Спосіб одержання біополімеру-гетерополісахариду

Спосіб одержання біополімеругетерополісахариду шляхом культивування мікроорганізму-продуцента, який передбачає приготування поживного середовища, стерилізацію, ферментацію, який відрізняється тим, що як мікроорганізм-продуцент використовують культуру Arthrobacter sp. 1702 Л, депоновану в колекції Інституту мікробіології і вірусології НАН України під номером ІMB Ас-5010, а культивування проводять в 2 стадії C2 2 (19) 1 3 82135 гетерополісахарид, до складу якого входять глюкоза, галактоза, маноза, рамноза, піровиноградна кислота, жирні кислоти. Основним недоліком штаму - прототипу є невеликий рівень накопичення гетерополі-сахариду та нестабільність процесу ферментації в промислових ферментерах, нестабільність показника відносної в'язкості. Відомі аналоги препарату - Етаполан, Емульсан. Метою даного винаходу є розробка способу одержання біополімеру-гетерополісахариду з високим виходом цільового високомолекулярного продукту в промислових умовах, збільшенням відносної в'язкості, зниженням тривалості процесу ферментації, з характеристиками біополімеру, які дадуть можливість розширити галузі його практичного використання. Поставлена задача вирішується таким чином, що біополімер гетерополісахарид одержують шляхом культивування мікроорганізма -продуцента, який передбачає приготування поживного середовища, стерилізацію, ферментацію, при цьому в якості мікроорганізма - продуцента використовують штам Arthrobacter sp. 1702 Л, депонований в колекції Інституту мікробіології і вірусології Н АН України під номером 1MB Ас - 5010, а культивування проводять в 2 стадії - вирощування посівного матеріалу для ферментеру в кількості 5-10% від об'єму поживного середовища в ферментері та ферментація при температурі (24-32)°С, постійному перемішуванні, аерації повітря 0,21,0м 3 на 1,0м 3 середовища за хвилину, протягом 12-15 годин для посівного матеріалу та 30-50 годин для ферментації, при рН середовища початковому 5,5-8,0 на стерильному збалансованому поживному середовищі, яке містить мінеральні солі (амоній азотнокислий, залізо сірчанокисле, калій фосфорнокислий, кальцій хлористий, магній сірчанокислий, натрій фосфорнокислий), дріжджі пекарні або кормові, крохмаль кукурудзяний або спирт етиловий, екстракт кукурудзяний, вода питна. Культуральну рідину, яку одержують, піддають плазмолізу при температурі (60 - 80)°С протягом 20-40 хвилин. Після закінчення процесу ферментації одержують культуральну рідину з вмістом гетерополісахариду, котрий також є єкзополісахаридом, 8,0-20,0г/л, відносною в'язкістю 3,0-5,0 умовних одиниць. Середня тривалість вирощування посівного матеріалу в інокуляторі 12-15 годин, культивування в ферментері - 30-50 годин, що значно вигідніше відомих способів - витрати енергоресурсів менші майже у 2 рази. Біополімер, який одержаний в процесі ферментації, є ацильованим аніонним розгалуженим гетерополісахаридом, який складається з залишків глюкози, манози, рамнози, що заміщені залишками піровиноградної кислоти у вигляді кеталя і стереофікованими жирними кислотами. Вказаний біополімер стійкий в умовах кислотного гідролізу, також в'язкість розчинів підвищується в присутності одно- та двовалентних катіонів. Молекулярна маса - (8-20) х 105 D. 4 Штам Arthrobacter sp. 1702 Л, депонований в колекції Інституту мікробіології і вірусології НАН України під номером 1MB Ac - 500 11.11.2002 р., одержано методом направленої селекції із ґрунтів за ознакою більш високого синтезу полісахариду, наявності жирних кислот в синтезуємому ГПС, сукупності унікальних властивостей. Штам зберігають на м'ясо-пептонному агарі під вазеліновим маслом при температурі 4°С протягом 1,5 року. Запропонований штам має такі культуральноморфологічні та фізіолого-біохімічні ознаки: Культурально-морфологічні ознаки: клітини нерухомі, грамваріабельні. Спороутворення відсутнє. Клітини мінливої форми - сферичної, паличкоподібної. В логарифмічній фазі росту клітини мають форму палички розміром (0,8-1,7 х 1,5-2,5)мкм, розташовані попарно, інколи поодиноко. В стаціонарній фазі росту - мікрококова форма розміром 0,8 -1,2мкм. На другу добу культивування формується добре виражена капсула. Фізіолого-біохімічні ознаки: облігатний аероб, прототроф. Температура росту (10-40)°С. Оптимум (24-32)°С. Желатин не розріджує, молоко не згортає. Потребує додаткові фактори росту амінокислоти. Використовує амонійний азот, сечовину, пептон. Асимілює глюкозу, фр уктозу, арабінозу, манозу, етанол, ацетат, піруват, фумарат. Чутливий до антибіотиків тетрациклінового ряду. Штам непатогенний. Активність (продуктивність) штаму - здатність накопичувати гетерополісахарид. Метод визначення продуктивності - гравіметричний; визначають вагу полісахариду, виділеного із культуральної рідини шляхом осадження етанолом та висушеного до постійної маси. Помітний ріст та біосинтез гетерополісахариду можливий при рН 5,5 -8,0, оптимальні умови рН 6,0 - 7,5 Отримання гетерополісахариду з використанням штаму Arthrobacter sp. 1702 Л відбувається наступним чином: культур у вирощують на середовищі, яке містить джерело вуглецю, азоту та мікроелементи (крохмаль кукурудзяний або глюкоза, амоній азотнокислий, калій фосфорнокислий однозаміщений, магній сірчанокислий, натрій фосфорнокислий двозаміщений, залізо сірчанокисле, дріжджі пекарні). В якості вихідного матеріалу використовують 1-2-х добову культур у, що виросла на середовищі з сусло-агаром при температурі (27±2)°С. Розмноження культури проводять у колбах ємністю 750мл з 150мл середовища (за складом, аналогічним ферментаційному середовищу) при (27±2)°С в умовах аерації на качалках (220-240)об/хв. протягом 24-48 годин. Посівний матеріал асептично вносять в посівний апарат зі стерильним поживним середовищем для вирощування посівного матеріалу для ферментеру в кількості 5-10% від об'єму поживного середовища в ферментері. Із посівного апарату посівний матеріал стерильно передають в ферментер зі стерильним поживним середовищем 5 82135 для одержання культуральної рідини з вмістом біополімеру-гетерополісахариду. Параметри культивування: температура (24-32)°С, постійне перемішування, аерація 0,2-1,0м 3 повітря на 1,0 м 3 середовища за хвилину, протягом 12-15 годин для посівного матеріалу та 30-50 годин для ферментації. рН початковий 5,5 -8,0. Культуру вирощують на стерильному збалансованому поживному середовищі, яке містить мінеральні солі (амоній азотнокислий, залізо сірчанокисле, калій фосфорнокислий, кальцій хлористий, магній сірчанокислий, натрій фосфорнокислий), дріжджі пекарні або кормові, крохмаль кукурудзяний або спирт етиловий, екстракт кукурудзяний, воду питну. При цьому в процесі культивування одержують культуральну рідину з вмістом гетерополісахариду ксантанового типу 8,0 - 15 г/л по СР (сухій речовині), відносною в'язкістю 3,09,5ум.од. (сСт) при рН 7,0. Гетерополісахарид із культуральної рідини осаджують етанолом, після висушування препарат має вигляд волокон світло-коричневого кольору, який розчиняється у воді, утворюючи в'язкі розчини. Препарат має розгалужену будову, основу його складають залишки глюкози, галактози, манози, рамнози, залишки піровиноградної кислоти у вигляді кеталя і вищі жирні кислоти. Препарат гетерогенний по молекулярній масі - (8-20) х 105 Da (Дальтон), склад остаточно не установлений. Зберігає високу в'язкість при нагріванні до температури 100°С, незвичайно стійкий в присутності мінеральних кислот і легко структур ується в присутності солей в кислому середовищі. В малій концентрації в кислому середовищі підвищує в'язкість розчинів і утворює гелеподібні системи. Препарат може використовува тись у нафтогазовидобуванні та в інших галузях промисловості. Приклад 1. Культуру продуцента-Arthrobacter sp. 1702, яка вирощена при 26°С протягом 2 діб на сусло-агарі, вносять в колби об'ємом 750мл з 150мл середовища вищевказаного складу, рН 5,5. Культивування проводять на качалці з обертами 220 хв.-1, при температурі 27°С протягом 48 годин. Вирощеним і перевіреним на чистоту посівним матеріалом засівають стерильне поживне середовище об'ємом 500 л (вміст аналогічний середовищу у колбах) в інокуляторі (посівному апараті), і вирощують 13 годин при температурі 26°С, аерації і постійній роботі мішалки. Одержаний посівний матеріал засівають в ферментер із стерильним поживним середовищем у кількості 5000л з наступним складом компонентів: залізо сірчанокисле, калій фосфорнокислий, кальцій хлористий, магній сірчанокислий, амоній азотнокислий, крохмаль кукурудзяний, екстракт кукурудзяний, пекарні дріжджі, вода питна, рН 5,5. Культивування ведуть при температурі 27°С, аерації і постійній роботі мішалки впродовж 35 годин. Після закінчення процесу культивування в культуральній рідині визначають вміст гетерополісахариду та відносну в'язкість - вони дорівнюють відповідно 9,0 г/л та 3,0 сСт, що є підтвердженням якісного продукту. 6 Приклад 2. Готують посівний матеріал і одержують культуральну рідину, як описано вище (приклад 1), але в поживному середовищі об'ємом 5000л в ферментері крохмаль кукурудзяний замінений спиртом етиловим, рН 7,8. Культивування ведуть при температурі 32°С, аерації і постійній роботі мішалки впродовж 48 годин. Після закінчення процесу культивування в культуральній рідині визначають вміст гетерополісахариду та відносну в'язкість - вони дорівнюють відповідно 14,5г/л та 5,0 сСт, що є підтвердженням якісного продукту. Вихід ГПС визначають ваговим методом в г/л. В'язкість в культуральній рідині визначають віскозиметром капілярного типу (ВПЖ-2). Результати по рівню накопичення ГПС та в'язкості в культуральній рідині наведено в таблиці 1. Показники Накопичення гетерополісахарида на стадії біосинтезу, г/л (культивування в ферментері) Тривалість процесу культивування, год. Ефективна в'язкість культуральної рідини, сСт Вказані приклади показують, що запропонований спосіб і штам Arthrobacter sp. 1702 перевищує по виходу ГПС відомий спосіб прототип. При цьому ефективна в'язкість культуральної рідини значно вища, ніж у прототипу, а тривалість культивування менша на 5-20 годин, що значно вигідніше для промислового використання. Спос прото 8,7 55 2,5