Спосіб одержання біологічно активної гідрофільної фракції з тканин плаценти свинячої

Спосіб одержання біологічно активної гідрофільної фракції плаценти свинячої, що включає попереднє відмивання плаценти у воді, кріоконсервування до температури (-80)...(-120) °С парами рідкого азоту і кріоздрібнювання до розміру часток 20-30 з наступним екстрагуванням суміші і фільтрацією екстракту, який відрізняє ться тим, що здрібнений порошок попередньо розморожують до температури 20-35 °С, а екстрагування проводять водою дистильованою, при співвідношенні порошок:вода 1:2, при постійному перемішуванні протягом 2-3 годин при цій же температурі. (19) (21) a200603665 (22) 03.04.2006 (24) 25.12.2007 (72) КОНЕВ ВОЛОДИМИР ФЕДОРОВИЧ, UA, ГРЕБЕНЩІКОВ ВІКТОР ЮХИ МОВИЧ, U A, КУРИЛО МИКОЛА ФЕДОРОВИЧ, UA, ФІЛОНЕНКО СВІТЛАН А МИКОЛАЇВНА, UA, ШАБУНІН СЕРГІЙ ВИКТОРОВИЧ, U A (73) ТОВАРИСТВО З ОБМЕЖЕНОЮ ВІДПОВІДАЛЬНІСТЮ "ЗООВЕТЕРИНАРНИЙ ЦЕНТР", U A (56) UA A1 2710, 15.04.94. UA A 20274, 15.07.97. UA 20040806563, 15.02.06. RU A 2003124738, 20.02.05. 3 81358 протягом 3-4 години при постійному перемішуванні. Екстрагування повторюють двічі. Потім екстракт фільтрують. Таким чином, процес одержання гідрофільної фракції, на відміну від попереднього аналога, складає 6-8 годин, що знижує тривалість процесу і, у порівнянні з аналогом, забезпечує збільшення змісту амінокислот і мікроелементів у плаценті майже в 2 рази (табл.2). Однак, переведення комплексу біологічно активних речовин, що утримуються в кріоконсервованій плаценті, із замороженого стану шляхом кріосублімирування у твердий стан, а потім шляхом екстрагування фізіологічним розчином у рідкий стан, викликає руйнування структури біологічно активних комплексів, з одного боку, а з іншого боку - приводить до забруднення порошку тканин плаценти фторированими вуглеводнями, що містить хладон. Таким чином це приводить до зниження концентрації вмісту амінокислот і мікроелементів у плаценті, та зменшує її біологічну активність. Крім того, використання енергоємних технологій кріосублімаційного фракціювання і хладонової екстракції впливає на собівартість гідрофільної фракції. В основу дійсного винаходу встановлена задача створення способу одержання біологічно активної гідрофільної фракції з тканин плаценти свинячої, що забезпечує збільшення біологічної активності гідрофільної фракції за рахунок збільшення концентрації вмісту амінокислот і мікроелементів. Прототипом є останній з аналогів. Рішення задачі забезпечується тим, що в способі одержання біологічно активної гідрофільної фракції з тканин плаценти свинячої, що включає попереднє відмивання плаценти у воді, кріоконсервування до температури (-80) - (120)°С парами рідкого азоту і кріоздрібнювання до розміру часток 20-30 мкм. з наступним екстрагуванням суміші і фільтрацією екстракту, відповідно до винаходу, здрібнений порошок попередньо розморожують до температури 20-3 5°С, а екстрагування проводять водою дистильованою, узятих у співвідношенні 1:2, при постійному перемішуванні протягом 2-3 годин при цій же температурі. Як показали наші дослідження, кріоконсервування наступним розморожуванням кріоздрібнюваного порошку до зазначеної температури викликає тільки руйнування клітинних мембран тканин плаценти без порушення самої структури біологічно активних комплексів, що сприяє виділенню міжклітинної і внутрішньоклітинної рідини. В результаті рівень концентрації амінокислот і мікроелементів зберігається практично в нативному стані. Використання води дистильованої для екстрагування розмороженою в такий спосіб порошку тканин плаценти забезпечує більш повний витяг біологічно активних речовин мікроелементів і амінокислот, при цьому виключається і забруднення екстракту побічними речовинами, завдяки чому забезпечується 4 збільшення рівня концентрації вмісту амінокислот і мікроелементів у плаценті, за рахунок чого збільшується і біологічна активність гідрофільної фракції. Розморожування при температурі вище 35°С недоцільно через руйнування біологічно активних речовин, а використання температури менш 20°С збільшує тривалість процесу розморожування. Перемішування суміші водою дисцильованою протягом менш 2-х годин не забезпечує гомогенізацію і проведення повного екстрагування, а збільшення часу більш 3-х годин - недоцільно, тому що не приводить до збільшення концентрації змісту амінокислот і мікроелементів у плаценті. Співвідношення суміш: вода дистильована виявлена нами експериментальне. Збільшення в співвідношенні кількості води дистильованої недоцільно, тому що пов'язано з порушенням стабільності екстракту та збільшенням часу фільтрації екстракту, а зменшення кількості води дистильованої не забезпечує повноту витягу біологічно активних речовин. У табл.1 наведені значення вмісту іонів Fe3+, мкМ/л, що є критерієм повноти проведення екстрагування гідрофільних речовин, що утримуються в плаценті, при різних значеннях параметрів, що заявляються; у табл.2 наведений вміст мікроелементів в отриманій гідрофільній фракції в порівнянні з даними аналога і прототипу; у табл.3 і 4 наведені порівняльні дані по ефективності застосування отриманої гідрофільної фракції для лікування ендометріта й акушерських захворювань свиноматок, відповідно; у табл.5 наведені порівняльні дані по ефективності застосування отриманої гідрофільної фракції для збільшення схожості насінь озимої пшениці. Пропонований спосіб реалізують таким чином. Вихідну плаценту свинячу в кількості 1,0кг промивають водою, фрагментують і піддають швидкому заморожуванню в інтервалі температур (-80С) - (-120)°С в парах рідкого азоту швидкістю 30°С в хвилину, з наступним здрібнюванням замороженої плаценти на кріо-млині у тому же температурному інтервалі до розміру часток 2030мкм по відомих технологіях. Здрібнену до зазначених розмірів часток тканини плаценту розморожують в інтервалі температур 20-35°С (у конкретному прикладі до 25°С), після чого здійснюють екстрагування водою дисцильованою (2л) при цій же температурі протягом 2-х годин за допомогою роторно-пульсаційного апарата. При цьому співвідношення порошку плаценти і води складає 1:2. Отриманий у такий спосіб екстракт фільтрують. Вихід готового продукту (відфільтрованої гідрофільної фракції) складає 6575% (що залежить від вологості відфільтрованого осаду). Приклади з іншими значеннями параметрів, що заявляються, наведені в табл.1. Як витікає з табл.1, рішення поставленої задачі забезпечується тільки в межах параметрів, що заявляються, (приклади 2, 6, 7). Вміст іонів Fe3+ (мкМ/л) збільшилося практично в 3 рази в 5 81358 порівнянні з прототипом. Вихід хоча б одного параметра за межі величин, що заявляються, не забезпечує рішення задачі. Табл. 2 підтверджує збільшення концентрації вмісту амінокислот і мікроелементів у плаценті гідрофільної фракції, отриманої за пропонованим способом, у порівнянні з аналогічними даними відомих способів практично по всіх елементах у 3 рази в порівнянні з прототипом і майже в 4 рази в порівнянні з аналогом. Проведені іспити використання гідрофільної фракції, отриманої запропонованим способом, у господарствах Харківській і Вороніжській областях у практичних умовах, свідчать про її більш широкий спектр біологічної дії і більш високе ефективне лікування та профілактику різних захворювань у корів, свиней і молодняку сільськогосподарських тварин, у порівнянні з відомими способами. Дані представлені в табл. 3 і 4, відповідно. 6 Аланін 650,7 Метіонін Изолейтін Лейцін Тірозін 434,4 755,3 920 267,9 Фенілаланін 425.5 Гістідін Лізін Гамааміномасляна к-та Цитрулін Макро та мікроелементи 1100 Валін 444,1 1500 265,3 243,7 Мідь 6,4 Цинк 320 Марганець 15,6 Залізо 768,5 Табл. 1 Кальцій Фосфор неорганічний Тривалість Вміст в екстракті екстрагування, Fe3+, мкМ/л час. Кількість № досліда здрібненого порошку, кг екстрагента вода дистильована литр Температура розморожуван. порошку, °С 1. 1,0 1,0 1,0 2,0 3. 1,0 4. Показники 2,0 25 2. 6,1 26,9 Гідроф 735,5 Заявляема 20 1. Кількість тварин, голів 2.5 756,8 100 3,0 25 2. Видужало, голів3,0 503,4 96 1,0 2,0 15 3. Продовження лікування, доба 2,5 719,4 8,5±0,13 5. 1,0 2.0 40 4. Залишилось хворих, голів 2,0 444,8 4 6. 1,0 2,0 25 2,5 762,4 7. 1,0 2,0 35 2,0 768,2 8. 1,0 2,0 25 Показники1,5 9. 1.0 2,0 30 4,0 Прототип порошокекстрагент залишок після ізотонічний. розчин ліпофільної екстракції NaCI 0,87 30 Застосувалась гідрофільна Застосувала 685.4 фракция заявляема фракци 761,5 223 Кількість тварин, голів 3-4 Захворіло післяпологовими ендометритами, голів 50 238,15 3 Табл. 2 Показники Амінокислоти № досліда Заявляема Вміст, мкМ/л Пророщування коренів№2237486 насіння Пат. № 2228759 Пат. та стеблів пшениці, % за час культування, доба 8,22 2.0 81,4 1,0 3,0 4,0 Цистенова кислота 284,9 Аспарагінова кислота 427,4 1 6,85 78/10 107,6 88/54 85/56 Треонін 2 896,7 6,96 83/13 95/39 270,4 95/89 Серін 3 769,3 80/12 10,16 94/49 241,7 95/87 Глугамінова кислота Гліцин 744,6 4 658,5 5 17,3487/8 13,87 79/10 213,8 92/55 396 85/51 93/90 91/79 к 7 81358 8 6 44/8 77/11 91/34 13,7 18,2 7 52/5 70/15 78/35 12,5 17,5 Крім того, отримана гідрофільної фракція помітно впливає на схожість насінь озимої пшениці (табл. 5). В прикладах 1-5 використовувалась отримана гідрофільна фракція в суміші з водою. Для порівняння в прикладі 6 насіння взагалі не оброблялося, а в прикладі 7 насіння оброблялось водою. Після обробки вологість насіння в усіх дослідах дорівнює 5%. Культування насіння проводилось у чашках Петрі на вологкому фільтрувальному папері. Пророщування насіння оцінювалось 1 раз на добу на протязі 4-х діб по пророщуванню стеблів та коренів. Після 4-х діб культування вимірювалась середня вага коренів та стеблів. Температура культування коливалась в межах 17-18°С. В табл. 5 в числівнику наведений % пророщених коренів, а в знаменнику - % пророщених стеблів. Помилка результатів вимірів знаходиться у довірювальній межі - 0,9. Таким чином, з таблиці 5 видно, що гідрофільна фракція з водою перевищує вплив на пророщення коренів е у середньому на 19%, а стеблів на 45% у порівнянні з контрольнім (дослід 7).