Спосіб імуноферментного визначення антитіл до вірусу лейкозу великої рогатої худоби

Спосіб імуноферментного визначення антитіл до вірусу лейкозу великої рогатої худоби, що містить нанесення культури клітин FLK, що продукує вірус лейкозу, на твердофазний носій до виникнення моношару, інкубацію з дослідною біологічною рідиною, внесення субстрату та визначення продуктів пероксидазної* реакції, який відрізняється тим, що використовують гель-фільтрування для видалення з лізату вірусу найбільш активних антигенних білків. Корисна модель, що передбачається, відноситься до ветеринарної вірусології та біотехнології та може бути використана для визначення антитіл до вірусу лейкозу великої рогатої худоби (ВРХ). Лейкоз набув великого розповсюдження, спричиняє економічні збитки тваринництву. Лейкоз ВРХ - хронічне інфекційне лімфопроліферативне злоякісне захворювання. Для діагностики лейкозу використовують різні способи. Так, існує спосіб визначення антитіл до вірусу лейкозу великої рогатої худоби [А.С. №1489000. от 12.05.86, кл А61В10/00 "Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота"] В цьому рішенні хворобу визначають по відношенню рівня синтезу ДНК в одній частці до цього ж показника у другій частці. Недоліком цього способу є те, що його неможливо використовувати для визначення антитіл до вірусу лейкозу ВРХ у біологічних розчинах. Є спосіб імуноферментного визначення антитіл до вірусу лейкозу ВРХ [SU №1631434 от 02.02.89. кл. G01 N33/53 "Способ иммуноферментного определения антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота", заявитель Институт биохимии АН Лит ССР]. Це рішення може бути прототипом За цим способом ІФА визначення антитіл до вірусу лейкозу ВРХ виконують таким чином: наносять культуру клітин FLK на твердофазний носій до виникнення моношару, шкубують з дослідною біологічною рідиною, вносять субстрат та визначають продукти пероксидазної реакції. Недоліком цього рішення є те, що він поступається за специфічністю та чутливістю до запропонованого способу. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб імуноферментного визначення антитіл до вірусу лейкозу великої рогатої худоби, що містить нанесення культури клітин FLK, що продукує вірус лейкозу на твердофазний носій до виникнення моношару, інкубацію з дослідною біологічною рідиною, внесення субстрату та визначення продуктів пероксидазної реакції шляхом використання гель-фільтрування для видалення з лізату вірусу найбільш активних антигенних білків, щоб забезпечити спосіб імуноферментного визначення антитіл до вірусу лейкозу великої' рогатої худоби. Спосіб виконується таким чином Видаляють лейкозний антиген з культурального середовища клітин FLK, що продукують вірус лейкозу. Після нанесення ПЕГу осад віддаляють від рідини центрифугуванням Осад ресуспендують у забуференому фізіологічному розчині. Отриману суспензію антигену ВЛ ВРХ, для надання їй гомогенності, було оброблено ультразвуком на дезінтеграторі протягом 5 хвилин при частоті 22кГц. Для осадження клітинних уламків та денатурованого білка використовували центрифугування при 10000об/хВ (5000д) протягом 30хв. (О о 00 5806 Антиген, отриманий шляхом осадження із культуральної рідини клітин FLK поліетилен гліколем, зазначеним вище способом, нашаровували на 25% розчину сахарози. Центрифугували 120хв. При 25000об/хв (76000д) в бакетроторі MSE 6х16,5мл Осад ресуспендували в мінімальній кількості ТСЕ буферу. В вірусну суспензію вносили Тритон Х-100 до кінцевої концентрації 0,8% та інкубували при +4°С 16 годин. Після інкубування вірусний препарат центрифугували при 4000об/хв (ЮООд) 5хв., надосад фільтрували крізь Міііроге з діаметром пор 0,65мкм. Антигенну суміш фільтрували крізь колонку з ТоуогеагІ 40 F, яка попередньо була відкалібрована розчинами білків з відомою молекулярною вагою, урівноваженої ТСЕ буфером з додаванням 0,1% Тритон Х-100. Матеріал, що виходив з колонки, сканували крізь оптичний монітор при довжині хвилі 280 нм. Фракція, молекулярна вага якої була в межах 40000-66000 дальтон, була використана як антиген для постановки ІФА Спосіб підтверджується слідуючими прикладами Приклад 1 Для виділення лейкозного антигену з культурального середовища клітин FLK, що продукують вірус лейкозу, був внесений 50% розчин ПЕГу до кінцевої концентрації 1 1 % . Через 16 годин після внесення ПЕГу осад був відділений від рідини центрифугуванням при 3000об/хв (450д) 30хв. Осад ресуспендували в забуференому розчині, в об'ємі 1/100 від початкового. Отримана суспензія була оброблена ультразвуком частотою 22кГц, експозицією 5хв. Для осадження клітинних уламків Комп'ютерна верстка Д Шеверун та денатурованих білків вірусний матеріал центрифугували при 10000об/хв. (5000д) 30хв. Подальшу очистку вірусного матеріалу проводили ультрацентрифугуванням при 17000об/хв (35000д) 60хв. Крізь 20% розчин сахарози. Осад ресуспендували у TSE буферного розчину рН - 7,2 Для видалення антигенних білків з молекулярною вагою 51000 у вірусну суспензію додавали Тритон X100 до кінцевої концентрації 0,8% з послщуючим гель-фільтруванням крізь колонку ТоуреагІ-40 Фракцію в якій знаходились білки з молекулярною вагою 5000-60000 дальтон. використовували як лей коз ний антиген Приклад 2 У лунки планшету для ІФА зносили антигенний препарат, розведений карбонатно-бікарбонатним буфером рН 9,2-9,5 по ЮОмкл. Антиген видаляли. Після ЧОГО В лунки зносили 250мкл блокуючого розчину - 1% розчин яєчного альбуміну на промивочному розчині (0,05% Твін-20 на ФСБ) Інкубували бОхв при температурі 37-38°С. Розчин видаляли та лунки тричі промивали промивочним розчином Вносили по ЮОмкл дослідних та контрольних сироваток Інкубували бОхв при температурі 37-38°С Подальшу процедуру імуноферментного аналізу проводили за загальноприйнятою методикою. Спосіб імуноферментного визначення антитіл до вірусу лейкозу великої рогатої худоби є ефективним при діагностиці цієї хвороби Підписне Тираж 28 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Глазунова, 1, м Київ-42, 01601