Спосіб мікроклонального розмноження регенерантів хмелю, вирощених з апексів in vitro

УКРАЇНА (19) UA (11) 92168 (13) C2 (51) МПК (2009) A01H 4/00 C12N 5/04 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (54) СПОСІБ МІКРОКЛОНАЛЬНОГО РОЗМНОЖЕННЯ РЕГЕНЕРАНТІВ ХМЕЛЮ, ВИРОЩЕНИХ З АПЕКСІВ IN VITRO C2 (13) 92168 (11) 0,90 мг/л, з макроелементами за прописом Нича й Нич: KNO3 - 940-960 мг/л, NH4NO3 - 710,0-730,0 мг/л, MgSO4*7Н2О - 180,0-190,0 мг/л, СаСl2 - 160,0170,0 мг/л, КН2РО4 - 60,0-75,0 мг/л, MnSO4*4Н2О 20,0-30,0 мг/л, FeSО*7Н2О - 27,0-28,0 мг/л, Na2ЕДТА*2Н2О - 37,0-38,0 мг/л, при цьому до вітамінів додають фолієву кислоту в кількості - 1-5 мг/л, а тіамін-НС додають у кількості - 1-5 мг/л, піридоксин-НС - 1-5 мг/л, мезоінозит - 80-120 мг/л, крім того як джерело вуглеводів застосовують глюкозу в кількості 20-40 г/л, причому як фітогормони додатково застосовують кінетин у кількості 0,05-0,5 мг/л, а -індолілоцтову кислоту - 6-15 мг/л, при цьому мікроживці вирощують на поживному середовищі при температурі +23-27 °С, освітленості 1,5-3 кілолюкс, при 14-17 годинному світлоперіоді до формування вкоріненого мікросаджанця, далі процес повторюють до одержання необхідної кількості мікросаджанців, причому останні висаджують у суміш торф-пісок у співвідношенні 3:1-3:2 з рН - 5,5-6,5, вологістю 40-70 %, попередньо видаливши залишки поживного середовища із кореневої системи й провівши обробку останньої у фунгіциді. 2. Спосіб мікроклонального розмноження регенерантів хмелю, вирощених з апексів in vitro за п. 1, який відрізняється тим, що поживне середовище формують з мікроелементами за прописом Мурасига й Скуга; Н2ВО3 - 6,2 мг/л, MnSO4*4Н2O - 22,3 мг/л, СоСl2*6Н2О - 0,025 мг/л, CuSО4*5H2О - 0,025 мг/л, ZnSО4*7Н2О - 8,6 мг/л, Na2MoО4*2Н2O- 0,25 мг/л, KJ - 0,83 мг/л, з макроелементами за прописом Нича й Нич: KNО3 - 950,0 мг/л, NH4NО3 - 720,0 мг/л, MgSO4*7Н2O - 185,0 мг/л, СаСl2 - 166 мг/л, КН2РО4 - 68,0 мг/л, MnS04*4Н2O - 25,0 мг/л, FeSO*7Н2O - 27,8 мг/л, Na2ЕДТА*2Н2О - 37,3 мг/л, з вітамінами: фолієва кислота - 2,0 мг/л, тіамін-НС - 2,0 мг/л, піридоксин-НС - 2,0 мг/л, мезоінозит 100,0 мг/л, а глюкозу в кількості 30,0 г/л, індолілоцтову кислоту - 10,0 мг/л, кінетин - 0,1 мг/л. UA (21) a200711787 (22) 25.10.2007 (24) 11.10.2010 (46) 11.10.2010, Бюл.№ 19, 2010 р. (72) КОРМІЛЬЦЕВ БОРИС ФЕДОРОВИЧ, БАДАМШИНА ЛАРИСА ПАВЛІВНА, ЛЕВЧУК МАРІЯ ГРИГОРІВНА (73) ІНСТИТУТ СІЛЬСЬКОГО ГОСПОДАРСТВА ПОЛІССЯ (56) UA A 59131, 12.02.2003 RU C2 2171841, 02.11.1999 RU C1 2171840, 29.05.2000 UA С2 85571, 02.06.2006 Цыренов В.Ж. Основы биотехнологии: культивирование изолированных клеток и тканей растений: учебно методическое пособие. – Улан-Удэ:ВСГТУ, 2003 US A 5731201, 24.03.1998 Клюваденко А. А., Мельничук М. Д. Особливості клонального мікророзмноження хмелю (humulus lupulus l.) на безвірусній основі Науковий вісник Ужгородського університету Серія Біологія, Випуск 21, 2007: 218–224 Прийнято до друку: 1 лютого 2007 р. (57) 1. Спосіб мікроклонального розмноження регенерантів хмелю, вирощених з апексів in vitro, при якому в стерильних умовах один регенерант хмелю ділять на мікроживці за кількістю міжвузлів, укорочують довжину листових пластинок, формують поживне середовище з мікроелементами за прописом Мурасига і Скуга, макроелементами, вітамінами у вигляді тіаміну-НС, піридоксину-НС і мезоінозиту, джерелом вуглеводів, фітогормонів у вигляді -індолілоцтової кислоти, агар-агару, який відрізняється тим, що мікроживці виконують розмірами 10-20 мм із довжиною листових пластинок 0,5-1,0 довжини мікроживця, поживне середовище формують з мікроелементами за прописом Мурасига й Скуга: Н2ВО3 - 6,0-6,5 мг/л, MnSO4*4Н2O 22,0-22,5 мг/л, СоСl2*6Н2О - 0,020-0,030 мг/л, CuSО4*5Н2О - 0,020-0,030 мг/л, ZnSО4*7Н2О - 8,09,0 мг/л, Na2MoO4*2Н2О - 0,20-0,30 мг/л, KJ - 0,80 2 (19) 1 3 Винахід стосується сільського господарства й може бути використаний при одержанні генетично однорідних саджанців нових високопродуктивних сортів хмелю. Відома in vitro технологія оздоровлення, культивування, розмноження та адаптації до умов in vivo рослин хмелю (HUMULUS LUPULUS L) ароматичних сортів, що включає введення в культуру in vitro, оздоровлення методом хіміотерапії та термотерапії, кдонування в умовах in vitro, адаптацію рослин до умов in vivo, при цьому для введення в культуру in vitro рослинних експлантатів їх стерилізують від фполатогенів (бактерій, грибів, вірусів) 70% етанолом протягом 30с, 50% розчином відбілювача протягом 7хп., після кожної стадії промивають рослинний матеріал у стерильній дистильованій воді протягом 48 годин при температурі +38°С проводять термотерапію рослинних зразків, пасують рослинні експлантати на штучних поживних середовищах у стерильних умовах, культивують, клонують на базовому середовищі Мурасіге та Скуга з додаванням (для регенерації мерисистем) фітогормону 6-бензіламінопурину в концентрації 0,2мг/л, для пагоноутворення до середовища Мурасіге та Скуга додають індолілоцетову кислоту в концентрації 0,5мг/л іа гіберелову кислоту 0,5мг/л. пафтилоцетову кисло і у - 0,03мг/л, використовують як носій субстанцій торфомасу, керамзит чи перліт фракцією 3-5мм (див. деклараційний патент України на винахід №59131 А, МПК А01Н4/00, 2003p.). Однак при такому способі розмноження рослин хмелю можливе утворення калюсної тканини, що підвищує ризик виникнення мутацій та генетичної нестабільності у рослин, що негативно впливає на сортову стабільність матеріалу, що розмножується. Крім того при використанні цього методу регенерація мікросаджанця досягається у два етани, що ускладнює процес одержання садивного матеріалу, при цьому забезпечується розмноження тільки ароматичних сортів хмелю. Завданням по створенню способу мікроклонального розмноження регенерантів хмелю, вирощених із апексів in vitro, що заявляється, є виключення можливості утворення калюсної тканини у рослин, що забезпечить сортову стабільність матеріалу, який розмножується. Поставлене завдання вирішується тим, що при здійсненні способу мікроклонального розмноження регенерантів хмелю, вирощених з апексів in vitro, при якому в стерильних умовах один регенерант хмелю ділять на мікроживці за кількістю міжвузлів, укорочують довжину листових пластинок, формують поживне середовище з мікроелементами за прописом Мурасига Й Скуга, макроелементами, вітамінами у вигляді тіаміну-НС, пірідоксину-НС і мезо-інозиту, джерелом вуглеводів, фітогармопів у вигляді β-індолілоцетової кислоти, агар-агару, згідно ί винаходом мікроживці виконують розмірами 10-20мм із довжиною листових пластівок - 0,5-1,0 довжини мікроживця, поживне середовище формують із макроелементами за прописом Нича й Нич, при цьому до вітамінів додають фолієву кислоту в кількості - 1-5мг/л, а тіамін-НС виконують у 92168 4 кількості - 1-5мг/л, пірідоксин-НС - 1-5мг/л, мезоінозит - 80-120мг/л, крім того в якості джерела вуглеводів застосовують глюкозу в кількості - 2040г/л, причому в якості фітогармонів додатково застосовують кінетин у кількості 0,05-0,5мг/л, а βіндолілоцетову кислоту - 6-15мг/л, при цьому мікроживці вирощують на поживному середовищі при температурі +23-27°С, освітленості 1,5-3 кілолюкс, при 14-17 годинному світлоперіоді до формування вкоріненого мікросаджанця, далі процес повторюють до одержання необхідної кількості мікросаджанців, причому останні висаджують у суміш торф-пісок у співвідношенні 3:1-3:2 з РН - 5,5-6,5, вологістю 40-70%, попередньо видаливши залишки поживного середовища із кореневої системи й провівши обробку останньої у фунгіциді. Крім того, вітаміни можуть бути виконані в кількості: фолієва кислота - 2мг/л, тіамін-НС - 2мг/л, пірідоксин-НС - 2мг/л, мезо-інозит - 100мг/л, а глюкоза в кількості - 30і/л, β-індолілоцетова кислота - 10мг/л, кінетин - 0,1мг/л. Застосування пропонованого способу мікроклопального розмноження регенерантів хмелю, вирощених з апексів in vitro, дозволяє забезпечити наступний технічний результат: виключається можливість утворення калюсної тканини у рослин; зменшується собівартість вирощування одного саджанця за рахунок скорочення технологічних операцій і витрат. Крім того: забезпечується сортова стабільність матеріалу, що розмножується; покращуються економічні показники підприємства, що займається розмноженням регенерантів хмелю за рахунок скорочення технологічного процесу; забезпечується розмноження як ароматичних, так і гірких сортів хмелю. Регенеранти хмелю, вирощені з апікальних меристем in vitro, переносять у бокс і живцюють у стерильних умовах за кількістю міжвузлів. З одного регенеранту вирізують 5-8 мікроживців з парою листочків і пазушних бруньок. Живці укорочують до розмірів 15±5мм, якщо листова пластинка має розмір більше живця, годі її обрізають на 1/2-2/3 площі. Нарізані мікроживці за допомогою стерильних пінцетів висаджують на штучне стерильне агаричоване поживне середовище. Регенерацію й клонування мікроживців хмелю проводять на поживному середовищі, в склад якого входять макроелементи за прописом Нича й Нич і мікроелементи за Мурасига й Скуга. Крім мінеральних складових до складу середовища вводять вітаміни: тіамін-НС - 1-4мг/л. пірідоксин-НС - 1-4мг/л, фолігва кислота - 1-4мг/л, мезо-інозит 100±20мг/л, а також глюкоза - 30±10г/л, агар-агар 4,0±0,5г/л і фітогормони: кінетин у концентрації 0,05-0,5мг/л і β-індолілоцетову кислоту у концентрації 10,0±4,0мг/л. Вирощують при температурі +24-27°С, освітленості 2-3 кілолюкс, при 16 5 92168 годинному світловому періоді протягом 30-40 діб, а потім операцію повторюють до одержання необхідної кількості регенерантів. Для одержання мікросаджанців, придатних для висаджування в ґрунт, готовлять торфосуміш, змішуючи торф і пісок у співвідношенні 3:1. Вологість суміші повинна бути в межах 40-70 %, РН 5,0-6,5. Після одержання потрібної кількості регенерантів останні відмивають водою від агару й висаджують у посудини, заповнені торфосумішшю, 6 поміщають у культуральну кімнату. Акліматизацію проводять при температурі - +22-27°С, відносної вологості повітря 70-95%, освітленості 2-3 кілолюкс і довжині світлоперіода 16 годин. У таких умовах рослини витримують протягом двох тижнів після чого переносять у теплицю для дорощування. Результати досліджень впливу вмісту компонентів поживного середовища на розвиток мікроживців хмелю зведені в таблицю 1. Таблиця 1 № з/п Параметри 1 Фолієва кислота 2 Тіамін-НС 3 Пірідоксин-НС 4 Мезо-інозит 100мг/л - утворення корін80мг/л - утворення коріння спостерігається у 99% ня знижується на 20% мікроживців Глюкоза 30г/л - забезпечується оп20г/л - процес утворення тимальний процес утвокоріння недостатній, гарення коріння та ріст пагольмується ріст пагонів нів 5 6 7 Мінімальна концентрація Оптимальна концентрація 1мг/л - знижується інтен- 2мг/л - інтенсивність розсивність розвитку витку оптимальна 1мг/л - знижується інтен- 2мг/л - інтенсивність розсивність розвитку витку оптимальна 1мг/л - знижується інтен- 2мг/л - інтенсивність розсивність розвитку витку оптимальна Індолілоцетова ки- 6мг/л - процес утворення слота коріння недостатній Кінетин 0,05мг/л - інтенсивність розвитку недостатня Комп’ютерна верстка А. Рябко 10мг/л - забезпечується 100% утворення коріння 0,1мг/л - забезпечується 100% утворення коріння Підписне Максимальна концентрація 5мг/л - уповільнюється ріст 5мг/л - уповільнюється ріст 5мг/л - уповільнюється ріст 120мг/л - утворення коріння спостерігається у 99% мікроживців, але зростають витрати 40г/л - забезпечується оптимальний процес утворення коріння та ріст пагонів, по зростають витрати 15мг/л - гальмується ріст пагонів, знижується інтенсивність розвитку. 0,5мг/л - затримується процес утворення коріння Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601