Спосіб визначення зв’язування металів в рослинних тканинах

Спосіб визначення зв'язування металів в рослинних тканинах, що включає обробку рослин доступними формами металу, підготовку рослинного 3 85043 температурах з використанням рідкого азоту. Додаткове ускладнення при вимірах спектральних параметрів пов'язано з необхідністю підтримки низької температури із застосуванням кріостату з рідким гелієм. Крім того, встановлення ефекту зв'язування базується на спектральних характеристиках певного металу. В основу винаходу поставлено задачу у способі визначення ефекту зв'язування металів у рослинних тканинах шляхом виключення прийомів заморожування і низькотемпературного зберігання зразка в операції підготовки рослинного препарату до аналізу, прийому термостатування кювети із зразком при вимірах спектральних характеристик та встановлення параметрів розподілу відбитого) світлового потоку препаратами коренів забезпечити спрощення процедур підготовки препарату до аналізу і виміру діагностичного показника. Поставлена задача вирішується тим, що у способі визначення ефекту зв'язування металів в рослинних тканинах, який включає обробку рослин доступними формами металу, підготовку рослинного препарату до аналізу та встановлення ефекту зв'язування металу за спектральними параметрами продукту його взаємодії з хелатором фенольного типу згідно з винаходом визначають розподіл інтенсивності відбитого світлового потоку препаратами коренів дослідних і контрольних рослин залежно від довжини хвилі випромінювання в діапазоні 450-750нм, розраховують диференційний спектр за різницею оптичної густини при однаковій довжині хвилі дослідних і контрольних зразків з інтервалом 5-10нм і при наявності максимуму в диференційному спектрі при 540-670нм встановлюють ефект зв'язування металу хелатором в рослинній тканині. Спосіб базується на закономірностях формування стійкості рослин до токсичної дії металів на різних рівнях функціонування організму, у тому числі і на внутрішньоклітинному рівні за рахунок наявності ендогенних хелаторів. Терміном "хелатор" позначено низькомолекулярні метаболіти, які локалізовані у клітині і здатні забезпечувати детоксикацію металу за рахунок його зв'язування в метаболічно неактивні комплексні сполуки. Доступними формами металу є такі, що здатні поглинатися і надходити до рослин із поживного середовища. Дослідними рослинами вважають рослини, які вирощені при дії металу, а контрольними рослинами - рослини, які вирощені при відсутності такої дії. Підготовка препарату до аналізу не потребує додаткових прийомів заморожування і низькотемпературного зберігання зразка, оскільки для вимірів І використовуються препарати без руйнування тканин кореня одразу по завершення операції обробки рослин доступними формами металу. Термостатування кювети із зразком в процесі отримання спектральних параметрів стає непотрібним. Ефект зв'язування металу встановлюють за диференційним спектром, який визначено за різницею спектрального розподілу відбитого світлового потоку препаратами дослідних і контрольних рослин безпосередньо в тканині кореня за власними характеристиками хелатора, який модифіковано 4 комплексоутворенням з різними металами замість спектральних параметрів певного металу в зруйнованій рослинній тканині порівняно із стандартним розчином солі металу. Внаслідок цього забезпечується спрощення процедур підготовки препарату до аналізу і виміру діагностичного показника. Проводять обробку коренів рослин розчинами солей металів або пророщують насіння дослідних рослин на живильних розчинах з доступними формами металів. Одночасно проводять обробку контрольних рослин в аналогічних умовах при відсутності дії металу. Заповнюють кювету коренями дослідних рослин. Аналогічно готують препарат для контрольних рослин. Вимірюють на спектрофотометрі розподіл інтенсивності відбитого світлового потоку препаратами залежно від довжини хвилі випромінювання в діапазоні 450-750нм. Розраховують диференційний спектр за різницею оптичної густини при однаковій довжині хвилі дослідних і контрольних зразків з інтервалом 5-10нм. При наявності максимуму в диференційному спектрі при 540-670нм встановлюють ефект зв'язування металу хелатором в рослинній тканині. Приклад 1 Для оцінки ефекту зв'язування іонів свинцю в тканині кореня пророщували насіння кукурудзи гібриду Дніпровський 145MB в р улонах фільтрувального паперу на 1,8·10-4моль/л розчині нітрату свинцю та воді (контроль) при однаковій кількості тест-рослин (n=30) та об'ємі живильного розчину (200мл). По завершенні тестування (8 діб) заповнювали кювету коренями дослідних рослин. Для порівняння аналогічно готували препарат для контрольних рослин. На спектрофотометрі Спекорд М40 з фотометричною кулею вимірювали розподіл інтенсивності відбитого світлового потоку препаратами залежно від довжини хвилі випромінювання в діапазоні 450-750нм. Розраховували диференційний спектр за різницею оптичної густини при однаковій довжині хвилі дослідних і контрольних зразків з інтервалом 5-10нм. В диференційному спектрі відзначали наявність максимуму при 540нм, який обумовлено ефектом зв'язування іонів свинцю хелатором фенольного типу (ціанідином) в тканині кореня. Отримані результати підтверджують, що для рослин-елімінаторів, до яких належить кукурудза, бар'єрна функція кореневої системи забезпечує стійкість шляхом детоксикації металу за рахунок його зв'язування з ендогенним хелатором. Приклад 2 Аналогічно прикладу 1 проводили визначення ефекту зв'язування при обробці рослин кукурудзи різними концентраціями нітрату кадмію (3·10-5 і 9·10-5моль/л). Для підтвердження змін продуктивності паралельно визначали загальноприйняті показники - нагромадження маси кореня та надземної частини дослідних рослин відносно контролю як індекс толерантності (І, %). Для концентрації 3·10-5 Cd2+моль/л в диференційному спектрі максимум не виявлено, що пов'язано з незначним токсичним ефектом цієї дози металу і відсутністю е фекту його детоксикації за рахунок зв'язування. Цей факт підтверджено не 5 85043 значним зниженням маси кореня (l=93%) і відсутністю токсичного впливу на розвиток пагона (l=104%). Посилення токсичного ефекту при збільшенні концентрації Cd2+ до 9·10-5моль/л призводить до підвищення ступеню інгібування росту кореня (l=69%) та наявності максимуму в диференційному спектрі при 590нм як підтвердження детоксикації Cd2+ за рахунок його зв'язування ціанідином. Реалізація цього ефекту в тканині кореня призводить до менш значного токсичного ефекту металу на розвиток пагона (l=95%) порівняно з кореневою системою. Приклад 3 Аналогічно прикладу 1 визначали ефект зв'язування при комбінованій дії свинцю та кадмію на рослини зернового сорго сорту С удзерн-87, для якого характерно нагромадження в коренях хелатора фенольного типу проантоціанідину. Наявність максимуму при 560нм в диференційному спектрі підтвердила ефект зв'язування хелатора з іонами важких металів. Приклад 4 Насіння кукурудзи гібриду Дніпровський 145MB пророщували на воді в рулонах фільтрувального паперу 11 діб. Проводили обробку протягом 1 години відбитків коренів 10-2моль/л розчинами солей біогенних металів в катіонній формі (Mg2+, Al3+, Комп’ютерна в ерстка Т. Чепелев а 6 Mn2+) та водою (контроль). Спектральні параметри вимірювали аналогічно прикладу 1. Утворення зв'язку ціанідину з іонами металів в тканині кореня підтверджено наявністю максимумів в ди ференційних спектрах (Mg2+-605нм, Al3+-580нм, Mn2+670нм). Приклад 5 Аналогічно прикладу 4 встановили ефект зв'язування ціанідину з металами в аніонній формі по наявності максимуму в диференційних спектрах: MoO 2 - - 570, VO- - 600, Cr 2O2 - - 645нм. 3 4 7 Таким чином, наведені приклади підтверджують, що при здійсненні заявленого способу досягнуто спрощення процедур підготовки препарату до аналізу і виміру діагностичного показника при встановленні ефекту зв'язування хелаторами фенольного типу різних металів в рослинній тканині без її руйнування. Джерела інформації: 1. Souza J. F., Rauser W.E. Maize and radish sequester excess cadmium and zinc in different ways // Plant Sci.-2003. - V.165. - P.1009-1022. 2. Hale K.L., McGrath S.P., Lombi E. et al. Molybdenum sequestration in Brassica species. A role for anthocyanins? // Plant Physiol. - 2001. V.126. - P.1391-1402. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601