Спосіб визначення індивідуальної чутливості до ат1-блокаторів

Корисна модель відноситься до медицини, а саме до кардіології і може бути використаною для прогнозування ефективності призначення АТі-блокаторів при лікуванні хворих на гіпертонічну хворобу. На сьогоднішній день відомі способи вибору гіпотензивного препарату за ступенем артеріальної гіпертензії (Борьба с артериальной гипертонией: Доклад Комитета экспертов ВОЗ № 862 -: Пер. с англ. - Женева, 1996. - 104 с.), типом системної гемодинаміки [Гогин Е.Е. Гипертоническая болезнь.- М.: Медицина, 1997.- 400 с. Ольбинская Л.И., Андр ущишина Т.Б. Рациональная фармакотерапия артериальных гипертензий, Российский медицинский журнал, 2001, Т. 9, № 15, С. 14 - 17.] та ін. Відомий також спосіб визначення індивідуальної чутливості до блокаторів кальцієвих каналів за ступенем агрегації тромбоцитів при лікуванні хворих на гіпертонічну хворобу (Г Х) вибираємо в якості прототипу, як найбільш близький спосіб для визначення індивідуальної чутливості до АТ1-блокаторів, тобто до того, що заявляється, по технічній суті. Перевагою способу є те, що він адекватно відображує індивідуальну чутливість до блокаторів кальцієвих каналів при лікуванні хворих на ГХ. Недоліки - неможливість застосування способу для визначення індивідуальної чутливості до AT1-блокаторів при лікуванні ГХ в зв'язку з різницею у механізмах дії цих препаратів на рецепторні клітин: блокатори кальцієвих каналів діють на відповідні канали, a AT1-блокатори блокують рецептори до ангіотензину II першого типу. У основу корисної моделі була покладена задача розширення можливостей способу визначення індивідуальної чутливості до лікарських засобів. Задача, яку покладено в основу корисної моделі вирішується тим, що у відомому способі визначення індивідуальної чутливості до лікарських засобів який включає дослідження в пробі крові властивостей тромбоцитів, згідно з корисною моделлю, індивідуальну чутливість до АТ 1-блокаторів визначають вимірюючи зміни внутріклітинної концентрації вільного кальцію, причому при помірному (70-79 %) прирості внутриклітинного кальцію очікують достатній ефект АТі-блокаторів, при прирості більше 80 % очікують недостатність ефективності АТі-блокаторів, при низькому - менше 70 % очікують відсутність ефекту АТ1-блокаторів. Встановлено, що Са2+ опосередковує клітинні ефекти ендогених вазоконстрикторів, таких як ангіотензин II. Тому корекція ефектів ангіотензина, в тому числі, під впливом антагоністів рецепторів до ангіотензину II першого типу (AT 1-рецепторів) приводить до зміни внеску вільного внутриклітинного кальцію [Ca2+]in у загальні механізми вазоконстрикції, що притаманні гіпертонічній хворобі. Цей феномен був використаний для визначення індивідуальної чутливості хворих на гіпертонічну хворобу до антагоністів АТі-рецепторів, наприклад лозартан (Goldberg A.I., Dunlay M.C., Sweet C.S. Safety and tolerability of losartan potassium, an angiotensin II receptor antagonists, compared with hydrochlorothiazide, atenolol, felodipine ER, and angiotensin -converting enzyme inhibitors for the treatment of systemic hypertension. Am. J. Cardiol, 1995; № 75, P. 793-795.). Позитивний ефект корисної моделі полягає в отриманні можливості визначення чутливості хворих на ГХ до гіпотензивного засобу, саме до АТ1-блокатору, оскільки зміни внутріклітинної концентрації вільного кальцію [Ca2+]jn в тромбоцитах є АТ1-рецепторзалежними і блокуються специфічним антагоністом AT1-рецепторів лозартаном. Спосіб виконують наступним чином. Хворим на ГХ перед призначенням гіпотензивного препарату в базальних умовах вимірюють рівень артеріального тиску і, в разі встановлення помірної АГ, беруть з локтевої віни 20 мл крові. Визначення концентрації іонів кальцію в цитоплазмі тромбоцитів проводять з використанням флуоресцентного індікатору кальциєвих іонів quin-2 (Авдонин П.В., Меньшиков М.Ю., Орлов С.Н. Ме ханизм увеличения концентрации Са 2+ в цитоплазме тромбоцитов при действии факторов агрегации // Биохимия. - 1985.- 50.-N 8.- С. 1241-1248). Кров (20 мл) беруть з локтевої віни і розподіляють по 6.6 мл у три пластикові пробирки, що містять по 1.3 мл антикоагулянта (25 г двуводного цитрата натрію, 14 г одноводного цитрата, 20 г D-глюкози на 1 л води). Відразу після взяття кров центрифугують на протязі 15 хвилин при 190 g (1000 об/хвилин). Багату тромбоцитами плазму центрифугують 10 с при 1000 g (3000 об/хвилин) для вилучення еритроцитів і лейкоцитів і повторно центрифугують 15 хвилин при 390 g (1500 об/хвилин) для зсідання тромбоцитів. 200 мкл суспензії тромбоцитів ((2-5)х108 кліток на 1 мл) добавляють до 5 мл середи, що містить 150 мМ NaCl, 2.7 мМ КСl, 0.37 мМ NaH2PO4, 1 мМ MgSO4 , 1 мМ СаСІ2, 5 мМ D-глюкозу, 10 мМ HEPES-NaOH, pH 6.55, 50 Од/мл гепаріна, 0.35 % бичого сироваточного альбуміну (проба 1). До частини отриманої суспензії тромбоцитів додають 40 мМ розчин ацетоксіметільного ефіру quin-2 (Q2/AM) в діметілсульфоксиді (ДМСО) до кінцевої концентрації 10 мкМ і інкубують 30 хв. при 37°С зі струшуванням (проба 2). До іншої частини суспензії тромбоциів додають замість розчину Q2/AM рівний обсяг ДМСО (проба 3). Флуоресценцію визначають на спектрофлуориметрі при довжині хвилі збудження та флуоресценції 340 і 500 нм відповідно, розміру щилини - 4 і 10 нм відповідно. Для визначення інтенсивності флуоресценції, коли quin-2 повністю зайнятий іонами Са 2+ (Fмакс.), плазматичну мембрану тромбоцитів руйнують 50 мкМ дігітоніном. Інтенсивність флуоресценції, коли quin-2 повністю вільний від Са 2+ (Fмин.), визначають, після добавлення в кювету МnСІ2 (до кінцевої концентрації 0,5 мМ), що витісняє Са 2+ із комплексу з фарбником і гасить флуоресценцію. Обчислення концентрації вільного Са 2+ в цитоплазмі тромбоцитів проводять по формулі: [Са2+]іn = Кд х.(FFмін.)/(Fмакс. - F) (нмоль/л), де F - рівень флуоресценції зразка суспензії тромбоцитів (вихідний або після добавлення ангіотензину II), Fмакс. і Fмін. - інтенсивність флуоресценції, коли quin-2 повністю занять Са 2+ або вільний від нього, Кд - стандартна концентрація вільного кальцію, що дорівнює 115 нМ при рН 7,05 і концентраціях Mg2+, К+ і Na+ відповідно 1, 125 і 20 мМ (умови, що є близькими до внутриклітинних). Для визначення ступеня підвищення внутриклітинної концентрації вільного Са 2+ при дії ангіотензину II (індуктору ви хода кальцію із внутриклітинного депо в цитоплазму) в кювету після регістрації інтенсивності флюоресценції (F) додають розчин ангіотензина II (до кінцевої концентрації 100 нмоль/л), інкубували 30 хв., після чого визначають інтенсивність флюоресценції відповідно вищезгаданим етапам. Ступень підвищення внутриклітинної концентрації вільного Са 2+ при дії ангіотензину II дорівнює різниці [Са2+]in до та після додавання ангіотензина II у кювету з суспензією тромбоцитів. Після визначення ступені підвищення внутриклітинної концентрації вільного Са 2+ до та після додання у кювету з суспензією тромбоцитів ангіотензину II хворим на гіпертонічну хворобу призначають лікування АТ1блокатором лозартаном у дозі 100 мг на добу на протязі 7-10 діб. Повним гіпотензивним ефектом вважають зниження систолічного AT нижчие 140 мм рт. ст., а діастолічного AT - нижче 90 мм рт. ст. наприкінці першого лікувального періоду. В ци х випадках хворі продовжують отримувати терапію ще 20 діб. У хворих на ГХ з підвищенням рівня AT в діапазоні 140/90-160/100 мм рт. ст. гіпотензивний ефект АТ1блокатора лозартана вважають недостатнім, їх включають до 2-го лікувального періоду (3 тижні) - періоду комбінованої терапії. Додатково до лозартану в дозе 100 мг/діб призначають гіпотіазид в дозі 25 мг/діб. У хворих на ГХ з підвищенням рівня AT вище ніж 160/100 мм рт. ст. гіпотензивний ефект АТ1-блокатора лозартана вважають відсутнім та призначають інші гіпотензивні препарати, наприклад бета-блокатори у середньо-терапевтичних дозах. У хворих на ГХ з помірним (70-79 %) ступенем підвищення внутриклітинної концентрації вільного Са 2+ до лікування після призначення АТ1-блокатору лозартану у стандартній дозі спостерігають його достатній гіпотензивний ефект. У хворих на ГХ з більше ніж 80 % ступенем підвищення внутриклітинної концентрації вільного Са 2+ до лікування після призначення АТ1-блокатору лозартану у стандартній дозі спостерігають його недостатній гіпотензивний ефект, що потребує у додатковому призначенні тіазидного діуретику (гіпотіазиду). У хворих на ГХ з менше ніж 70 % ступенем підвищення внутриклітинної концентрації вільного Са 2+ до лікування після призначення АТ1-блокатору лозартану у стандартній дозі спостерігають відсутність його гіпотензивного ефекту, що потребує у зміні лозартану на інший гіпотензивний препарат, наприклад бетаадреноблокатор. Ефективність корисної моделі, що заявляється, ілюструють наступні приклади. Хвора Р., 44 років, була госпіталізована у спеціалізовану клініку. При надходженні до відділення пред'являла скарги на головний біль, почуття тиску в голові. Протягом 4-х років знає про періодичні підвищення AT до 160/90 мм рт.ст., скарги з'явилися в останні 2 роки, хвора не лікувалася. Батько хворої страждає на артеріальну гіпертензію. Об'єктивно: стан відносно задовільний. Нормостеничної статури. Підви щеного харчування. Ріст 168 см, вага 83 кг. Шкіряні покрови і слизові оболонки звичайного фарбування. У легенях перкуторний тон ясний, легеневий по обидва боки, аускультативно - подих везікулярній. Тоні серця ритмічні, достатньої гучності. ЧСС 75 на 1 хв. AT 164/100 мм рт.ст. Патологічних шумів у проекції крупних судин не визначається. Печінка не збільшена. Симптом Пастернацького негативній по обидва боки. Періферічних набряків немає. Консультована окулістом - гіпертонічна ангіопатія судин сітківки. Клінічний аналіз крові, сечі, глюкоза крові, рівень ліпідів, протеінограма, сечова кислота, сечовина, креатінін, калій, натрій у плазмі крові, електроліти в сечі в межах нормі. Рівень клубочкової фільтрації 150 мл/хв. ЕКГ: Синусовий ритм. Початкова гіпертрофія лівого шлуночка серця. Рентгеноскопія органів грудної порожнини: Легені без патологічних змін. Серце незначно збільшене за рахунок лівого шлуночка, пульсація середньої амплітуди і часто ті. Аорта не ущільнена. Діагноз: Гіпертонічна хвороба II стадії. Помірна артеріальна гіпертензія. Хворій визначилі базальну концентрацію внутриклітинного кальцію в тромбоцитах - 115,9 нМ/л. Приріст вільного кальцію у відповідь на стимуляцію ангіотензином II склавши 84,3 нМ/л, тобто 72,7 % від базального рівня. Згідно з вишукованими критеріями хвора є чутливою до АТі-блокатора лозартана. Хворій був призначений лозартан в добовій дозі 100 міліграм. Наприкінці 2-х тижневого курсу лікування AT знизився до 120/80 мм рт.ст., рівень ЧСС склавши 71 на 1 хв. Хворий 3., 51 рік, був госпіталізований у спеціалізовану клініку. При надходженні пред'являв скарги на головний біль, короткотривалі неінтенсивні болі в ділянці серця. Протягом 5-х років знає про підвищений AT до 170/100 мм рт.ст., регулярно не лікувався. Об'єктивно: стан відносно задовільний. Гіперстенічної статури. Ріст 173 см, вага 80 кг. Шкіряні покрови і слизові оболонки звичайного фарбування. У легенях перкуторний тон ясний, легеневий по обидва боки, аускультативно - подих везікулярний. Тоні серця ритмічні, достатньої гучності. ЧСС 84 на 1 хв. AT - 170/104 мм рт.ст. Патологічних шумів у проекції крупних судин не визначається. Печінка не збільшена. Симптом Пастернацького негативній по обидва боки. Періферічних набряків немає. Консультований окулістом - гіпертонічна ангіопатія судин сітківки. Клінічний аналіз крові, сечі, глюкоза крові, рівень ліпідів, протеінограма, сечова кислота, сечовина, креатінін, калій, натрій у плазмі крові, електроліти в сечі в межах нормі. Рівень клубочкової фільтрації 158 мл/хв. ЕКГ: Синусовий ритм. Помірна гіпертрофія лівого шлуночка серця. Рентгеноскопія органів грудної порожнини: Легені без патологічних змін. Серце збільшене за рахунок лівого шлуночка, пульсація середньої амплітуди і частоти. Аорта незначно ущільнена. Діагноз: Гіпертонічна хвороба II стадії. Помірна артеріальна гіпертензія. Хворому визначили базальну концентрацію внутріклітинного кальцію в тромбоцитах - 124,3 нМ/л. Приріст вільного кальцію у відповідь на стимуляцію ангіотензином II склавши 104,1 нМ/л, тобто 83,7 % від базального рівня. Згідно з вишукованими критеріями хворий є недостатньо чутливим до АТрблокатора лозартану. Хворобливому був призначений лозартан в добовій дозі 100 міліграм. Наприкінці 2-х тижневого курсу лікування AT знизився до 160/90 мм рт.ст., рівень ЧСС склавши 79 на 1 хв., був констатований недостатній терапевтичний ефект і додатково призначений гідрохлоротіазид у дозі 25 міліграм на добу. Через 2 тижні рівень AT знизився до 120/80 мм рт. ст., ЧСС склала 88 на 1 хв. Хворий М., 54 років, був госпіталізований у специалізовану клініку. При надходженні пред'являв скарги на головний біль дифузного характеру, незначну задишку при фізичному навантаженні. Протягом 4-х років знає про підвищений AT максимально до 170/105 мм рт.ст., регулярно не лікувався. Об'єктивно: стан відносно задовільний. Нормостенічної статури. Ріст 170 см, вага 86 кг. Шкіряні покрови і слизові оболонки звичайного фарбування. У легенях перкуторний тон ясний, легеневий по обидва боки, аускультативно - подих везікулярний. Тоні серця ритмічні, достатньої гучності. ЧСС 80 на 1 хв. AT - 178/106 мм рт.ст. Короткий систолічний шум у проекції аорті. Печінка у краю реберної дуги. Симптом Пастернацького негативний по обидва боки. Періферічних набряків немає. Консультований окулістом - гіпертонічна ангіопатія судин сітківки. Клінічний аналіз крові, сечі, глюкоза крові, рівень ліпідів, протеінограма, сечова кислота, сечовина, креатінін, калій, натрій у плазмі крові, електроліти в сечі в межах норми. Рівень клубочкової фільтрації 169 мл/хв. ЕКГ: Синусовий ритм. Помірна гіпертрофія лівого шлуночка серця. Ознаки систолічного перевантаження лівого шлуночка серця. Рентгеноскопія органів грудної порожнини: Легені без патологічних змін. Серце збільшене за рахунок лівого шлуночка, пульсація середньої амплітуди і частоти. Аорта незначно ущільнена. Діагноз: Гіпертонічна хвороба II стадії. Помірна артеріальна гіпертензія. Хворому визначили базальну концентрацію внутриклітинного кальцію в тромбоцитах - 121,6 нМ/л. Приріст вільного кальцію у відповідь на стимуляцію ангіотензином II склавши 76,7 нМ/л, тобто 63,1 % від базального рівня. Згідно з вишукованими критеріями хворий є нечутливим до АТ1-блокатора лозартана. Незважаючи на це хворому був призначений Ат1блокатор лозартан в добовій дозі 100 міліграм. Наприкінці 2-х тижневого курсу лікування AT знизився до 162/94 мм рт.ст., рівень ЧСС склавши 74 на 1 хв., було констатовано відсутність терапевтичного ефекту і додатково призначений гідрохлоротіазид у дозі 25 міліграм на добу. Через 2 тижні рівень AT декілька знизився склавши 1160/92 мм рт. ст., ЧСС склала 78 на 1 хв. Хворому були призначені блокатор кальцієвих каналів з групи дігідропиридінів - коринфар-ретард в добовій дозі 80 міліграм і гідрохлоротіазид у дозі 25 міліграм на добу. Через 2 тижні рівень AT знизився до 120/80 мм рт. ст., ЧСС склала 80 на 1 хв.