Спосіб очистки білкових розчинів від домішки плазміногена, плазміну, тканинного активатора плазміногена та асоційованої з ними патогенної форми пріонового білка

Спосіб очистки білкових розчинів від домішки плазміногена, плазміну, тканинного активатора плазміногена та асоційованої з ними патогенної форми прюнового білку, який відрізняється тим, що афінне зв'язування зазначених білків відбувається за рахунок взаємодії їх арпніл-зв'язуючих ділянок з іммобілізованим на нерозчинному носи со-гуанідильним похідним а,со-аліфатичного діаміну з довжиною ЛІНІЙНОГО вуглеводневого ланцюга 612 метиленових ланок ношенню до можливої домішки прюнової інфекції Необхідною умовою подібної очистки є збереження здатності ЛЗД до комплексоутворення з патогенною формою прюнового білку Ця умова може бути виконана за рахунок утилізації асоціативних властивостей так званих бензамідин- чи арпніл-зв'язуючих ділянок, що також знаходяться у молекулах зазначеної групи білків [7] Як прототип вибрано очистки плазми крові від ЛЗД-вмісних білків афінною сорбцією на лізин агарозному сорбенті [8] Висока спорідненість лізинзв'язуючих ділянок до іммобілізованого на нерозчинному носи ЛІЗИНІ дозволяє досягти повного вилучення ЛЗД-вмістних білків з білкової суміші Принциповий недолік способу-прототипу полягає у включенні ЛЗД у взаємодію з афінним сорбентом, чим порушується зв'язування прюнового білку з ЛЗД-вмісним білком-екстрагентом Аналогом запропонованого способу є афіннохроматографічний метод зв'язування плазміногена та його фрагментів з пара-амшо-бензамідином, іммобілізованим через спейсер до нерозчинного агарозного носія [9] На відміну від способу-прототипу афінна сорбція відбувається за рахунок арпніл-зв'язуючих ділянок, при чому лізин-зв'язуючі ділянки зберігають свою здатність до комплексоутворення з патогенною формою прюнового білка Недолік аналогу полягає у складності отримання пара-амінобензамідин-вміщуючого афінного сорбенту, що полягає у активації агарози ю 00 47859 бромціаном, іммобілізації на ній 3,3'діамшопропану, сукцинілюванні вільних аміногруп, активації карбоксильних груп 1-етил-З(диметиламшопропіл)-карбодммідом та ковалентне зв'язування ними пара-амшо-бензамідину [9] Складність зазначених операцій, як і висока вартість самого пара-аміно-бензамідину, ускладнюють отримання бензамідин-вміщуючих сорбентів Зазначені недоліки подолані у способі, що заявляється, завдяки застосуванню сорбентів з лігандами - аналогами артільних залишків на основі іммобілізованих на бромціан-активованій агарозі та підданих гуанідованню ЛІНІЙНИХ аліфатичних а,ш-діамшів з 6 - 12 метиленовими ланками Переваги способу, що заявляється, перед способомпрототипом полягає у афінній сорбції ЛЗД-вмістних білків за допомогою арпніл-зв'язуючих ділянок, при чому ЛЗД лишаються вільними та забезпечують зв'язування можливої домішки патогенної форми прюнового білка Заявлений спосіб вигідно відрізняється від способу-аналогу спрощенням отримання афінного сорбенту та зменшенням його собівартості за тієї ж самої зв'язуючої ефективності дів Спосіб виконується згідно наведених прикла Приклад 1 Отримання гуанідинооктил-вміщуючого сорбенту Гуанідування комерційних препаратів ш-амшовміщуючих похідних агарози проводили за допомогою сульфату метилізосечовини [10] До охолодженої до 4°С суспензії 15мл гелю в 50мл насиченого розчину ЫагСОз при перемішуванні додавали 2,5г сульфату метилізосечовини Отриману суспензію перемішували протягом ночі при 4°С, після чого гель послідовно відмивали 0,1 М розчином Na2CO3, 0,1 М розчином NaHCO3, 0,5М розчином NaCI та 0.05М натрій-фосфатним буфером, рН 7,4 Зберігали у тому ж буфері Приклад 2 Афінно-хроматографічне зв'язування плазміногену гуанідино-октил-агарозою Дослідження отриманого гелю щодо здатності афінно сорбувати плазміноген проводили колонковою хроматографію аналогічно [11] На відміну від вихідної ш-амшооктил-агарози, ефективна сорбція плазміногену не руйнувалася ні 0,5М розчином NaCI у 0.05М натрій-фосфатному буфері, рН 7,4, ні 0,2М розчином 6-амшогексановоі кислоти Наявність цих розчинів не впливало на здатність сорбенту до зв'язування плазміногену Натомість, 0,1 М розчин аргініну у 0.05М натрій-фосфатному буфері, рН 7,4, призводив до повної десорбції зв'язаного плазміногену та запобігав його сорбції Наведений приклад свідчить про зв'язування плазміногену з ш-гуанідинооктил-вміщуючим сорбентом за допомогою ВІДМІННИХ ВІД ЛЗД арпніл-зв'язуючих ділянок Приклад 3 Порівняння сорбційної здатності шгуанідинооктил-агарози з сорбційними властивостями пара-амінобензамідин-агарози ("Sigma", США) Порівняння сорбційної здатності ш-гуанідинооктил- та пара-амшо-бензамідин-вміщуючих сорбентів проводили за допомогою J 1 2 5 - мічених препаратів плазміногену за утриманням мітки на афінній колонці [12] за допомогою радіометру Beckmann Gamma 5500 (США) Йодований до 4 5МБк на мг білку плазміноген додавали до неміченого у розрахованих кількостях Встановлено, що обох випадках специфічна сорбція є приблизно рівною та сягає 12 - 17 мг білка на мл гелю Сорбенти однаково ефективно утримують плазміноген-зв'язану радіоактивну мітку та є нечутливими до десорбційної дії 0,5М розчину NaCI у 0.05М натрій-фосфатному буфері, рН 7,4 та 0,2М розчину 6-амшогексановоі кислоти Натомість, 0,1 М розчин аргініну у 0.05М натрій-фосфатному буфері, рН 7,4, призводив до повної десорбції плазміногензв'язаної мітки Приклад 4 Десорбція прюнового білка з розчину овальбуміну за допомогою афінного зв'язування плазміногену на ш-гуанідинооктил-агарозі Штучну контамінацію патогенною формою прюнового білка розчину ЮОмг овальбуміну ("Sigma", США) у 50мл 0.05М натрій-фосфатному буфері, рН 7,4, проводили додаванням 15 - 20мг гомогенату головного мозку бика з вираженою формою спонпформної енцефалопатм (BioRad Life Science Labs, США) До отриманого розчину додавали 5мг плазміногена людини та за повільного перемішування проводили інкубацію протягом години при 12°С Отриманий білковий розчин піддавали мікрофільтрацм для відокремлення нерозчинних часток та пропускали через афінну колонку з 8мл шгуанідинооктил-агарози, отриманої згідно Прикладу 1 Визначення прюнового титру білкового розчину до та після проходження через афінну колонку проводили іммуноферментним методом з застосуванням набору BioRad, США [13] Згідно отриманих даних, зазначена процедура призводила до зменшення прюнового титру з величин порядку ЗО - 50 LDso до рівня, що знаходився нижче нижньої межі чутливості методу, тобто щонайменше в 4000 разів Наведені приклади свідчать, що запропонований спосіб забезпечує ефективне зв'язування плазміногена поза ЛЗД, що лишаються вільними для зв'язування можливої домішки патогенної форми прюнового білка СПИСОК ПОСИЛАНЬ 1 Okamoto S , Oshiba S , Mihara H , Okaraoto W Synthetic inhibitors of fibrmolysis in vitro and in vivo mode of action // Ann NY Acad Sci - 1968 146.N3-P414-429 2 Wmn E , Hu S , Hochschwender S , Laursen R Studies on the lysme-binding sites of human plasmmogen the effect of hgand structure on the binding of lysme analogs to plasmmogen // Eur J Biochem 1980 -104, N 4 -P 579-586 3 Wman В , Wallen P The specific interaction of plasmmogen and fibrin A physiological role of the lysme-binding sites in human plasmmogen // Thromb Res -1977 -10, N 2 - P 213 - 222 4 Deutsch D , Mertz E Plasmmogen purification from human plasma by affinity chromatography // Science -1970 -N3962 -P 1095-1096 5 Fischer M , Roecki С , Panzek P Et al Binding of disease-associated prion protein to plasmmogen // Nature -23 November 2000 -408 - P 479 - 483 6 Chesebro В BSE and pnons Uncertainties about the agent//Science - 2 January 1998 -279 P 42 - 43 47859 7 Verevka S , Kudmov S , Grmenko T Arginylbmdmg sites of human plasmmogen // Thromb Res 1986 -41, N5 -P 689-698 8 Wiman В Affinity chromatographic purification of human a2-antiplasmm // Biochem Journ - 1980 191, N 1 -P 229-232 9 Holleman W , Anders W , Weiss L The relationship between the lysine and p-ammobenzamidme binding sites of human plasmmogen // Thromb Res 1975 -7 N 5 - 6 8 3 - 6 9 3 10 Roche J , Morque M , Baret R Sur la guamdation des proteins // Bull Soc Chem Biol - 1954 36, N 1 - P 85 - 94 11 Веревка С В Изучение лигандной специфичности лизин- и аргинил-связывающих участков плазминогена человека // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук -Киев -1988 12 Me Conahey Р , Dixon F Radioiodivation of protein by the use chloramme T method // Meth Enzymol -1980 -70 -P 210-213 13 Moynagh J , Schimmel H Tests for evaluated//Nature -8 July 1999 -400 -P 105 -111 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71