Спосіб одержання ембріональних стовбурових клітин із чорноморської мідії

Спосіб одержання ембріональних стовбурових клітин із чорноморської мідії, який передбачає нерест плідників і одержання статевих продуктів, який відрізняється тим, що етап нересту вибирають з групи: природний або стимульований нерест; відбір бластомерів із запліднених яйцеклітин, які діляться, проводять в період від початку першого мітотичного поділу і до утворення стеробластули шля хом руйнування зв'язку між бластомерами внаслідок зниження концентрації кальцію в морській воді (солоність 18%о), де проводиться культивування бластомерів, 0,1 М розчином натрію лимоннокислого; вид чорноморської мідії вибирають з групи: M.galloprovincialis або M.edulis. (19) (21) a200709248 (22) 13.08.2007 (24) 25.11.2008 (46) 25.11.2008, Бюл.№ 22, 2008 р. (72) ІВАНОВ ВАЛЕРІЙ МИКОЛАЙОВИЧ, UA (73) ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ПІВДЕННИХ МОРІВ ІМ. О.О. КОВАЛЕВСЬКОГО Н АН УКРАЇНИ, UA (56) UA C2 41302, 17.09.01. SU A1 1745767, 07.07.92. RU C2 2204381, 20.05.03. RU C1 2205873, 10.06.03. RU C2 2199306, 27.02.03. Stem cells. From Wikipedia, the free encyclopedia. [он-лайн], Грудень 2006 [знайдено 2008-09-19]. Знайдено в Інтернет: 3 84810 них стовбурових та первинних статевих клітин хребетних тварин. До недоліків роботи слід віднести те, що ембріональні стовбурові клітини були виділені із дорослих тварин, які проживають в природних умовах, де їх кількість обмежена, а вилов регламентований. Клітинна маса таких тварин містить, в основному, уже спеціалізовані клітини, з реалізованими генетичними потенціями. Серед клітинної маси стовбурові клітини рідко зустрічаються. Сировиною для одержання стовбурових клітин служать людські ембріони, плацента і хордова (пуповинна) кров [см. П. №41302, UA]. У відомому способі дослідження проводять на клітинних суспензіях, виділених із печінки людського ембріона віком 5-6 тижнів. Саме в ці строки вміст недиференційованих лімфоїдних елементів в клітинній масі досягає 15-17%. В більш пізні строки їх вміст значно знижується. Недоліком способів, які використовують людські ембріони як джерела стовбурових клітин, є методологічні проблеми і висока вартість робіт. Крім того, існують етичні проблеми, і ряд країн прийняли закони, які забороняють експериментування з людськими зародками і використання клітинних препаратів із ембріональних (в тому числі і стовбурови х) клітин людини. В основу винаходу Спосіб одержання ембріональних стовбурови х клітин із об'єктів марикультури, наприклад, чорноморскої мідії Mytilus galloprovincialis і чорноморської камбали-калкан Scophthalmus maeoticus, поставлено завдання шляхом одержання ембріональних стовбурових клітин із культивованих гідробіонтів, розширити сировинну базу недиференційованих стовбурових клітин. Поставлене завдання вирішується в таким чином. Із запліднених яйцеклітин культивованих гідробіонтів проводять відбір бластомерів в період від початку першого мітотичного поділу і до утворення стеробластули. Зв'язок між бластомерами руйнують шляхом зниження концентрації кальцію в морській воді солоності 18%о, додаючи лимоннокислий натрій до 0,1М концентрації. Ембріональні стовбурові клітини збирають на газ-ситі з діаметром вічка 32 и 20мкм. Виконання способу включає декілька етапів. Перший етап - робота з плідниками, яка включає підбір статевозрілих плідників, стимуляцію нересту, визначення якості сперматозоїдів та яйцеклітин. Другий етап - штучне запліднення, інкубація ембріонів до необхідної стадії з використанням даних про тривалість процесу запліднення, утворення 2, 4, 8, 16, 32 і т.д. бластомерів. Третій етап - робота із зародками, розділення бластомерів. Приклади реалізації способу. Приклад 1 Мідія - Mytilus galloprovincialis Lam. - перспективний об'єкт промислової марикультури на Чорному морі. Закономірності розмноження цього виду молюсків в природних умовах добре вивчені, що дає можливість в контрольованих умовах одержувати ембріони в масовій кількості. Найбільш 4 придатні сезони одержання статевих продуктів мідій - весна та осінь. Плодючість мідії розміром 4-5см - до 1млн. яйцеклітин. Для одержання достатньої кількості запліднених яйцеклітин проводили групові схрещування, використовуючи до 50 плідників. Можлива стимуляція нересту з використанням температурного шоку або з використанням спеціальних хімічних речовин. При стимуляції нересту у мідій можливий вимет незрілих яйцеклітин, на діакінезі профази мейозу. При мікроскопії вони легко відрізняються менш щільним, в порівнянні з цитоплазмою, ядром. У зрілих яйцеклітин ядро уже відсутнє. Хромосоми розміщені безпосередньо в цитоплазмі і знаходяться на стадії метафази першого мейотичного поділу. Постійний набір бівалентів - 14 [Pirkova A.V., Ivanov V.N. Genetic researches with Mytilus from the Black Sea // International Conference on Aquaculture in the Third Millenium. (20-25 Feb. 2000) Central Grand Plaza, Bangkok, Thailand - 2000. P.67-68]. Для одержання статевих продуктів застосовували температурну стимуляцію нересту. Мідії відбирали з колекторів ферми в квітні - в період їх масового нересту в природних умовах. Після механічної очистки раковин, мідій тримали в прісній воді 2-3хв.; сполоснули морською водою і розподіляли по 1екз. в ємкості з профільтрованою через 1мкм фільтр морською водою (об'єм 500мл) температури 18°С. Різниця в показниках температури в морі і лабораторних умовах становила 8°С. Зрілість яйцеклітин визначали за допомогою мікроскопу МБД-6 (збільшення 115) за відсутністю ядра (овоцити І порядку; метафаза першого мейотичного поділу). Кількість яйцеклітин підраховували при допомозі бінокуляру МБС- 9 в камері Богорова. Запліднення проводили із розрахунку 10 сперматозоїдів на 1 яйцеклітину при температурі води 17 і 12°С. Концентрацію сперматозоїдів підраховували в камері Горяєва після знерухомлення їх в парах формальдегіду. Тривалість окремих стадій мейозу і мітотичного ділення вивчали на тимчасових давлених препаратах незапліднених і запліднених яйцеклітин. Фіксацію проводили в етанол-оцтовому фіксаторі (3:1) з інтервалом 2 і 5хв. Препарати зафарбовували 2% ацетоорсеїном: 15хв. при температурі 65°С і 15хв. - при 20°С. Мейоз вивчали за допомогою мікроскопу МБД-6 (збільшення об'єктивів 10 і 90). Після запліднення чоловічий геном знаходився в цитоплазмі яйцеклітини у вигляді глибки хроматину. На стадії телофази другого мейотичного поділу окремі нитки хроматину уже можна було відрізнити. Злиття чоловічого і жіночого пронуклеусів відбулося через 45хв. і 1год. 19хв. відповідно при 17 і 12°С. Першу інтерфазу мітозу спостерігали на 57 хвилині - при температурі води 17°С і через 1 годину 31хв. - при 12°С. Перший мітотичний поділ та утворення двох бластомерів відбувся - через 1год. 18хв. і 2год. 16хв. після запліднення при указаних температурних значеннях. Чотири бластомери (другий мітотичний поділ) виявлені через 1год. і 54хв. при 17°С. 5 84810 Стеробластула - перша личинкова стадія морських двостулкових молюсків. Наприклад, у Mytilus edulis ця стадія досягається через 8 - 10 годин після початку дроблення [Малахов, Медведева, 1991]. З цього моменту можна проводити відрахунок уже не ембріонального, а личинкового розвитку. Рухливість стеробластули забезпечується за рахунок війчатих клітин, зібраних в 4 гр упи. На цій стадії відбувається формування раковинної залози і гаструляція. М. galloprovincialis і М. edulis - два близьких види, з подібною репродуктивною стратегією, аналогічним ембріональним розвитком і швидкістю поділу бластомерів при однакових температурних умовах. Закладка органів у М. galloprovincialis також починається на стадії стеробластули. Отже, відбір ембріонів мідій, у яких диференціація клітин ще не почалася, можна проводити з початку першого мітотичного поділу (два бластомери) і до утворення стеробластули протягом приблизно семи годин від початку дроблення. Відомо, що бластомери в зародку з'єднані за допомогою міжклітинної системи, яка представляє собою специфічну сукупність білкових та білковополісахаридних молекул, збагачених іонами Са 2+. Вона володіє високоорганізованою просторовою структурою [Дубинин, 1985]. Оскільки розвиток ембріонів мідій відбувається в морській воді, то змінюючи концентрацію кальцію в морській воді, можна регулювати вміст іонів кальцію в міжклітинній системі, яка з'єднує бластомери. Концентрація кальцію в морській воді залежить від її соленості. При 18,04%о концентрація іонів Са 2+ складає 0,339мг/л. Концентрацію іонів Са2+ та інших основних іонів знижували за допомогою цитрату натрію (натрій лимоннокислий). За нашими даними, при 0,1М концентрації лимоннокислого натрію в морській воді солоності 18%о, відбувається розділення двох бластомерів на окремі клітини. Таким чином, мідія М. galloprovincialis являється перспективним об'єктом для одержання недиференційованих (стовбурових) клітин для використання в фетальній медицині і косметології. Приклад 2. В період нерестової активності - березнітравні, відловлювали плідників чорноморської ка Комп’ютерна в ерстка В. Клюкін 6 мбали-калкан Scophthalmus maeoticus. Технологія одержання статевих продуктів, проведення штучного запліднення і культивування зародків відома [див.: Иванов В. Н., Хромосомы черноморской камбалы Rhombus maeoticus (Pallas) //ДАН СССР, 1969, - Т. 187 №6. - С.1397-1400.]. Відомий каріотип цих риб і визначена тривалість різних стадій ембріогенезу в оптимальних та екстремальних умовах [див.: Иванов В.Н. Получение икры камбалы-калкана для инкубации в лабораторных условиях: опыт массовой инкубации экспериментального материала // Биологические основы морской аквакультуры - Киев, 1975, - Вып. 1. - С.51-54.]. При температурі 16-18оС ембріональний розвиток камбали-калкан проходив за 4-5 діб; від запліднення до стадії гастули - 20-24 години. Розмір ікринок шароподібної форми - 0,8-0,9мм в діаметрі. Від одної самки вагою 3-5кг одержували до 3млн. ікринок загальної сирої ваги - до 500-600г. Таким чином, навіть при 50% відході з причин не повного запліднення та загибелі в процесі інкубації, від одної пари плідників одержували до 11,5млн. ембріонів на різних стадіях розвитку. Зародки риб - це перспективна сировина для одержання стовбурових клітин з нереалізованою генетичною інформацією і ембріональних клітин зародків на різних стадіях розвитку. Одержання і використання ембріонального матеріалу від моменту запліднення до морфогенезу дає можливість якісно урізноманітнити фізіолого-біохімічну активність препаратів, які використовуються в косметичних препаратах, а також для клітинної терапії. Застосування заявленого способу дозволяє забезпечити дослідників масовим матеріалом, а виробників лікувально-профілактичних і косметичних препаратів - ембріональними стовбурними клітинами (клітинною масою) на певній стадії мейотичного поділу, дроблення або початку морфогенезу. Спосіб оснований на використанні культивованих об'єктів марикультури, одержання статевих продуктів, кількість яких практично не обмежена. Запропонований спосіб дає можливість експериментувати з диплоїдними клітинами після мейозу І, гаметами і зародками на різних стадіях розвитку і морфогенезу. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601