімеризацію впливом ультрафіолетового випромінювання на суміш фермен Винахід відноситься до біотехнологм і може бути використаний для іммобілізації ферментів на поверхні трансдюсера бюсенсора для використання його в медичних, лабораторних дослідженнях, а також у харчовій, ХІМІЧНІЙ та інших галузях виробництвах Відомо велика КІЛЬКІСТЬ способів іммобілізації біологічних компонентів, у тому числі і ферментів, на поверхні трансдюсерів Найбільш широко застосованим способом іммобілізації біологічних компонентів є прищеплення ферменту до матриці з бичачого сироваткового альбуміну (БСА) за допомогою глутарового альдегіду (ГА) Мається досить велика КІЛЬКІСТЬ варіацій цього способу, один з них полягає в наступному готують розчин 20мМ фосфатного буфера рН7,4, що містить фермент (уреаза з активністю 12МО/мг) і БСА в концентраціях 50мг/л, гліцерол 25мг/л Краплю цього розчину (0,1 мкл) поміщають на попередньо підготовлену чутливу область сенсорного чіпу Потім чіп поміщають в насичений пар ГА на ЗОхв [О A Boubnak, A P Soldatkm, NF Starodub et al Determination of urea in blood serum by urease biosensor based on an ion-sensetive field-effect transistor // Sensor and Actuators В 1995 26-27 P 429-431] Недоліком цього способу, як і інших способів хімічної іммобілізації, є значне зниження активності біологічного матеріалу в процесі іммобілізації під впливом ГА, необхідність швидко використати виготовленний розчин через зменшення біологічної активності при збереженні, а також можлива необхідність у попередньої силанізацм поверхні при ту та рідкої фотополімеризаційноздатної композиції (ФПК) мономер-олігомерного типу, який відрізняється тим, що як основний гідрофільний компонент ФПК включає N-вшілпіролідон, а також в суміш додають гідрофобні компоненти олігокарбонатметакрилат та олігоуретанакрилат, при цьому ФПК виготовлюють у наступній ПОСЛІДОВНОСТІ змішують N-вшілпіролідон з водним розчином ферменту, який іммобілізують, а після вилучення води додають олігокарбонатметакрилат, олігоуретанакрилат та фотоініціатор використанні кремнієвої підкладки сенсора Відомий спосіб іммобілізації ферментів у водорозчинному полівінілпірролідоні (ПВП) (мол маса 10-200кДа), що зшивається за допомогою 2,5-біс-(4'-азидо-2'-сульфобензо)-циклопентанону натрію під впливом ультрафіолетового опромінювання, який полягає в тому, що водний розчин, який містить (по масі) 2-20% ПВП, 0,5-1,5% 2,5-біс(4'-азидо-2'-сульфобензо)-циклопентанону натрію, 5,0-7,5% р-глюкозооксидази, наносять на поверхню затвора юночутливих польових транзисторів, висушують суміш, опромінюють УФ-промінями високовольтної ртутної лампи (250Вт) завдовжки 2хв Потім, З метою зшивки молекул ферменту для збільшення механічної ЩІЛЬНОСТІ, отриману полімерну мембрану обробляли розчином 25% глутарового альдегіду завдовжки Юхв, потім занурювали в розчин 0,1 М гліцину для знешкодження вільних альдегідних груп Область визначення глюкози складає 0-5,5мМ (при рН5,5) За допомогою цього способу також здійснювали іммобілізацію ліпази й уреази Недоліками цього способу є тривалість здійснення та необхідність обробробки ферментів двома агресивними агентами, що знижує їхню активність (УФ-випромшення, глутаровий альдегід) [Патент СІЛА № 4894339, МПК C12N 11/04, опубл 16 01 1990р] Відомий принципово інший тип іммобілізації бюматериалу - із застосуванням фізичних методів Перевагою його перед ХІМІЧНИМ методом є істотно вища ступінь збереження активності, а до ю C O ^О (О 60435 недоліків - часто термін їхньої роботи набагато менше, ніж у випадку використання чисто ХІМІЧНИХ методів Відомий також спосіб одержання іммобілізованих ферментів, у якому використовується органічний носій - хемосорбційне волокно на основі сополімеру акрилонітрилу з 2,5-вінілпірідшом (промислова марка ВІОН АН-1), що обробляється водяними розчинами різних ферментів - лужна фосфатаза, пероксидаза, папаш, а-хімотрипсин КІЛЬКІСТЬ ферменту, адсорбуємого даним волокном, у залежності від природи ферменту, концентрації його в розчині і від часу адсорбції, складає 1,2-17 мг/м Активність іммобілізованих ферментів становить 45 - 75% від нативної величини Перевага даного способу в простоті методики, відсутності попередньої активації й інших готувань, найвища залишкова активність, а недоліками - тривалий час адсорбції (до 7 діб), порівняно швидкий час напівінактивацм (від 14 діб), і порівняно мала КІЛЬКІСТЬ іммобілізованого ферменту (для визначеного роду задач, зокрема бюсенсорики) [Патент РФ № 2054481, МПК C12N 11/08, опубл 20 21 1996 р] За прототип, як найбільш близький за технічною сутністю, вибрано спосіб іммобілізації ферментів на поверхню трансдюсера бюсенсора із застосуванням рідкої фотополімеризаційноздатної композиції (ФПК) як іммобілізаційного матриксу [Munoz J , Jimenez С , Bratov A Photosensitive polyurethanes applied to the development of CHEMFET and ENFET devices for biomedical sensing // Biosensors & Bioelectronics 1997 12 N7, P 577-585] В даному прототипі запропоновано спосіб іммобілізації уреази на поверхню затвору юн-чутливого польвого транзистора (ІЧПТ) із застосуванням ФПК в якості іммобілізаційного матриксу Спосіб здійснюється наступним чином Поверхня рН-чутливої області польового транзистора, що складається з нітриду кремнію, попередньо оброблялася метакрилоксипропілтиметоксисіланом ФПК складається з уретанакрилатного олігомеру, трипропиленглікольдіакрилата (розчинник) і фотоініціатора (ФІ) Розчин уреази у деюнизованній воді додають до ФПК і ретельно перемішують в ультразвуковій ванні, щоб отримати фотополімерізаційну суміш (ФПКС) Потім проводиться нанесення отриманої суміші на поверхню затвору ІЧПТ, швидке обертання з метою зменшення товщини нанесеної ФПКС, покриття захисною лавсановою плівкою і наступна полімеризація композиції під впливом УФ-опромшення (365нм) з потужністю 22мВт/см2 у два етапи з використанням фотолітографічних масок Спочатку проводиться полімерізація ФПКС тільки на поверхні затвора, а потім у навколишній області ФПК Задачею винаходу є розробка способу іммобілізації ферментів у бюсенсорах з використанням фотополімерного матеріалу Поставлена задача вирішується тим, що у способі іммобілізації ферментів у бюсенсорах з використанням фотополімерного матеріалу згідно з винаходом як основний компонент ФПК включає гідрофільний N-вшілпіролідон, а також в суміш додають гідрофобні компоненти - олігокарбонатметакрилатта олігоуретанакрилат, при цьому ФПК виготовлюють у наступній ПОСЛІДОВНОСТІ змішують N-вшілпіролідон із водним розчином ферменту, який іммобілізують, а після вилучення води додають олігокарбонатметакрилат, олігоуретанакрилат та фотоініціатор Тобто, основним компонентом ФПК застосовується N-вшілпіролідон - рідка сполука з необхідним гідрофільно-гідрофобним балансом, яка змішується з водними розчинами, але в той же час здатна розчиняти ІНШІ гідрофобні компоненти, які входять до складу ФПК, водний розчин ферменту змішується с основним компонентом на початковій стадії приготування ФПК шляхом механічного змішування, потім проводиться вакуумна сушка для виведення води, наступне внесення в ФПК додаткових складових, що забезпечують необхідні фізикомеханічні та ХІМІЧНІ властивості полімеру, що утворюється, а потім механічне змішування, отримана ФПК має низьку в'язкість, нанесення на поверхню трансдюсера ФПКС простою дозацією необхідна товщина мембрани обумовлена КІЛЬКІСТЮ нанесеної суміші, УФ-опромшення ФПК проводиться в вакуумі Недоліком цього способу є його надзвичайна складність, яка пов'язана з багатостадійністю, тобто необхідність попередньої сіланізацм напівпровідникової поверхні, використання речовин, що розріджують композицію, застосування ультразвуку для перемішуванні композиції (що, як правило, веде до зниження активності ферментів), використання швидкого обертання для отримання необхідної товщини мембрани, захисної лавсанової плівки, фотолітографічних масок та двостадійність процесу фотополімеризації ІЧПТ, які використовуються в роботі, виготовлені в Інституті бюкібернетики і бюмедицини ПАН, Варшава, чутливість 45-48мВ/рН На очищену поверхню затвора ІЧПТ і прилягаючу область наносять приблизно 0,25мкл ФПКС, чіп поміщають у вакуум (0,1-0,2мм рт ст) на 10 хвилин (з метою видалення з композиції розчиненого кисню) Далі композицію опромінюють УФсвітлом протягом 11 хвилин з інтенсивністю світлового потоку на поверхні, що опромінюється, 2,6Вт/м у спектральній області Я,=300-400нм Приклад 1 Отримання бюсенсора на основі ІЧПТ для визначення концентрації сечовини з іммобілізованою уреазою в полімерному матриксі на основі ФПК Композиція ЯВЛЯЄ собою рідину, за в'язкістю порівнянну з водою і виготовляється в наступній ПОСЛІДОВНОСТІ водний розчин уреази (з активністю 200МО/мг) змішують з ВП, потім при кімнатній температурі при безперервному перемішуванні проводять вакуумне сушіння (5мм ртст) з метою видалення води Далі до суміші ферменту з ВП додають ОУМ-2000Т, ретельно перемішують і додають залишок ОКМ-2 і ФІ Після ретельного перемішування іммобілізаційна суміш готова до застосування Композиція має кінцевий склад 78мас % N-вшілпірролідону (ВП, основний гідрофільний матрикс), Юмас % олигокарбонатметакрилату (ОКМ-2, поперечнозшиваючий агент), 10% олигоуретанметакрилату (ОУМ-2000Т, поперечнозшиваючий та збільшуючий адгезію полімеру агент), 2мас % ФІ (2-пдроксі-2-метил-1-фенілпропан-1ону) 60435 Джерелом УФ-віпромшення служила лампа ЛУФ80-04 Бюсенсор ЛІНІЙНИЙ діапазон відгуку Кут нахилу кривої Загальна тривалість аналізу Спад ВІДПОВІДІ за 7 днів роботи Розроблений 0,05-20мМ 38мВ/рС 5-1 Охв 4% Дана композиція та одержуваний на її основі полімер мають необхідне співвідношення пдрофільно-гидрофобних властивостей, необхідних для однорідності при перебуванні в їх складі ферменту, а утворений полімер має достатню адгезію до напівпровідникової поверхні сенсора (полімерна плівка трималася на поверхні затвора ІЧПТ на протязі декількох МІСЯЦІВ при збереженні сенсора в буферному розчині при 4°С) Вивчення відгуків бюсенсорів, мембрани яких були отримані зі свіжої композиції і з виготовленої за 46 днів раніше (яка зберігалася протягом цього часу в темному МІСЦІ при 2°С) показало, що розходження в інтенсивності відгуків практично відсутні Цей експериментальний факт указує на перспективність застосування композиції в умовах промислового виготовлення сенсорів з іммобілізованої уреазою Заздалегідь приготовлена фотополімерна композиція може тривалий час використовуватися в процесі фотолітографічного формування біологічно активної мембрани бюсенсорів Причому цей процес може бути технологічним продовженням виготовлення ІЧПТ, використовуючи основні підходи інтегральної електронної технології Приклад 2 Отримання бюсенсора на основі ІЧПТ для визначення концентрації глюкози з іммобілізованою глюкозооксидазою в полімерному матриксі на основі ФПК Фермент р-глюкозооксидаза (з активністю 160МО/мг) додавався в ФПК КІЛЬКОСТІ Змас % у перерахуванні на готову композицію, склад ФПКта спосіб іммобілізації аналогічні вищевказаному сенсору на сечовину Відгук сенсора на глюкозу в 1мМ натрій-фосфатному буфері, рН7,0 відображено в табл 2) Отриманий бюсенсор на глюкозу має наступні характеристики область ЛІНІЙНОГО відгуку 0,1-ЮмМ, нахил кривої 30мВ/рС, час відгуку 1015хв Таблиця 2 Концентрація глюкози, мМ 0 01 0 02 0 05 01 02 05 1 2 5 10 20 Деякі характеристики розробленого нами сенсора (в порівнянні з прототипом) наведені в Таб 1 Таблиця 1 Відгук сенсора, мВ 0 0 3 5 12 18 25 34 48 57 58 Розрахунок величини Км для іммобілізованої Прототип 0,2-бмМ бЗмВ/рС 1-2хв 7,5% Р- глюкозооксидази показав, що вона складає 3,1 мМ (Км для нативного ферменту складає 6,66мМ) Приклад 3 Отримання бюсенсора на основі ІЧПТ для визначення концентрації пероксиду водню з іммобілізованою пероксідазою в полімерному матриксі на основі ФПК З застосуванням ФПК в якості іммобілізаційного матриксу для пероксідази був виготовлений сенсор на пероксид водню За основу дії сенсора взятий принцип окислювання пероксидом водню аскорбінової кислоти за допомогою пероксідази Утворена в процесі реакції депдроаскорбінова кислота не має кислотних властивостей, що приводить до підвищення рН Додавали пероксидазу хрону (з активністю 275МО/мг) у КІЛЬКОСТІ 0,5мас % до ФПК, склад ФПКта спосіб іммобілізації аналогічні вищевказаному сенсору на сечовину (Приклад 1) Виміри проводили в ЮмМ натрій-фосфатному буфері, рН7,0, у присутності ЮмМ аскорбінової кислоти Відгук на 5мМ пероксид водню складає 23-25мВ Приклад 4 Отримання амперометричного бюсенсора для визначення концентрації пероксиду водню з іммобілізованою пероксідазою в полімерному матриксі на основі ФПК З застосуванням ФПК в якості іммобілізаційного матриксу для пероксідази був виготовлений амперометричний сенсор на пероксид водню За основу дії сенсора взято принцип окислення пероксидази пероксидом водню та наступньому востановленню пероксидази на робочому електроді Використовували трьохелектродну конструкцію електрохімічної ячейки Напруга на робочому електроді складала -150мВ відносно хлорсрібляного електрода порівняння Пероксидазу хрону (з активністю 275МО/мг) іммобілізували на вугільному робочому електроді, ФПК складалась з ВП, ОКМ-2 та ФІ (88, 10 та 2мас % % ВІДПОВІДНО), КІЛЬКІСТЬ фе рмента у ФПК складала 0,5мас % Іммобілізацію фермента проводили за спосібом, який описано у Прикладі 1 Отримана чутливість 2-106М, область ЛІНІЙНОГО відгуку 5-10 6 -10 4 М Н2О2 Відгук на 10 5 М пероксиду водню складав 400нА На протязі місяця не спостерігалось значимого спаду відгуку сенсора Для технологічного застосування даного способу є наступні переваги в'язкість ФПК, що дозволяє виключити застосування розчинників і речовин, що розріджують, пластифікаторів, наступних операцій з нанесеною на затвор композицією (центрифугування) для створення необхідної товщини майбутньої мембрани, однорідність (що забезпечує необхідні механічні й адгезивні властивості бюмембрани), що досягається застосуван ням в якості основного компоненту ФГЖ рідкої речовини з гідрофільними властивостями Через перераховані властивості нанесення композиції з бюматеріалом на затвор польового транзистора чи трансдюсера бюсенсора іншої природи може бути спрощене до одностадійного процесу, а товщину одержуваної бюмембрани можна буде регулювати зміною КІЛЬКОСТІ суміші, що наноситься на затвор Також необхідно відзначити достатні адгезивні властивості бюмембрани, що дозволяє відмовитися від попередньої хімічної модифікації поверхні трансдюсера Таким чином, технічний результат, якого можна досягти при використанні винаходу, є те, що Комп'ютерна верстка С Волобуєв 60435 8 спосіб, що пропонується для готування іммобілізаційного матриксу ензимосенсорів, приводить до спрощення процедури іммобілізації, і у той же час одержані бюсенсори мають ряд переваг (чутливість, тривалий термін використання) перед бюсенсорами, які виготовляли іншими способами Запропонований спосіб отримання чутливої мембрани бюсенсора з використанням рідкої фотополімеризаційноздатної композиції може бути використаний як у наукових лабораторіях при виготовленні прототипів бюсенсорів, так і при промисловому виготовленні (що повинно дозволить знизити вартість виготовлення бюсенсорів) Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119