Стрептокіназа, що активує плазмін, спосіб і набір для отримання плазміну

Реферат: Винахід належить до стрептокінази, іммобілізованої на матриці, яка активує плазміноген в плазмін, при цьому залишаючись стійкою до розщеплення плазміном в порівнянні з відповідною їй стрептокіназою дикого типу, яка містить амінокислотну послідовність, що має аспарагін в UA 103771 C2 (12) UA 103771 C2 положеннях, які відповідають положенням 85 і 412 в SEQ ID NO:1 та до способу отримання плазміну, який включає контактування стрептокінази, іммобілізованої на матриці або матриці, яка має іммобілізовану на ній стрептокіназу, з плазміногеном, таким чином перетворюючи плазміноген в плазмін; і b) очищення плазміну, а також до набору для отримання плазміну. UA 103771 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ По даній заявці, згідно з 35 USC §119, вимагається пріоритет попередньої заявки США № 61/058677, поданої 4 червня 2008 року, зміст якої повністю включений за допомогою посилання в даний опис. ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ Даний винахід належить до композицій і способів отримання плазміну, зокрема, до композицій і способів отримання плазміну з використанням іммобілізованої стрептокінази. РІВЕНЬ ВИНАХОДУ Згустки крові (тромби) складаються з волокнистої мережі, розчиняти яку здатний протеолітичний фермент плазмін. Фермент утворюється з неактивного проферменту плазміногена, який є компонентом плазми крові, під дією активатора плазміногена. Існують два імунологічно відмінних активатори плазміногена ссавців. Ендогенний активатор плазміногена, який також називається урокіназою, являє собою фермент, що виробляється ниркою, і його можна виділяти з сечі. Також джерелом його отримання може бути ряд тканинних культур. Екзогенний активатор плазміногена, який також називається судинним активатором плазміногена і тканинним активатором плазміногена (t-PA), можна виділяти з багатьох тканинних гомогенатів (зокрема, з людської матки), клітинної стінки судин і з деяких клітинних культур. У доповнення до вказаних двох видів активатора плазміногена також існує бактерійний продукт стрептокіназа (стрептокіназа), що отримується зі стрептококів. З розширенням застосування в клінічній практиці артеріальних і венозних катетерів локальна доставка активного плазміну надає привабливі терапевтичні можливості для тромболітичної терапії або відновлення прохідності затромбованих катетерів. Для цього існує ряд причин: 1) будучи активною протеазою серину, плазмін являє собою прямий розчинник тромбу на відміну від активаторів плазміногена, для яких необхідний субстрат (плазміноген) поблизу тромбу; 2) направлену локальним катетером тромболітичну терапію з активним плазміном можна інтенсифікувати до будь-якого рівня, необхідного для досягнення повного розчинення тромбу; 3) теоретично плазмін також може бути безпечнішим тромболітиком, оскільки нижче дозування, необхідне для локальної доставки, може зменшувати або навіть усувати ускладнення у вигляді кровотечі, пов'язані з високими дозами тромболітичної терапії, і будь-яка потенційна залишкова дія плазміну в безпосередній близькості до тромбованої ділянки буде швидко нейтралізована за допомогою циркулюючого α2-антиплазміну. Існує декілька технічних проблем, пов'язаних з очищенням плазміну, особливо при його терапевтичному застосуванні і доставці. Плазмін є активною протеазою серину, яка має тенденцію до аутолізу і інактивації при фізіологічному рівні pH. На жаль, розщеплення плазміну найбільш виражене в діапазоні рівня pH, який необхідний для вияву його функції, тобто, для розчинення тромбу. У цей час в способах комерційного застосування активації отриманого з плазми плазміногена в плазмін задіяна розчинна стрептокіназа в реакції, яка здійснюється в рідкій фазі. Продукований в цій реакції активації плазмін не є повністю стабілізованим проти аутопротеолізу, поки продовжується етап активації до бажаного ступеня перетворення плазміногена в плазмін. Під час вказаної активації стрептокіназа розщеплюється плазміном, що вимагає видалення з кінцевого продукту множини молекулярних сполук стрептокінази. Додатково, знову утворені молекули плазміну можуть також почати розщеплювати інші молекули плазміну/плазміногена, що призводить до втрати цінного продукту, тобто, плазміну. Таким чином, в цей час існує потреба в простих і ефективних способах або методиках отримання плазміну. Додатково бажано, щоб такий спосіб призводив до отримання розчинів плазміну, які по суті не містять стрептокіназу, таким чином, щоб при бажанні можна було застосовувати плазмін для введення (наприклад, парентерального) як фармацевтичний засіб. СУТЬ ВИНАХОДУ У одному аспекті даний винахід належить до композиції, що містить стрептокіназу, іммобілізовану на матриці. Стрептокіназа являє собою мутантну стрептокіназу, яка відрізняється здатністю до активації плазміногена в плазмін, при цьому стійку до розщеплення плазміном в порівнянні з відповідною їй стрептокіназою дикого типу. У іншому аспекті даний винахід належить до виробу, що містить матрицю з іммобілізованою на ній стрептокіназою, при цьому стрептокіназа являє собою мутантну стрептокіназу, яка відрізняється здатністю до активації плазміногена в плазмін, при цьому стійку до розщеплення плазміном в порівнянні з відповідною їй стрептокіназою дикого типу. У деяких аспектах даний винахід належить до способу отримання плазміну. Спосіб включає: a) контактування композиції, що містить плазміноген, зі стрептокіназою, іммобілізованою на матриці з перетворенням таким чином плазміногена в плазмін; і 1 UA 103771 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 b) очищення плазміну. У інших аспектах даний винахід належить до набору для отримання плазміну. Набір містить: a) стрептокіназу, іммобілізовану на матриці, при цьому стрептокіназа є мутантною стрептокіназою, яка відрізняється здатністю до активації плазміногена в плазмін, при цьому стійку до розщеплення плазміном в порівнянні з відповідною їй стрептокіназою дикого типу; і b) зв'язуючу плазмін матрицю з розташованою на ній молекулою, яка має афінність до плазміну. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Фіг. 1 показує нуклеотидну послідовність (а саме, SEQ ID NO:3), яка містить відкриту рамку зчитування (позначену великими буквами), що кодує подвійний поліпептид мутантної стрептокінази. Показана відкрита рамка зчитування, фланкована ділянками рестрикційного ферменту (які позначені малими буквами), призначеними для клонування. Фіг. 2 показує амінокислотну послідовність (SEQ ID NO:4) поліпептидного продукту вектора експресії pET21 (pET System, Novagen, Madison, WI), що містить відкриту рамку зчитування (позначену великими буквами), показану в SEQ ID NO:3. Мутації від лізину (K) до аргініну (N) в поліпептиді стрептокінази підкреслені однією лінією. Амінокислотний залишок ізолейцину (I), який відповідає N-кінцю послідовності стрептокінази, виділений подвійним підкресленням. Фіг. 3 показує амінокислотну послідовність (SEQ ID NO:5) поліпептидного продукту вектора експресії pET32 (pET System, Novagen, Madison, WI), що містить відкриту рамку зчитування (позначену великими буквами), показану в SEQ ID NO:3. Мутації від лізину (K) до аргініну (N) в поліпептиді стрептокінази підкреслені однією лінією. Амінокислотний залишок ізолейцину (I), який відповідає N-кінцю послідовності стрептокінази, виділений подвійним підкресленням. Фіг. 4 показує амінокислотну (послідовність SEQ ID NO: 6) поліпептидного продукту вектора експресії pET41 (pET System, Novagen, Madison, WI), що містить відкриту рамку зчитування (позначену великими буквами), показану в SEQ ID NO:3. Мутації від лізину (K) до аргініну (N) в поліпептиді стрептокінази підкреслені однією лінією. Амінокислотний залишок ізолейцину (I), який відповідає N-кінцю послідовності стрептокінази, виділений подвійним підкресленням. Фіг. 5 показує електрофорез в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію SDSPAGE при фарбуванні Кумасі синім очищеної рекомбінантної стрептокінази (смуга 1); маркера молекулярної маси (ММ) SeeBlue® Plus 2 (Invitrogen, Carlsbad, CA) (смуга 2); і рекомбінантного плазміногена (смуга 3). Фіг. 6 представляє SDS-PAGE і показує залежність від часу для перетворення рекомбінантного плазміногена в рекомбінантний плазмін, що каталізується рекомбінантною стрептокіназою. Показники часу = 0 годин (смуга 1); 2 години (смуга 2); 4 години (смуга 3); 6 годин (смуга 4); і 18 годин (смуга 5). Смуги 6, 7, і 8 відповідають контрольній рекомбінантній стрептокіназі, контрольному рекомбінантному плазміногену і маркеру ММ (SeeBlue® Плюс 2), відповідно. Фіг. 7 представляє вестерн-блотинг експерименту визначення залежності від часу, показаного в фігурі 6, з використанням поліклональних анти-стрептокіназних антитіл. Показники часу = 0 годин (смуга 1); 2 години (смуга 2); 4 години (смуга 3); 6 годин (смуга 4); і 18 годин (смуга 5). Смуги 6, 7 і 8 належать до контрольної рекомбінантної стрептокінази, контрольного рекомбінантного плазміногена і маркера ММ (SeeBlue® Плюс 2), відповідно. ДОКЛАДНИЙ ОПИС Спосіб очищення плазміну, розкритий в даному винаході, є простим, ефективним, відтворюваним і надійним. Вказаним способом можна отримувати достатню кількість високо очищеного плазміну, що має активність, порівнянну з потенційною активністю очищених препаратів плазміногена. Очищення може щонайменше зберігати активність плазміну або навіть збільшувати її. У кінцевому плазміні міститься мінімальна кількість стрептокінази або вона відсутня, оскільки її наявність небажана для терапевтичного застосування. У одному варіанті здійснення спосіб очищення плазміну включає наступні основні етапи: етап a: активація плазміногена в плазмін з використанням іммобілізованої стрептокінази, де вказана стрептокіназа являє собою мутантну стрептокіназу, яка відрізняється здатністю до активації плазміногена в плазмін, при цьому стійку до розщеплення плазміном в порівнянні з відповідною їй стрептокіназою дикого типу; і етап b: захоплення активного плазміну на плазмін-захоплюючій матриці, такій як, наприклад, бензамідин-сефароза. Необов'язково, спосіб додатково включає елюювання пов'язаного плазміну з буфером з низьким рівнем pH; і, додатково необов'язково, приготування кінцевого плазміну в підкисленій до рівня pH 3,7 воді. 1. Стрептокіназа 2 UA 103771 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 У даному винаході розглянута стрептокіназа природного походження, а також рекомбінантна стрептокіназа. Без зв'язку з конкретною теорією передбачається, що під механізмом активації стрептокінази мають на увазі утворення стехіометричного комплексу з плазміногеном. Поняття "природного походження", яке використовується в даному винаході застосовно до стрептокінази, належить до того факту, що таку стрептокіназу можна виділяти з природного джерела, і людина не піддавала її навмисній модифікації в лабораторії. Мається на увазі, що стрептокінази природного походження включають стрептокіназу "мутантних" форм природного походження, які є стійкими до плазміну в порівнянні зі стрептокіназою "дикого типу" природного походження. "Рекомбінантна" стрептокіназа належить до стрептокіназ, які отримуються технологією рекомбінантної ДНК, тобто продукуються з клітин, трансформованих екзогенною конструкцією ДНК, що кодує бажану стрептокіназу, яка може бути стрептокіназою дикого типу або плазмінрезистентним мутантом. "Синтетичні" стрептокінази являють собою стрептокінази, отримані шляхом хімічного синтезу. Стрептокіназа природного походження продукується певними Streptococci і певними бактеріями, які несуть відповідний генетичний матеріал, отриманий з Streptococci груп Lancefield А, С або G. Наприклад, стрептокіназу можна отримувати з культур штаму H46A S. equisimilis. Описані численні способи очищення стрептокінази, що включають, наприклад, патенти США №№ 2701227, 2702781, 2677642, 2677643, 2691620, 2784145, 3226304, 3255094, 3419472, 3444045, 3980772, 4381346, RE32271 і 5334384, які включені за допомогою посилання в даний опис. У стрептокіназі не містяться амінокислоти цистеїн або цистин, на відміну від стрептолізину або стрептодорнази, які є звичайними домішковими білками, що являють собою домішки в препаратах стрептокінази природного походження (Einarsson et al., Biochim, Biophys. Acta 568:19-29 (1979); De Renzo et al, J. Biol. Chem. 242, 533-542 (1967)). Було запропоновано використати вказану структурну відмінність для отримання способу очищення стрептокінази з ферментаційного бульйону. Наприклад, патент США № 5334384 описує спосіб відділення стрептокінази від домішкових білків в суміші, що містить стрептокіназу, і вказаний спосіб включає обробку суміші відновником для відновлення дисульфідних містків в домішкових білках, щоб звільнити тіолові групи, контактування суміші з реактивом, здатним до реакції з вільною тіоловою групою і з тіолвмісною матрицею, і після цього сепарацію хімічно модифікованих домішкових білків, що отримуються з суміші, щоб отримати форму стрептокінази, яка по суті не містить домішкових білків. Ген, що кодує стрептокіназу, був виділений з його природного джерела (види Streptococcus), і клонувани в декілька гетерологічних мікроорганізмів, таких як дріжджі (Hagenson et al., Enzyme. Microb. Technol. 11:650 (1989)), бактерії, а саме, Е. coli (Malke et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 81:3557 (1984)), інші види Streptococcus (Malke et al., MoI. Gen. Genet. 196:360 (1984)), і Bacillus (Wong et al., Applied and Env. Microbiol 1:517 (1994)), всі з яких включені в даний винахід з посиланням на їх теорії, що належать до виділення і клонування стрептокінази. Додатково, в даний винахід включені посилання на Caballero et al., Infection and Immunity, 67:6478-6486 (1999) в частині їх теорії, яка належить до клонування і характеристик стрептокіназ, які продукують виділені свинячі і кінські Streptococcus equisimilis, і до використання матриці для іммобілізації рекомбінантного білка. Таблиця 1 показує амінокислотну послідовність стрептокінази, що кодується геном стрептокінази зі штаму H46A Streptococcus equisimilis, що опубліковано Malke et al, Gene 34:357-362 (1985) (див. також GenBan, номер доступу 1106184A), і включено в даний винахід за допомогою посилання. 3 UA 103771 C2 Таблиця 1 Амінокислотна послідовність стрептокінази згідно з номером доступу 1106184A GENBANK † Амінокислотна послідовність (SEQ ID NO: 1) 1 61 121 181 241 301 361 421 MKNYLSFGMF ALLFALTFGT VNSVQAIAGP EWLLDRPSVN NSQLWSVAG TVEGTNQDIS LKFFEIDLTS RPAHGGKTEQ GLSPKSKPFA TDSGAMSHKL EKADLLKAIQ EQLIANVHSN DDYFEVIDFA SDATITDRNG KVYFADKDGS VTLPTQPVQE FLLSGHVRVR PYKEKPIQNQ AKSVDVEYTV QFTPLNPDDD FRPGLKDTKL LKTLAIGDTI TSQELLAQAQ SILNKNHPGY TTYERDSSIV THDNDIFRTI LPMDQEFTYR VKNREQAYRI NKKSGLNEEI NNTDLISEKY YVLKKGEKPY DPFDRSHLKL FTIKYVDVDT NELLKSEQLL TASERNLDFR DLYDPRDKAK LLYNNLDAFG IMDYTLTGKV EDNHDDTNRI ITVYMGKRPE GENASYHLAY DKDRYTEEER EVYSYLRYTG TPIPDNPNDK † Вказані 26 амінокислот, які відповідають сигнальній послідовності, підкреслені (зрілий білок починається з ізолейцину (I) в положенні 27). Залишки лізину (K) в положенні 85 і 412 підкреслені подвійною лінією (K: лізин). 5 10 15 20 25 30 35 40 Додатково, стрептокіназа є комерційно доступною, як наприклад, стрептокіназа з βгемолітичного стрептокока (група С Lancefield) (Sigma-Aldrich Corp., St-Louis, MO) і рекомбінантна стрептокіназа, яка продукується E.Coli шляхом хроматографічних технологій (ABR-Affinity BioReagents Inc, Golden, CO). Додатково, були описані (ЕС 0397366 А1) генетично модифіковані похідні стрептокінази, що містять крингл-домени зв'язування фібрину, які походять з плазміногена, і способи їх отримання способами рекомбінантної ДНК. У деяких варіантах здійснення стрептокіназа, яка повинна бути іммобілізована, є рекомбінантною стрептокіназою (наприклад, рекомбінантом дикого типу або мутантом, стійким до плазміну), що отримується шляхом експресії з рекомбінантної ДНК або в умовах in vivo або in vitro. Рекомбінантна технологія є загальноприйнятою і відомою в даній галузі техніки. Афінні мітки амінокислоти можна вставляти за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. Експресії можна здійснювати in vivo, використовуючи як бактерії (наприклад, Е. coli), нижчі еукаріоти (наприклад, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe, Pichia pastoris) або вищі еукаріоти (наприклад, бакуло-інфіковані клітини комах, клітини комах, клітини ссавців), так і in vitro (лізати Е. coli, екстракти зародків пшениці, лізати ретикулоцитів). Стрептокіназу можна очищати афінною хроматографією з використанням комерційно доступних смол. Послідовності ДНК, що кодують амінокислотні афінної мітки і адапторні білки, можна конструювати у вектори експресії таким чином, що гени, які розглядаються, можна клонувати в рамці або 5' або 3' послідовності ДНК, що кодує афінну мітку і адапторний білок. Вектор може нести початок реплікації і ген, здатний додавати клітині-хазяю стійкості до антибіотиків. Вставка цього вектора може містити промоторну послідовність, ген, що кодує стрептокіназу, яка розглядається, необов'язково, послідовність, що кодує поліпептидну афінну мітку, і сигнальну послідовність термінації. Необов'язково, вектор може також містити послідовність, яка кодує молекулу поліпептидного адаптора, переважно розташовану між ділянками, що кодують білок і афінну мітку. Для експресії in vivo білків можна клонувати кДНК в комерційно доступні вектори експресії (наприклад, що поставляються компаніями Qiagen, Novagen, Clontech) і вводити у відповідний організм для експресії. Для експресії in vitro ПЛР-ампліфіковані послідовності ДНК можна використовувати безпосередньо спареними in vitro в системах транскрипції/трансляції (наприклад, лізати Е. coli S30, отримані експресією РНК полімерази T7, переважно протеазодефіцитні штами, лізати пшеничних зародків, лізати ретикулоцитів з мікросомами і без мікросом (наприклад, що поставляються компаніями Promega, Pharmacia, Panvera)). Полімеразні ланцюгові реакції (ПЛР) можна проводити в стандартних умовах або оптимізувати без невиправданого експериментування. Олігонуклеотидні праймери можуть нести унікальні сайти рестрикції для полегшення клонування у вектори експресії. Альтернативно, можна використовувати клонуючу систему TA (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA). Вектори експресії містять послідовності для афінних міток і білкових адапторів. Продукти ПЛР лігують у вектори експресії (за допомогою індуцибельних промоторів), і вводять у прийнятний компетентний штам Е. coli шляхом кальційзалежної трансформації (штами включають в себе: XL-1 Blue, BL21, SG13009 (lon-)). Культури можна вирощувати до 4 UA 103771 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 середини логарифмічного зростання, індукованого для експресії, і збирати клітини шляхом центрифугування. Клітини, що містять лізозим, можна ресуспендувати і руйнувати мембрани швидкими циклами заморожування/відтавання або за допомогою ультразвуку. Клітинний дебрис можна видаляти шляхом центрифугування, і можна додавати до супернатантів прийнятну матрицю афінності. Стрептокіназа, яка розглядається, є зв'язаною, неспецифічно зв'язані білки видаляють повторними етапами промивання. Альтернативно, можна використовувати магнітні кульки для афінності і пристрої для фільтрації (QIAGEN, Inc, Valencia, CA). Для Saccharomyces cerevisiae можливо глікозилування серцевини і ліпідна модифікація білків. Підхід, описаний вище для Е. coli, можна застосовувати з невеликими модифікаціями для трансформації і лізису клітин. Трансформацію Saccharomyces cerevisiae можна здійснювати ацетатом літію, і лізувати клітини можна або шляхом літиказного розщеплення клітинної стінки з подальшим заморожуванням/відтаванням, обробкою ультразвуком або екстракцією скляними намистинами. Якщо бажано, варіанти посттрансляційних модифікацій можна отримувати з різними штамами дріжджів (а саме, Saccharomyces pombe, Pichia pastoris). Перевага бакуловірусної системи або клітин ссавців полягає у великій кількості можливих посттрансляційних модифікацій. Для бакуло-системи необхідне клонування вірусів, отримання початкових високих титрів і інфікування рідких суспензій клітин комах (клітини - SF9, SF21). Для експресії на основі клітин ссавців необхідні трансфекції і клонування клітинних ліній. Відбір розчинних білків здійснюють з середовища, тоді як внутрішньоклітинні або зв'язані з мембраною білки вимагають лізису клітини (або солюбілізацію детергентом, відтавання/заморожування). Потім білки можна очищати аналогічно процедурі, описаній для Е. coli. Для трансляції in vitro системою вибору є лізати Е. coli, отримані з протеазо-дефіцитних штамів і штамів з надекспресією РНК-полімерази T7. Лізати E. coli забезпечують ефективну експресію білка (30-50 мкг/мл лізатів). Весь процес здійснюють в 96-ямкових матрицях. Гени, які розглядаються, ампліфікують за допомогою ПЛР з використанням олігонуклеотидів, які містять ген-специфічні послідовності, що містять промотор РНК-полімерази T7 і зв'язувальну дільнку, і послідовність, що кодує афінну мітку. Альтернативно, адапторний білок можна зливати з геном, який розглядається, з допомогою ПЛР. Для швидкого аналізу ампліфіковані ДНК можна напряму піддавати транксрипції і трансляції в лізати Е. coli без попереднього клонування. Потім білки виділяють шляхом зв'язування з матрицею афінності і процесують, як описано вище. Можливі для використання альтернативні системи включають екстракти пшеничних зародків і екстракти ретикулоцитів. Для синтезу мембранних білків in vitro і/або посттрансляційно модифікованих білків будуть потрібні лізати ретикулоцитів в комбінації з мікросомами. a) Плазмін-резистентна стрептокіназа Стрептокіназа є лабільним білком, сприйнятливим до розщеплення в реакції з плазміном. Виявлено, що фрагменти розщепленої плазміном стрептокінази виявляють слабшу дію як активатора плазміногена в порівнянні з нативною стрептокіназою (Shi et al., Biochem. J. 304: 235-241 (1994)). Були заздалегідь визначені пептидні зв'язки молекули стрептокіназ, які гідролізуються плазміном (Shi et al, див. вище). Плазмін специфічно каталізує гідроліз пептидних зв'язків, що мають на аміно-кінці Lys і Arg. Більш конкретно, пептидний зв'язок стрептокінази Lys59-Ser60 належить до нечисленних пептидних зв'язків, які розщеплюються на початку реакції з плазміном, тоді як NH2-кінцевий пептид Ile1-Lys59 необхідний для стабілізації структури стрептокінази (Shi et al., вище). Таким чином, можна сконструювати більш стійку мутантну стрептокіназу шляхом сайт-направленого мутагенезу або іншими прийнятними способами генетичного клонування, в яких можна запобігти ранньому гідролізу плазміном пептидного зв'язку Lys59-Ser60. Мутантні форми стрептокінази описані, наприклад, в патентах США № 587699, 5854049, 6413759, 6309873 і авторами Wu et al., Applied and Environmental Microbiology, 64:824-829 (1998), всі з яких повністю включені в даний опис. У одному варіанті здійснення стрептокіназа являє собою мутантну стрептокіназу, яка відрізняється здатністю до активації плазміногена в плазмін і зберігає стійкість до розщеплення плазміну відносно відповідної їй стрептокінази дикого типу. У іншому варіанті здійснення стрептокіназа містить амінокислотну послідовність, що має амінокислоту, яка відрізняється від лізину в положенні, відповідному положенню 85, 412, або в обох положеннях в SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення амінокислотою, відмінною від лізину в положенні, відповідному положенню 85, 412, або обом положенням в SEQ ID NO:1, є аспарагін або глутамін. У одному варіанті здійснення поліпептид стрептокінази містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:2 (таблиця 2). У іншому варіанті здійснення поліпептид стрептокінази містить амінокислотні залишки 27-440, показані в SEQ ID NO:2 (таблиця 2). 5 UA 103771 C2 Таблиця 2 Амінокислотна послідовність, яка відповідає плазмін-резистентній стрептокіназі відповідно до одного варіанту здійснення † Амінокислотна послідовність (SEQ ID NO: 2) 1 61 121 181 241 301 361 421 MKNYLSFGMF ALLFALTFGT VNSVQAIAGP EWLLDRPSVN NSQLWSVAG TVEGTNQDIS LKFFEIDLTS RPAHGGKTEQ GLSPNSKPFA TDSGAMSHKL EKADLLKAIQ EQLIANVHSN DDYFEVIDFA SDATITDRNG KVYFADKDGS VTLPTQPVQE FLLSGHVRVR PYKEKPIQNQ AKSVDVEYTV QFTPLNPDDD FRPGLKDTKL LKTLAIGDTI TSQELLAQAQ SILNKNHPGY TIYERDSSIV THDNDIFRTI LPMDQEFTYR VKNREQAYRI NKKSGLNEEI NNTDLISEKY YVLKKGEKPY DPFDRSHLKL FTIKYVDVDT NELLKSEQLL TASERNLDFR DLYDPRDKAK LLYNNLDAFG IMDYTLTGKV EDNHDDTNRI ITVYMGKRPE GENASYHLAY DNDRYTEEER EVYSYLRYTG TPIPDNPNDK † Вказані 26 амінокислот, які відповідають сигнальній послідовності, підкреслені (зрілий білок починається з ізолейцину (I) в положенні 27). Мутації K85N і K412N підкреслені подвійною лінією (K: лізин; N: аспарагін). 5 10 15 20 25 30 35 40 У інших варіантах здійснення послідовність стрептокінази, необов'язково, додатково містить полярні або заряджені залишки в одному або декількох положеннях, які відповідають положенням 406-410 в SEQ ID NO:1. 2. Іммобілізована стрептокіназа Іммобілізовану стрептокіназу можна використовувати для активації плазміногена в плазмін. Такий підхід забезпечує невелику кількість домішок в кінцевому препараті безпосередньо зі стрептокіназою, або їх відсутність. Існує велика кількість методик іммобілізації стрептокінази. Стрептокіназу можна адсорбувати на прийнятну матрицю. Наприклад, з публікацій відомо, що стрептокіназа зберігає здатність до активації плазміногена в плазмін, якщо стрептокіназа щільно зв'язана з нітроцелюлозою (Kulisek et al., Analytical Biochemistry 177:78-84 (1989)). Також адсорбція стрептокінази на прийнятній іоннообмінній смолі може призводити до її іммобілізації із збереженням здатності до активації плазміногена. Іммобілізована стрептокіназа була описана авторами Rimon et al., Biochem. Biophy. Acta 73:301 (1963), які використовували діазотизований співполімер р-амінофенілаланіну і лейцину. Ці автори використовували іммобілізовану стрептокіназу для вивчення механізму активації плазміногена. Дослідники Sugitachi et al., Thrombos. Haemostas (Stuttg). 39:426 (1978) описали іммобілізацію активатора плазміногена урокінази на нейлоні. У патенті США № 4305926, включеному у винахід за допомогою посилання, пропонується іммобілізація стрептокінази на біосумісний полімер, такий як нейлон, дакрон, колаген, полівінілпіролідин або співполімер рамінофенілаланіну і лейцину. У одному варіанті здійснення стрептокіназу іммобілізують на поверхні, використовуючи афінну мітку, як описано в патенті США № 6406921, який повністю включений в даний опис за допомогою посилання. Поверхня може бути або органічною або неорганічною, біологічною або небіологічною, або являти собою будь-яку комбінацію вказаних матеріалів. У одному варіанті здійснення поверхня є прозорою або просвічувальною. Для використання як поверхні підходить множина матеріалів. Наприклад, поверхня може містити матеріал, вибраний з групи, яка складається з силікону, кремнію, кварцу, скла, скла з регульованими порами, вуглецю, оксиду алюмінію, діоксиду титану, германію, нітриду кремнію, цеолітів і арсеніду галію. Ряд металів, таких як золото, платина, алюміній, мідь, титан і їх сплави також є варіантами для поверхонь. Додатково, також можна використовувати багато які керамічні і полімерні матеріали. Полімери, які можна використовувати як поверхню, включають без обмеження наступне: полістирол; полі(тетра)фторетилен; (полі)вінілідендифторид; полікарбонат; поліметилметакрилат; полівінілетилен; поліетиленімін; полі(ефірефір)кетон; поліоксиметилен (ПОМ); полівінілфенол; полілактиди; поліметакрилімід (ПМІ); поліалкенсульфон (ПАС); полігідроксіетилметакрилат; полідиметилсилоксан; поліакриламід; поліімід; блок-співполімери; і Eupergit™ Photoresists, полімеризовані плівки Ленгмюра-Блоджетта (Langmuir-Blodgett), і структури LIGA, які можуть також служити як поверхні в даному винаході. Термін "афінна мітка", який використовується в даному винаході, належить до функціональної групи, здатної до іммобілізації білка на функціональні групи, які виступають на 6 UA 103771 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поверхні. У деяких випадках афінною міткою може бути проста хімічна функціональна група. Інші варіанти включають амінокислоти, поліпептиди, білки, двошарові ліпіди або гідрогель. Афінна мітка може бути сполучена з білком або ковалентно, або нековалентно (наприклад, за допомогою хімічної сполуки або як злитий білок). Аналогічно, афінна мітка може як ковалентно, так і нековалентно зв'язуватися з поверхневим шаром. Термін "адапторна молекула" в даному винаході означає будь-яку структуру, яка зв'язує афінну мітку з білком. Адапторна молекула не повинна бути обов'язково дискретною молекулою, яка нековалентно приєднана як до афінної мітки, так і до білка. Адапторна молекула може ковалентно приєднуватися до афінної мітки або до білка або до них обох (наприклад, за допомогою хімічної сполуки або як злитий білок). У деяких випадках афінна мітка може також бути внутрішньою частиною білка, наприклад, амінокислотою. Приклади адапторних молекул включають поліпептиди, білки, мембранні якорі і біотин. Термін "злитий білок" належить до білка, що складається з двох або більше поліпептидів, які в нативному стані звичайно не є сполученими, і які сполучаються пептидним зв'язком за допомогою своїх відповідних аміно- і карбоксикінців з утворенням монолітного безперервного поліпептиду. Мається на увазі, що два або більше поліпептидних компонентів можуть сполучатися або прямим або опосередкованим чином за допомогою пептидного лінкера/спейсера. Поверхня може бути покрита шаром органічних молекул. Одна сторона шару може складатися з хімічних функціональних груп на кінцях органічних молекул, які хімічно або фізично сорбовані на матеріалі поверхні (головні групи). Інша сторона шару може виступати на поверхні і може мати будь-яке число хімічних функціональних груп (кінцеві групи). У деяких варіантах здійснення молекули шару високо впорядковані і щільно упаковані, значною мірою завдяки вандер-ваальсовим і гідрофобним взаємодіям між молекулами. Афінна мітка може збільшувати іммобілізацію стрептокінази на поверхні. Афінна мітка може збільшувати зв'язування або посилювати реакції стрептокінази з функціональною групою. Пара афінна мітка/функціональна група можуть допускати іммобілізацію стрептокінази на поверхні так, що не потрібно жорстких умов реакції, які несприятливі для стабільності або функції стрептокінази. Афінна мітка також може передбачати іммобілізацію, яка є специфічною для позначеного сайту або ділянки на стрептокіназі. Для її здійснення приєднання афінної мітки до білка стрептокінази повинно бути сайт-специфічним. Така сайт-специфічна іммобілізація може сприяти гарантії, що активна ділянка білка залишиться доступною для лігандів в розчині. Інша перевага іммобілізації за допомогою афінних міток полягає в тому, що вона дозволяє застосовувати загальну стратегію іммобілізації з множиною різних білків. У деяких варіантах здійснення афінна мітка містить щонайменше одну амінокислоту. Афінна мітка може бути поліпептидом, що містить щонайменше одну активну амінокислоту. Альтернативно, афінна мітка може бути одиночною амінокислотою активного шару органічної молекули, такою як, наприклад, цистеїн, лізин, гістидин, аргінін, тирозин і глутамін. Поліпептидна або амінокислотна афінна мітка переважно експресується як білок, злитий з білком. Амінокислотні мітки несуть або моноамінокислоту або ряд амінокислот, які можуть взаємодіяти з функціональною групою молекулярного шару. Амінокислоти афінної мітки можна легко вставляти в рекомбінантні білки для полегшення іммобілізації, що орієнтується з допомогою ковалентного з'єднання з біореактивною Y-функціональною групою моношару. Афінна мітка може містити полі(амінокислотну) мітку. Полі(амінокислотна) мітка являє собою поліпептид, який містить від близько 2 до близько 100 залишків моноамінокислоти, що необов'язково перериваються залишками інших амінокислот. Наприклад, афінна мітка може містити поліцистеїн, полілізин, поліаргінін або полігістидин. Амінокислотні мітки переважно складаються із залишків моноамінокислоти в кількості від двох до двадцяти, наприклад, таких як гістидини, лізини, аргініни, цистеїни, глутаміни, тирозини або їх будь-які комбінації. У одному варіанті здійснення амінокислотні мітки з однієї - двадцяти амінокислот містять щонайменше від одного до десяти цистеїнів для тіоефірного зв'язку; або від одного до десяти лізинів для амідного зв'язку; або від одного до десяти аргінінів для приєднання до оточуючих дикарбонільних груп. Рядовий фахівець в даній галузі техніки може легко з'єднувати прийнятні афінні мітки із заданими Y-функціональними групами. Амінокислотна мітка може розташовуватися на аміно- або карбоксикінці білка стрептокінази або де-небудь між ними. При відповідності з функцією білка введені для очищення білка афінні мітки переважно розташовані на С-кінці рекомбінантного білка, для гарантії того, що в ході очищення білка виділяють тільки повнорозмірні білки. Афінні мітки можуть також містити одну або декілька неприродних амінокислот. Неприродні амінокислоти можна вводити з допомогою супресорних тРНК, які розпізнають термінуючі кодони 7 UA 103771 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (тобто, амбер-кодони) (Noren et al, Science, 1989, 244:182-188; Ellman et al., Methods Enzym., 1991, 202:301-336; Cload et al., Chem. Biol., 1996, 3:1033-1038). Здійснюють хімічне аміноацилування тРНК, щоб вони містили хімічно змінені ("неприродні") амінокислоти для використання зі специфічними хімічними агентами приєднання (а саме, з кетонними модифікаціями, фотореактивними групами). У деяких варіантах здійснення афінна мітка містить без обмеження цілий білок, такий як глутатіон-S-трансфераза, антитіло, авідин або стрептавідин. Інші способи кон'югації і іммобілізації білка, відомі в даній галузі техніки, можна адаптувати з метою іммоблізації стрептокінази на поверхні. Наприклад, афінна мітка може являти собою органічний біокон'югат, який хімічно приєднаний до стрептокінази. Біотин або антигени можуть бути хімічно зшиті зі стрептокіназою. Альтернативно, можна застосовувати хімічний крос-лінкер, який приєднує на поверхню стрептокінази просту функціональну групу, таку як тіол або амін. У інших варіантах здійснення афінна мітка являє собою компонент шару афінної мітки, іммобілізованої на шарі органічних молекул на поверхні. Наприклад, гідрогель, що складається з такого матеріалу, як декстран, може служити прийнятним шаром афінної мітки. Використання таких гідрогелів для іммобілізації білка описані в патенті США № 5242828. Іншим варіантом матеріалу, придатного для утворення шару афінної мітки, є полілізин (як приклад, див. патент США № 5629213). Шар афінної мітки також може складатися з фосфоліпідного бішару або фосфоліпідного моношару, як описано в публікації РСТ WO 96/38726. Також в додаткових варіантах здійснення адапторна молекула може зв'язувати афінну мітку з іммобілізованою стрептокіназою. Може давати перевагу додатковий простір між білком і поверхнею, який створюється за допомогою адапторної молекули, оскільки білки можуть мати тенденцію до поверхневої інактивації. Рядовий фахівець в даній галузі техніки зможе вибрати адапторну молекулу, яка підходить для заданої афінної мітки. Наприклад, якщо афінною міткою є стрептавідин, то адаптор може являти собою молекулу біотину, хімічно кон'юговану зі стрептокіназою, яку треба іммобілізувати. Альтернативно, якщо афінною міткою є фосфоліпідний бішар або моношар, тоді як прийнятну адапторну молекулу можна вибирати мембранний якір. У одному варіанті здійснення адапторна молекула є поліпептидом, наприклад, білком G або білком A. В іншому варіанті здійснення афінна мітка, адапторна молекула і білок разом складають злитий білок. Такий злитий білок можна легко експресувати за допомогою стандартної технології рекомбінантної ДНК. Адапторні білки є особливо корисними для підвищення розчинності білка, який розглядається, і збільшення відстані між поверхнею і білком, який розглядається. Приклади можливих адапторних білків включають глутатіон-S-трансферазу (GST), мальтозозв'язувальний білок, хітинзв'язувальний білок, тіоредоксин, зелений флуоресцентний білок (GFP). GFP також можна застосовувати для кількісного аналізу поверхневого зв'язування. У іншому варіанті здійснення рекомбінантну стрептокіназу можна іммобілізувати за допомогою афінної хроматографії з використанням іммобілізованих металів (IMAC). Цей хроматографічний спосіб, який являє собою особливо чутливу технологію розділення, також застосовний до більшості типів білків, є технологією, що звичайно застосовується в схемах очищення разом з іншим етапом хроматографії, наприклад, з іонообмінною хроматографією (ІОХ) і/або хроматографією гідрофобного взаємодії (ХГВ). Для IMAC застосовують матриці, які містять групу, здатну до утворення хелату з іоном перехідного металу, і вказаний хелат в свою чергу використовується в хроматографії як ліганд для адсорбції сполуки з рідини. На силу зв'язування в IMAC переважно впливає вид іона металів, рівень pH буферів і природа застосовуваного ліганду. Оскільки іони металів тісно пов'язані з матрицею, адсорбований білок необов'язково можна елюювати або шляхом зниження рівня pH або конкурентного елююванням. Загалом, IMAC придатна для розділення білків або інших молекул, які представляють афінність до іона перехідного металу в матриці. Наприклад, білки будуть зв'язуватися з матрицею в присутності доступних залишків гістидину, цистеїну і триптофану, всі з яких виявляють афінність до хелатуючого металу. У одному варіанті здійснення стрептокіназу можна мітити одним або більше залишками гістидину для підвищення їх афінності до метало-хелатуючих лігандів. Як ліганди для IMAC були запропоновані прості хелатори, такі як імінодиоцтова кислота (IDA). IDA, сполучену з агарозними основами і заряджену потім іонами різних металів, таких як 2+ 2+ 2+ Cu , Zn і Ni , використовували для захоплення білків і пептидів, також вона комерційно доступна у вигляді смол. Більш конкретно, патент США № 4551271 (Hochuli, переуступлений Hoffmann-La Roche Inc), який включений в даний винахід за допомогою посилання, розкриває 8 UA 103771 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 смолу метало-хелатів, яка містить IDA-ліганди. Смолу згідно з описом можна виготовляти відомим способом шляхом обробки агарози епіхлоргідрином або епібромгідрином, проведенням реакції епоксиду, що отримується з динатрієвою сіллю імінооцтової кислоти і перетворення продукту в сіль міді або цинку за допомогою промивання розчином міді (II) або цинку. Обидва патенти - EP 87109892.7 (F. Hoffmann-La Roche AG) і еквівалентний патент США №4877830 (Dobeli et al., переуступлений Hoffmann-La Roche Inc), включені в даний винахід за допомогою посилання на викладену в них теорію іммобілізації білка з використанням смол метало-хелатів. Патент WO 01/81365 (Sigma-Aldrich Co.), який включений у винахід за допомогою посилання на викладену в ньому теорію композицій метало-хелатів, які згідно з описом здатні до утворення відносно стійких хелатів з іонами металів і показують поліпшену селективність для мічених полігістидином білків. Згідно з приведеними прикладами, розкриті композиції з'єднують з нерозчинним носієм, таким як СЕФАРОЗА™. Посилання на дані Lizano et al., J. Microbiol. Methods, 23:261-280 по використанню матриці для іммобілізації рекомбінантного білка включене в даний винахід. Композиції за даним винаходом також можуть доставлятися у вигляді набору. Відповідно, в інших аспектах даний винахід належить до набору для отримання плазміну. Набір містить стрептокіназу, іммобілізовану на матриці, і ця стрептокіназа є мутантною стрептокіназою, яка відрізняється здатністю до активації плазміногена в плазмін, при цьому зберігає стійкість до розщеплення плазміном відносно відповідної їй стрептокіназі дикого типу. Опис стрептокінази приведений вище. У одному варіанті здійснення набір додатково містить плазмінзв'язувальну матрицю з розташованою на ній молекулою, що має афінність до плазміну. Набори можуть містити різні компоненти в окремих контейнерах. Наприклад, контейнери можуть окремо містити стрептокіназу, матрицю і т. д. таким чином, що при об'єднанні з іншими компонентами набору створюються композиції і способи отримання плазміну. Упаковані композиції і набори даного винаходу також можуть включати в себе інструкції для зберігання, виготовлення і тому подібне. Даний винахід буде більш детально описаний за допомогою прикладів, при цьому необхідно зазначити, що приклади не обмежують об'єм винаходу. ПРИКЛАДИ Приклад 1 Отримання міченої рекомбінантної стрептокінази Синтезували молекулу ДНК, показану в фігурі 1 (а саме, SEQ ID NO:3), яка містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує білок стрептокінази з подвійною мутацією (Blue Heron Biotech, Bothell, WA) і клонували (для полегшення клонування вставляли ділянки 5' BamHI і 3' Xhol) в комерційно доступні вектори pET21b, pET32b і pET41b (EMD Chemicals, Inc (Novagen®), Gibbstown, NJ) для отримання декількох рекомбінантних поліпептидів (фіг. 2-4, відповідно), що містять амінокислотні послідовності, які відповідають плазмін-резистентній стрептокіназі, які приєднуються на С- і/або N-кінці з різними мітками, що включають в себе полігістидин, тіоредоксин і GST. Вказані мітки сприяють афінному очищенню трьох молекул рекомбінантної стрептокінази з використанням відповідних наборів смол і буферів згідно з протоколами виготівника і згідно з описом в керівництві Novagen® pET System Manual, 11-ий випуск, який включений у винахід з його вказівками по направленому генному клонуванню, експресії і афінному очищенню білків-мішеней. Всі три конструкції ДНК рекомбінантних стрептокіназ були трансформовані в Е. coli компетентні клітини BL21 (DE3) Gold (Stratagene, La Jolla, CA) і вирощені з використанням середовища Лурія-Бертані (LB). Звичайно протягом ночі при 37ºC вирощували близько 0,5 мл культури і використали для інокуляції приблизно 200 мл свіжого середовища LB. Для конструкцій pET21b і pET32b до середовища LB додавали 50 мкг/мл ампіциліну, тоді як конструкцію pET41b вирощували в присутності 30 мкг/мл канаміцину. Кожну культуру вирощували до значення OD595нм приблизно 0,7 і потім індукували доданням 1,0 мМ ізопропіл β-D-1-тіогалактопіранозиду (IPTG). Через чотири часи вирощування при 37ºC з культур шляхом центрифугування збирали клітини і заморожували їх до -20ºC до використання. Початкові етапи очищення рекомбінантної стрептокінази для всіх трьох конструкцій були схожими і включали в себе лізис клітини і освітлення. Відталу клітинну масу ресуспендували в 20 мл реагенту для екстракції бактерійного білка (BPER) (Pierce, Rockford, IL), і потім культивували при кімнатній температурі протягом 10 хвилин. Лізовані культури освітлювались центрифугуванням протягом 20 хвилин при 15 К (ротор Sorvall SS34 в центрифузі RC5C) і фільтрувалися через фільтр 0,22 мкм. 9 UA 103771 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Використовували кобальтову заряджену хелатуючу колонку 5 мл HiTrap Chelating HP (GE Healthcare Bio-Sciences Corp, Piscataway, NJ) для очищення рекомбінантної стрептокінази від культур, отриманих від pET21b і pET32b (варіанти, мічені полігістидином). Освітлений клітинний лізат вносили в заряджену HiTrap Chelating кобальтову колонку зі швидкістю 5 мл/хвилину після урівноваження 20 мМ фосфатом натрію, 500 мМ NaCl і 10 мМ імідазолу, з рівнем pH 7,4. Після завантаження колонку інтенсивно промивали вищезазначеним буфером. Елюювання білка починали з введення 20 мМ фосфату натрію, 500 мМ NaCl і 500 мМ імідазолу з рівнем pH елююючого буфера 7,4. Для контролю проведення очищення застосовували вимірювання спектральної поглинальної здатності при довжині хвилі 280 нм, з використанням хроматографічного інструмента GE Healthcare AKTA Explorer. У процесі елюювання об'єднували фракції, що містять білок-мішень рекомбінантної стрептокінази, що визначали електрофорезом SDS-PAGE, і замінювали буфер для додаткового очищення за допомогою аніонобмінної хроматографії. Для додаткового очищення елюйованої фракції, отриманої з іммобілізованої кобальтової колонки використовували Q-сефарозну колонку 5 мл HiTrap (GE Healthcare Bio-Sciences Corp, Piscataway, NJ) з врівноваженням 25 мМ Тріс-HCl, і 1 мМ ЕДТА, рівень pH 8,0. Після діалізу протягом ночі проти Q-сефарозного рівноважного буфера об'єднані фракції вносили в Qсефарозну колонку зі швидкістю 5 мл/хвилину. Після завантаження колонку інтенсивно промивали рівноважним буфером. Білок елюювали з Q-сефарозної колонки шляхом застосування елююючого буфера NaCl (25 мМ Тріс-HCl, 1,0 мМ NaCl і 1 мМ ЕДТА, рівень pH 8,0). Для елюювання білки-мішені використовували градієнт елююючого буфера 0-100 %, який створювали протягом 20 хвилин. Злитий білок pET41 GST очищали з освітленого клітинного лізату, використовуючи колонку 5 мл GSTrap FF (GE Healthcare Bio-Sciences Corp, Piscataway, NJ). Освітлений клітинний лізат вносили в колонку з урівноваженням фосфатно-буферним розчином (ФБР). Після завантаження здійснювали рясне промиванням ФБР, і елюювали білок з 50 мМ Тріс-HCl і 10 мМ глутатіону, рівень pH 8,0. Ідентифікацію всіх трьох очищених білків підтверджували за допомогою SDSPAGE, анти-стрептокіназного вестерн-блотингу і аналізів активації. Фіг. 5 показує приклад очищеної рекомбінантної стрептокінази з фарбуванням Кумасі синім з гелем SDS-PAGE, а також очищеного рекомбінантного плазміногена. Приклад 2 Отримання іммобілізованої міченої полігістидином плазмін-резистентної мутантної стрептокінази Мічену гістидином (стійку до плазміну) стрептокіназу (100 мкг) в 10 мМ Тріс-HCl (рівень pH 8,0) і 100 мМ NaCl додавали до 100 мкл метало-хелатуючої матриці афінності IMAC. Після інкубації при 22ºC протягом 5 хвилин кашку переносили в мікроцентрифугальну колонку Spin-X (Costar, Cambridge, MA), забезпечену целюлозно-ацетатним фільтром 0,45 мкм. Матрицю пелетували центрифугуванням при 2,000 x g протягом 3 хвилин і потім декілька разів промивали 20 мМ Тріс-HCl з рівнем pH 7,4. Матрицю видаляли з пристрою Spin-X, вміщували в мікроцентрифугальну пробірку і ресуспендували в 200 мл 50 мМ буфера Тріс-HCl з рівнем pH 7,4. Приклад 3 Отримання плазміногена Отриманий з плазми плазміноген можна отримувати, наприклад, згідно з описом патентів США № 6964764 і 6969515, які включені в даний винахід за допомогою посилання у всій повноті. Наприклад, плазміноген очищали з пасти Cohn Fraction II+III афінною хроматографією на Lysсефарозі, як описано авторами Deutsch et al., Science, 170:1095 (1970). А саме, 200 г пасти ресуспендували в 2 літрах 0,15 M буфера цитрату натрію з рівнем pH 7,8. Суспензію інкубували протягом ночі при 37ºC, центрифугували при 14000 обертах за хвилину, фільтрували через скловолокно і змішували з 500 мл Lys-сефарози 4B (Pharmacia). Зв'язування плазміногена відбувалося при кімнатній температурі протягом 2 годин. Потім Lys-сефарозу переносили на скляний фільтр об'ємом 2 літри і декілька разів промивали 0,15 M цитрату натрію, що містить 0,3 M NaCl, поки спектральна поглинальна здатність при 280 нм не зменшувалася нижче 0,05. Зв'язаний плазміноген елюювали трьома порціями по 200 мл 0,2 M ε-амінокапронової кислоти. Елюйований плазміноген осаджували 0,4 г твердого сульфату амонію на мл розчину плазміногена. Осад з неочищеного плазміногена (з чистотою 80-85 %) можна зберігати при 4ºC. Приклад 4 Активація плазміногена в плазмін з використанням іммобілізованої міченої полігістидином плазмін-резистентної мутантної стрептокінази 10 UA 103771 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Еквімолярну кількість плазміногена додавали до іммобілізованої стрептокінази в 50 мМ буфера Тріс-HCl з рівнем pH 7,4. Зразки культивували при 22ºC і вміщували на обертову платформу, для підтримки матриці у вигляді суспензії. Після завершення активації розчин плазміну фільтрували від стрептокінази-СЕФАРОЗИ на скляному фільтрі і негайно переносили на бензамідин-СЕФАРОЗУ. Для контролю процесу активації плазміногена з різними інтервалами збирали зразки, і завершували реакцію доданням 0,1 об'єму 10X зупиняючого буфера (1,0 М NaHCO 3, 1,0 М εамінокапронової кислоти [рівень pH 9,4]). Зразок переносили в мікроцентрифугальну пробірку Spin-X і пелетували центрифугуванням при 2,000 x g протягом 3 хвилин. Іммобілізовані реагенти елюювали додаванням 25 мл 100 мМ ЕДТА, з подальшим центрифугуванням при 5,000 x g протягом 10 хв. Зразки готували для аналізу SDS-PAGE додаванням 25 мл SDS буфера 23, що містить β-меркаптоетанол, кип'ятили протягом 5 хвилин і переносили в SDS10 % поліакриламідний гель. Приклад 5 Активація рекомбінантного плазміногена міченою плазмін-резистентною стрептокіназою в розчині Очищену рекомбінантну стрептокіназу, отриману з експресією конструкції pET21b, піддавали діалізу проти 25 мм Тріс-HCl, рівень pH 7,0, 100 мМ ε-амінокапронової кислоти, 1 мМ ЕДТА і 25 % гліцерину (об'єм:об'єм). Афінно-очищений рекомбінантний плазміноген змішували в тому ж буфері з рекомбінантною стрептокіназою в молярних співвідношеннях 100:1, 10:1 і 1:1. Кількість стрептокінази в кожній з цих трьох реакцій вважалася сталою, тоді як кількість рекомбінантного плазміногена варіювали, щоб отримати різні молярні відношення рекомбінантного плазміногена до стрептокінази. Ці два компоненти змішували і культивували при кімнатній температурі протягом 18 годин. У точки часу 0, 1, 2, 3, 4 і 18 годин в реакцію активації переносили аліквотну кількість суміші і готували її для електрофорезу SDS-PAGE. Зразки SDS-PAGE обробляли згідно з протоколом підготовки зразків NuPAGE Novex BisTris (Invitrogen, Carlsbad, CA) із застосуванням відновлювальних умов. Для експериментів SDS-PAGE використовували 4-12 % гелі BisTris в буфері MOPS. Як показано в фіг. 6 для молярного співвідношення 100:1 рекомбінантного плазміногена до рекомбінантної стрептокінази, SDS-PAGE виявив очевидну активацію рекомбінантного плазміногена в рекомбінантний плазмін за допомогою рекомбінантної стрептокінази. Динаміка активації виявила перетворення рекомбінантного плазміногена в рекомбінантний плазмін на початку реакції, що підтверджує утворення двох смуг при відновлювальних умовах PAGE. Смуга, що спостерігається, мігруюча біля маркера 28 кД, являє собою ділянку протеази серину рекомбінантного плазміногена, тоді як менша смуга, мігруюча безпосередньо вище маркера 14 кД, є крингл-доменом. Появу цих двох смуг супроводжує зникнення вихідного матеріалу рекомбінантного плазміногена в 39 кД. У точці часу реакції t=18 годин майже весь рекомбінантний плазміноген був перетворений в рекомбінантний плазмін. Для молярного співвідношення реакції 10:1 застосування SDS-PAGE було можливе тільки для відстеження експерименту, тоді як загальна кількість білка, присутнього в експерименті при молярному співвідношенні 1:1 була дуже малою для контролю SDS-PAGE (дані не показані). По даних SDS-PAGE гелю, показаних в фіг. 6, очевидно, що очищена рекомбінантна стрептокіназа (конструкція pET 21b) має здатність перетворювати рекомбінантний плазміноген в рекомбінантний плазмін. Для контролю шляху рекомбінантної стрептокінази в реакціях активації було необхідно стежити за ходом реакції за допомогою вестерн-блотингу. У всіх трьох випадках реакцій спостерігали динаміку гелів SDS-PAGE, як указано вище, і потім переносили їх на мембрани PVDF відповідно до протоколу модуля фарбування Novex X Cell II (Invitrogen, Carlsbad, CA). Блокування мембрани PVDF здійснювали 1 % розчином бичачого сироваткового альбуміну (БСА) в фосфатно-буферному розчині (Sigma-P3688, St-Louis, MO), при цьому для всіх розчинів для промивання і розведення антитіл застосовували Тріс-буферний розчин (Sigma-T9039, StLouis, MO). Після електрофоретичного перенесення і блокування мембрани PVDF досліджували пляму з поліклональним кролячим анти-стрептокіназним антитілом (AbD Serotec (0100-0173), Raleigh, NC) з використанням стокового 1º антитіла в розведенні 1:4000. Для візуалізації фрагментів стрептокінази використовували козячі антикролячі IgG антитіла (Sigma-A3937, StLouis, MO), мічені лужною фосфатазою, в розведенні 1:5000, в поєднанні з субстратом Sigma Fast BCIP/NBT (Sigma-B5655, St-Louis, MO). Як показано в фіг. 7, в умовах реакції при культивуванні рекомбінантного плазміногена з рекомбінантною стрептокіназою (молярне співвідношення 100:1), молекули стрептокінази піддавались протеолізу до деяких видів часозалежним чином. Початкове протеолітичне 11 UA 103771 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 відсікання видаляло невелику частину поліпептидного скелета, що підтверджувалося вестернблотингом по утворенню смуги нижче маркера 51 кД. З плином часу реакції цей фрагмент додатково розщеплювався і проходив через деякі транзиторні види, до утворення стійкого виду, який переміщався вище маркерів ММ 39 і 51 кД. Початкова поява нечіткої смуги в тій же локалізації на плямі була зумовлена крос-реактивністю 1º антитіла до повнорозмірного рекомбінантного плазміногена. Обидва з контрольного рекомбінантного плазміногена (смуга 7) і зразка реакції в точці часу t=0 (смуга 1) продемонстрували таку крос-реактивність. При більш тривалому часі реакції з поглинанням рекомбінантного плазміногена відбувалося зменшення нечіткої смуги, і з'являлася нова виразна смуга, що відображає серцевинний фрагмент стрептокінази. Крос-реактивність також була очевидною з доменом рекомбінантного плазміну протеази серину (SP) (дані не показані). У експерименті з молярним співвідношенням 1:1 швидкість активації була значно знижена (дані не показані). Перші ознаки протеолізу стрептокінази були помітними в точці часу реакції t=4 години. У цих умовах реакції створювався дуже стійкий стрептокіназний фрагмент, навіть на момент реакції t=18 годин. Ймовірно, це було результатом зв'язування всієї присутньої стрептокінази в комплексі з рекомбінантним плазміном, при дуже невеликій кількості вільного рекомбінантного плазміну, доступного для розщеплення молекул рекомбінантної стрептокінази. Результати показують, що на початку реакції активації рекомбінантна стрептокіназа руйнується на ряд транзиторних видів, але пізніше з плином часу утворює стабільний поліпептид з ММ помітно вище 39 кД. Приклад 6 Захоплення плазміну на бензамідин-СЕФАРОЗУ Афінна хроматографія являє собою корисну технологію очищення білка. Оскільки білок, що розглядається, є активною протеазою серину (тобто, плазміном) з трипсиноподібною специфічністю, як афінний сорбент була вибрана бензамідин-СЕФАРОЗА, яка буде допускати захоплення тільки активного плазміну і ігнорувати різні домішки і продукти розщеплення плазміногена. Захоплення плазміну, елюювання і створення рецептури описані, наприклад, в патенті США № 6355243, який повністю включений у винахід за допомогою посилання. Повністю активований розчин плазміногена в 50 % гліцерині вносили в колонку 50 мл з бензамідин-СЕФАРОЗОЮ, врівноважували 0,05 М Тріс з рівнем pH 8,0, 0,5 М NaCl при швидкості потоку 3 мл/хвилину. Підтримували колонку при 3 мл/хвилину при 4ºC. Приклад 7 Елюювання зв'язаного плазміну з буфером з низьким рівнем pH Для запобігання плазміну від інактивації при нейтральному рівні pH вибирали кислі умови елюювання. Плазмін, пов'язаний з бензамідин-СЕФАРОЗОЮ, елюювали 0,2 М гліциновим буфером, рівень pH 3,0, що містить 0,5 М NaCl. Пік зв'язування звичайно ділиться на три пули: дві невеликих передніх частини піка, В1 і B2, і основна частина елюйованого матеріалу, B3. Приклад 8 Отримання елюйованого матеріалу в окисленій воді Елюйований плазмін піддавали діалізу водою, яка була окислена, наприклад, до рівня pH від близько 3,3 до близько 3,7 крижаною оцтовою кислотою. Спочатку, такі умови розчинення були вибрані просто для збереження активного плазміну в ході його отримання для майбутніх процедур отримання препарату, таких як ліофілізація, заморожування, зміна умов розчинення і так далі. Всі ці перераховані процедури легше здійснювати з небуферним розчином з низькою іонною силою. Разом з тим, автори даного винаходу виявили, що плазмін надзвичайно стійкий в окисленій воді і може ефективно застосовуватися в цій формі в дослідженнях in vitro і in vivo. 12 UA 103771 C2 13 UA 103771 C2 14 UA 103771 C2 15 UA 103771 C2 16 UA 103771 C2 17 UA 103771 C2 18 UA 103771 C2 19 UA 103771 C2 20 UA 103771 C2 21 UA 103771 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 1. Стрептокіназа, іммобілізована на матриці, яка активує плазміноген в плазмін, при цьому залишаючись стійкою до розщеплення плазміном в порівнянні з відповідною їй стрептокіназою дикого типу, яка містить амінокислотну послідовність, що має аспарагін в положеннях, які відповідають положенням 85 і 412 в SEQ ID NО:1. 2. Матриця, яка має іммобілізовану на ній стрептокіназу, для активації плазміногена в плазмін, в якій вказана стрептокіназа, що є стійкою до розщеплення плазміном в порівнянні з відповідною їй стрептокіназою дикого типу, містить амінокислотну послідовність, що має аспарагін в положеннях, які відповідають положенням 85 і 412 в SEQ ID NО:1. 3. Спосіб отримання плазміну, який включає: a) контактування стрептокінази, іммобілізованої на матриці, вказаній у п. 1, або матриці, яка має іммобілізовану на ній стрептокіназу, вказану у п. 2, з плазміногеном, таким чином перетворюючи плазміноген в плазмін; і 22 UA 103771 C2 5 10 15 b) очищення плазміну. 4. Спосіб за п. 3, в якому стрептокіназа містить амінокислотну послідовність, представлену амінокислотними залишками 27-440 послідовності SEQ ID NО:1, що має аспарагін в положеннях 85 і 412. 5. Спосіб за п. 3, в якому очищення включає контактування плазміну, одержаного на етапі а), з плазмінзв'язувальною матрицею таким чином, що плазмін утримується плазмінзв'язувальною матрицею, при цьому на плазмінзв'язувальній матриці розташована молекула, яка має афінність доплазміну. 6. Спосіб за п. 3, в якому стрептокіназа, необов'язково, додатково містить полярні або заряджені залишки в одному або декількох положеннях, які відповідають положенням 406-410 в SEQ ID NО:1. 7. Набір для отримання плазміну, який містить: а) стрептокіназу, іммобілізовану на матриці, вказану у п. 1, і b) плазмінзв'язувальну матрицю з розташованою на ній молекулою, що має афінність до плазміну. 23 UA 103771 C2 24 UA 103771 C2 25 UA 103771 C2 26 UA 103771 C2 27 UA 103771 C2 Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 28