Генетичні маркери, пов`язані із системою 2 стійкості до orobanche у соняшника
Номер патенту: 104711
Опубліковано: 11.03.2014
Автори: Хоефт Ерік, Лі Зенглу, Ель Саед Садік, Тулсієрам Ломас
Формула / Реферат
1. Спосіб ідентифікації рослини соняшника або зародкової плазми соняшника, що має фенотип системи II стійкості до Orobanche, що включає виявлення в рослині соняшника або зародковій плазмі соняшника щонайменше одного поліморфізму маркерного локусу, що асоційований із зазначеним фенотипом, де маркерний локус представлений послідовністю SEQ ID NO:2, або має частоту рекомбінації менш ніж 10 % щодо маркерного локусу SEQ ID NO:2.
2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що виявлення включає ампліфікацію маркерного локусу або частини маркерного локусу й детекцію отриманого ампліфікованого амплікона маркера.
3. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що ампліфікація включає:
a) змішування праймерів для ампліфікації або пари праймерів для ампліфікації з нуклеїновою кислотою, ізольованою від рослини соняшника або зародкової плазми, причому праймер або пари праймерів є комплементарною або частково комплементарною до щонайменше частини маркерного локусу, і здатні до ініціації полімеризації ДНК за допомогою ДНК-полімерази, використовуючи нуклеїнову кислоту соняшника як матрицю; і
b) подовження праймера або пари праймерів у реакції полімеризації ДНК, що містить ДНК-полімеразу й матричну нуклеїнову кислоту, для одержання щонайменше одного амплікона.
4. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що праймер або пари праймерів вибрані із групи, що складає з SEQ ID NO:3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 і 10.
5. Рослина або зародкова плазма, ідентифіковані способом за п. 1, яка відрізняється тим, що вказана рослина соняшника або зародкова плазма соняшника мають фенотип системи II стійкості до Orobanche і включають в своєму геномі щонайменше один поліморфізм маркерного локусу, що асоційований із зазначеним фенотипом, де маркерний локус представлений послідовністю SEQ ID NO:2, або має частоту рекомбінації менш ніж 10 щодо маркерного локусу SEQ ID NO:2.
6. Спосіб селекції, який відрізняється тим, що включає схрещування рослини соняшника або зародкової плазми за п. 5 із другою рослиною соняшника або зародковою плазмою, який включає:
(а) одну або кілька стадій зворотного схрещування, самозапилення, випадкового схрещування і селекції рослин; і
(b) стадію аналізу молекулярних маркерів для зразків ДНК, виділених від одної або більше рослин, отриманих при здійсненні даного способу, причому зазначений аналіз ідентифікує рослину, що містить щонайменше один поліморфізм SEQ ID NO:2, асоційований зі стійкістю до Orobanche.
7. Спосіб за п. 6, який відрізняється тим, що зазначена ідентифікована рослина проявляє підвищену стійкість до Orobanche у порівнянні із другою рослиною соняшника або зародковою плазмою.
8. Спосіб за п. 7, який відрізняється тим, що рослина, отримана за ним, має фенотип системи II стійкості до Orobanche і включає в своєму геномі щонайменше один поліморфізм маркерного локусу, що асоційований із зазначеним фенотипом, де маркерний локус представлений послідовністю SEQ ID NO:2, або має частоту рекомбінації менш ніж 10 щодо маркерного локусу SEQ ID NO:2.
9. Рослина, що отримується способом, який включає:
(і) ідентифікацію способом за п. 1 формули першої рослини соняшника або зародкової плазми соняшника, що мають фенотип системи II стійкості до Orobanche і включають маркерний локус, як визначено в п. 1 формули; і
(іі) схрещування ідентифікованої рослини соняшника або зародкової плазми соняшника з другою рослиною соняшника або зародковою плазмою, що виявляє меншу стійкість до Orobanche,аніж рослина за (і);
і необов’язково додатково включає
(ііі) одну або кілька стадій зворотного схрещування, самозапилення, випадкового схрещування, і селекції рослин, і необов’язково додатково стадію аналізу молекулярних маркерів зразків ДНК, виділених від одної або більше рослин, отриманих при здійсненні даного способу, причому зазначений аналіз ідентифікує рослину, що містить щонайменше один поліморфізм SEQ ID NO:2, асоційований зі стійкістю до Orobanche;
де вказана рослина виявляє підвищену стійкість до Orobanche у порівнянні із другою рослиною соняшника або зародковою плазмою, визначеною в частині (іі) та включає маркерний локус, визначений в п. формули.
10. Рослина за п. 8 або 9, яка відрізняється тим, що додатково містить систему I стійкості до Orobanche.
11. Рослина за п. 8 або 9, яка відрізняється тим, що додатково містить щонайменше один ген, уведений за допомогою інтрогресії або трансформації.
12. Рослина за п. 11, яка відрізняється тим, що зазначений уведений ген забезпечує стійкість до комах, толерантність до гербіцидів, стійкість до хвороби або толерантність до абіотичного стресу.
13. Спосіб ідентифікації нуклеїнової кислоти як індикатор системи 2 стійкості до Orobanche у соняшнику що включає взаємодію нуклеїнової кислоти соняшника з молекулярним маркером, вибраним із групи, що складається з SEQ ID NO:1 або 2.
14. Виділений і очищений генетичний маркер, пов'язаний із системою 2 стійкості до Orobanche і картирований до групи зчеплення 4 Helianthus annuus, де маркер містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:2, або варіант, що містить щонайменше один з поліморфізмів SEQ ID NO:2 відносно SEQ ID NO:1.
15. Застосування маркера за п. 14 для одержання додаткових маркерів стійкості до Orobanche.
16. Спосіб зниження існуючого насінного фонду Orobanche у ґрунтовому профілі, що включає вирощування рослини, що містить алель системи 2 стійкості SEQ ID NO:2, або похідний алель, що містить щонайменше один поліморфізм, ідентифікований у даному описі відносно SEQ ID NO:1.
17. Спосіб ідентифікації генів або кластерів генів у геномі соняшника, що забезпечують стійкість до Orobanche, що включає ампліфікацію хромосомної ділянки, ідентифікованої за допомогою гібридизації із праймером, вибраним із групи, що складається з SEQ ID NO:3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10.
18. Спосіб за п. 17, що додатково включає послідовні раунди скринінга й ізоляції клонів для складання контига, що містить відкриту рамку зчитування.
19. Спосіб по п. 17, який відрізняється тим, що включає застосування гена або кластерів генів для одержання трансгенних соняшників з поліпшеною стійкістю до Orobanche.
Текст
Реферат: UA 104711 C2 (12) UA 104711 C2 Винахід належить до способу ідентифікації рослини соняшника або зародкової плазми соняшника, що має фенотип системи II стійкості до Orobanche, що включає виявлення в рослині соняшника або зародковій плазмі соняшника щонайменше одного поліморфізму маркерного локусу, що асоційований із зазначеним фенотипом. Винахід належить також до виділеного і очищеного генетичного маркера, пов’язаного із системою II стійкості до Orobanche і, який є картованим до групи зчеплення 4 Helianthus annuus. Також винахід належить до способу селекції, рослин та зародкової плазми, отриманих за допомогою способу селекції. UA 104711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки Даний винахід відноситься до композицій і способів застосування молекулярно-генетичних маркерів для характеристики зародкової плазми соняшника на предмет стійкості до Orobanche cumana. Рівень техніки Культурний соняшник (Helianthus annuus L.) вирощується як усе більш та більш важлива олійна культура в багатьох помірних, напівпосушливих районах миру. Культурний соняшник є головним джерелом рослинного масла в усьому світі. Масляні сорти соняшника містять від 40 до 48 і більше відсотків масла в насінні. Соняшникова олія цінується як харчова олія через свій високий рівень ненасичених жирів і світлого кольору. Соняшникова олія використовується для салатів, кулінарного жиру або маргарину. Білковий зміст макухи соняшника, приготовленого з насіння після екстракції масла, може бути використаний як корм для домашньої худоби. Насіння як масляничних, так і кондитерських сортів культурного соняшника можуть бути використані як корм для птахів. Заразиха, рослина-паразит, (Orobanche Spp.) стала обмежуючим фактором для зернових культур соняшника в інвазованих країнах. На зараженому полі спад урожайності може досягати 95 %. Специфічні види Orobanche, що вражають соняшник, включають Orobanche aegyptiaca Pers., O. ramosa L., O. minor Sm., O. cumana Wallr. і O. cernua Loefl. Orobanche cumana Wallr. (також відомий як O. cernua Loefl) є серйозним сільськогосподарським шкідником соняшника в Східній Європі й поширився в південній Європі. За останні кілька років спостерігається просування цієї рослини-паразита, його поширення в нових країнах і розвиток нових і більш вірулентних штамів. Orobanche представляє міжнародний ризик, і деякі різновиди, як наприклад, O. minor, стали екзотичними в Сполучених Штатах. Починаючи з 1996 р., поява трьох нових штамів заразихи спостерігалася на полях у Туреччині, Іспанії й Болгарії. До 2000 р. число уражених полів у цих областях різко збільшилося. Деякі виробники припинили вирощування соняшника через істотне скорочення врожаю зерна. Ці бур'яни є облігатними голопаразитами кореневої системи. Різновиди Orobanche дуже важко усунути, оскільки за винятком квітки, вони живуть у ґрунті; їхні насіння мають маленькі за розміром, продукуються у великій кількості, легко поширюються й дуже довгоживучі. Таким чином, гербіциди, звичайно використовувані в цей час у випадку соняшника, надають неповний контроль. Засоби контролю над Orobanche включають засоби біологічної боротьби, визначення генів, відповідальних за стійкість до Orobanche у соняшника, і виведення стійких ліній соняшника. Було повідомлено, що Fusarium oxysporum f. Sp. orthoceras можуть бути потенційним засобом біологічного контролю Orobanche cumana (Thomas-Heiko, et al. (September 1998) Biological control. 13 (1): 41-48). Однак способи застосування й стандартні дози в польових умовах дотепер не були визначені. Ген Or3 забезпечує стійкість при зараженні Orobanche, але, як відомо, він ефективний тільки проти раси C. Щонайменше було повідомлено про шість генетичних варіантів Orobanche (PerezVich, et al., (2004) Theor. Appl. Gen. 109: 92-102; Antonova, T.S., et al., (1996) Weed Research 36 (2): 113-121). Ідентифікація й використання додаткових джерел стійкості до Orobanche сприятливі при здійсненні генетичних змін і скороченні втрат продуктивності. Короткий опис сутності винаходу Даний винахід відноситься до композицій і способів застосування генетичних маркерів для характеристики зародкової плазми соняшника відносно системи 2 стійкості до Orobanche cumana. Рослини й лінії, ідентифіковані як такі, що володіють високонаслідуваними ознаками стійкості до Orobanche, можуть бути корисні для одержання комерційних культурних сортів соняшника, що мають цінні агрономічні і/або насінневі якості. Короткий опис креслень: На фіг. 1 представлена часткова карта маркерів групи зчеплення 4 соняшників, включаючи положення передбачуваного гена системі 2 стійкості до заразихи(BRSII або BRII). На фіг. 2 представлені додаткові дані карти відносно гена BRSII, включаючи SNP маркер ознаки стійкості. На фіг. 3 представлене BestFit вирівнювання стійких й сприйнятливих алелей маркерів BRSII (SEQ ID NO: 2 і 1 відповідно). Поліморфізми відзначені зірочками. На фіг. 4 представлена таблиця, що представляє родовід і фенотипові дані потомства популяції, використаної при складанні генетичної карти. Короткий опис послідовностей SEQ ID NO: 1 представляє алель маркерного гена системи 2 сприйнятливості до Orobanche. 1 UA 104711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO: 2 представляє алель маркерного гена системи 2 стійкості до Orobanche. SEQ ID NO: 3 і 4 представляють зонди, використовувані для ідентифікації BRSIIСприйнятливих і BRSII-стійких алелей маркерного гена в положеннях 105-106 з SEQ ID NO: 1 і 2. SEQ ID NO: 5 і 6 представляють прямий і зворотний праймер, відповідно, для ампліфікації алелей маркерного гена в положеннях 105-106 з SEQ ID NO: 1 і 2. SEQ ID NO: 7 і 8 представляють зонди, які використовуються для ідентифікації BRSIIсприйнятливих і BRSII-стійких алелей маркерного гена в положенні 142 з SEQ ID NO: 1 і 2. SEQ ID NO: 9 і 10 представляють прямий і зворотний праймер, відповідно, для ампліфікації алелей маркерного гена в положенні 142 з SEQ ID NO: 1 і 2. Докладний опис винаходу Хоча певні послідовності ДНК, які кодують білки, звичайно високо консервативні між представниками виду, що не кодують області мають тенденцію накопичувати поліморфізми, і тому можуть бути різними в представників того самого виду. Такі області дають основи для численних молекулярно-генетичних маркерів. Звичайно будь-який диференційовано наслідуваний поліморфізм нуклеїнової кислоти, що піддається сегрегації в потомстві, є потенційним молекулярним маркером. Геномна мінливість може мати будь-яке походження, включаючи вставки, делеції дуплікації, повторення елементів, крапкові мутації, рекомбінаційні події, і присутність і послідовності мобільних елементів. Численні способи для виявлення молекулярних маркерів також є загальноприйнятими. Маркери, що відповідають генетичним поліморфізмам між членами однієї популяції, можуть бути виявлені шляхом численних методів, відомих у даній галузі техніки, таких як поліморфізм довжини фрагментів рестрикції, маркери-ізозими, алель-специфічна гібридизація (АСГ), ампліфіковані варіабельні послідовності генома рослини, самопідтримуюча реплікація послідовностей, прості повтори (SSR), однонуклеотидний поліморфізм (SNP), або поліморфізм довжини ампліфікованих фрагментів (ПДАФ). Маркерами за даним винаходом є SNP. Молекулярно-генетичні маркери можуть полегшити складання генетичної карти й селекцію важливих сільськогосподарських властивостей. Молекулярний маркер, що демонструє нерівноважне зчеплення з бажаною фенотиповою ознакою, може бути корисним інструментом для маркер-опосередкованої селекції (MAS), надаючи засіб для швидкого виявлення бажаних особин або ліній. Інтрогресія кращих генів у культурний сорт рослини також полегшується за допомогою MAS. Компоненти виконання MAS можуть включати: (i) створення точної генетичної карти молекулярних маркерів (ii) виявлення статистичних асоціацій між маркером і фенотиповою мінливістю, (iii) визначення ряду бажаних маркерних алелей, і (iv) екстраполяція цієї інформації до поточного набору зародкової плазми, яка розводиться, для здійснення можливості проведення маркер-опосередкованої селекцію. Як правило, ідентифікація маркерів для проведення MAS включає опис фенотипової(их) ознаки(к), що представляє(ють) інтерес, генотипізація сегрегуючої популяції потомства за поліморфними маркерами і складання генетичної карти бажаної ознаки. Подробиці складання генетичної карти описані в іншому розділі даної заявки. Поліморфні локуси поблизу картированної ознаки вибирають як потенційні маркери (як правило, маркерний локус, найближчий до локусу, що представляє інтерес є кращим маркером). Потім для визначення послідовності поліморфного маркерного алеля, що демонструє статистичну перевагу в косегрегації з бажаним фенотипом (відповідно, "маркерний алель"), проводять аналіз зчеплення. Далі можливо використовувати цей маркер для швидкого, точного скринінга ліній рослини на предмет маркерного алеля без необхідності вирощувати рослини через їхній життєвий цикл і очікувати фенотипових оцінок. Крім того, даний метод допомагає проводити генетичну селекцію на основі конкретного алеля, навіть коли молекулярна природа QTL фактичної толерантності невідома. Зразки тканини можуть бути взяті, наприклад, від першого листа рослини й можуть бути проскриновані на предмет відповідного молекулярного маркера, і протягом днів визначиться, яке потомство буде використано далі. Застосування зчеплених маркерів також видаляє внесок факторів зовнішнього середовища, які можуть впливати на прояв фенотипу, і, на відміну від польових оцінок, аналіз на основі маркерів може бути проведений у будь-який час року. Для одержання поліпшених сортів рослин селекціонери займаються пошуком комбінацій локусів з генами, що визначають високу врожайність і інші бажані властивості. Проводячи скринінг більшої кількості зразків за допомогою немолекулярних методів (наприклад, оцінка ознаки в рослин соняшника) можуть бути дорогими, потребувати багато часу і бути ненадійними. Застосування поліморфних маркерів, описаних у даній заявці, надає ефективний 2 UA 104711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 спосіб селекції стійких сортів у програмах селекції. Якщо популяція розщеплюється по багатьом локусам, що кодують один або кілька ознак, наприклад, кілька локусів, що визначають стійкість, або множинні локуси, де кожний задіяний у толерантності або стійкості до різних захворювань, ефективність MAS у порівнянні з фенотиповим скринінгом стає ще вагомою, оскільки, всі локуси разом можуть бути визначені в лабораторії з однієї проби ДНК. Особливим застосуванням MAS у рослинництві є допомога в ефективному відновленні рекурентного батьківського генотипу при зворотному схрещуванні. При маркеропосередкованому зворотному схрещуванні на основі певних маркерів (і відповідно, QTL) з донорського джерела, наприклад, до елітної генетичної лінії, відбувається селекція потомства від зворотного схрещування на предмет ознак донора, і потім використовується повторне зворотне схрещування з елітним сортом, щоб відновити якнайбільше генома елітної лінії. Таким чином, маркери й способи за даним винаходом можуть бути використані для напрямку маркер-опосередкованої селекції або схрещування ліній соняшника з бажаним повним набором алельних форм хромосомних сегментів, пов'язаних із чудовими агрономічними якостями. Деякі варіанти здійснення за даним винаходом охоплюють нуклеїнові кислоти, що відповідають маркерам, включаючи, але не обмежені, зондами, праймерами для ампліфікації, і продуктами ампліфікації, усі з яких можуть бути використані при генотипуванні рослин, так само як застосування зазначених нуклеїнових кислот для "прогулянки по геному" з метою визначення додаткових послідовностей або контигів, суміжних з маркером(ами), для визначення додаткових або альтернативних поліморфізмів послідовності для застосування в маркер-опосередкованій селекції. Більш широко, такі маркери можуть бути використані для збагачення генетичної карти соняшника. Даний винахід також поширюється на спосіб схрещування батьківських рослин для одержання потомства рослин соняшника й на дані рослини-потомство, по суті. Способи схрещування й вирощування рослин соняшника не виходять за межі знань середніх фахівців у даній галузі техніки. Отримане потомство може бути проаналізоване на предмет алелей, пов'язаних зі стійкістю, і бажане потомство може бути відібрано. Такі рослини-потомство або насіння можуть бути продані комерційно для вирощування соняшника, використані в їжу, оброблені для одержання бажаних компонентів, або далі використані в наступних етапах селекції. Щонайменше одна з вихідних рослин є рослиною за даним винаходом, у якому вона містить щонайменше одну алельну форму маркерів за даним винаходом, таким чином, що потомство здатне до спадкування алеля. Генетична розмаїтість важлива для віддаленої генетичної вигоди в будь-якій програмі селекції. З обмеженою розмаїтістю генетична вигода досягне в остаточному підсумку плато, коли всі сприятливі алелі будуть перенесені в елітну популяцію. Одна із цілей полягає в тому, щоб включити розмаїтість в елітний фонд, не втрачаючи генетичне придбання, що вже було зроблено, і з мінімальними можливими вкладеннями. MAS надає вказівку на те, які геномні області і які сприятливі алелі від вихідних предків піддалися селекції й були закріплені протягом довгого часу, полегшуючи зусилля, спрямовані на введення сприятливого різновиду з екзотичних джерел зародкової плазми (батьки, які не пов'язані з елітним генофондом) у надії на виявлення сприятливих алелей, які в цей час не присутні в елітному генофонді. Наприклад, маркери за даним винаходом можуть бути використані для MAS у схрещуваннях, що включають елітні х екзотичні лінії соняшника, за допомогою введення потомства, що розщеплюється, в MAS для збереження алелей високої врожайності, поряд з алелями маркера стійкості за даним винаходом. Крім того, при "позиційному картуванні " використовується близькість маркера толерантності для фізичного визначення ізольованого фрагмента хромосоми, що містить QTL толерантності. Ізольований фрагмент хромосоми може бути отриманий шляхом таких відомих методів як розщеплення хромосомної ДНК одним або більше ферментами рестрикції, або за допомогою ампліфікації ділянки хромосоми полімеразною ланцюговою реакцією (ПЦР), або будь-якою підходящою альтернативною реакцією ампліфікації. Розщеплений або ампліфікований фрагмент, як правило, лігують у вектор, що підходить для реплікації, і, наприклад, експресії, вставленого фрагмента. Маркери, які прилягають до відкритої рамки зчитування (ORF), пов'язаної з фенотиповою ознакою, можуть гібридизуватися із клоном ДНК (наприклад, клоном з бібліотеки геномної ДНК), розпізнаючи в такий спосіб клон, у якому укладена ORF (або фрагмент ORF). Якщо маркер більше віддалений, то фрагмент, що містить відкриту рамку зчитування, ідентифікують за допомогою послідовних раундів скринінга й ізоляції клонів, які разом містять нерозривну послідовність ДНК, спосіб, що називають "прогулянка по хромосомі", результатом якої стає "контиг" або "карта сегментів ДНК, які перекриваються ". Протоколи, 3 UA 104711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 достатні для того, щоб направляти середнього фахівця в даній галузі техніки через ізоляцію клонів, асоційованих зі зчепленими маркерами, представлені, наприклад, в Berger, Sambrook і Ausubel, див. нижче. Певні карти зчеплення генома соняшника доступні; див., наприклад, Tang, et al., " PCRmultiplexes for a genome-wide framework of simple sequence repeat marker loci in cultivated sunflower, " (2003) Theor. Appl. Genet. 107: 6-19; Yu, et al., "Towards a Saturated Molecular Genetic Linkage Map for Cultivated Sunflower, " (2003) Crop Science 43: 367-387; Lai, et al., "Identification and Mapping of SNPs from ESTs in Sunflower, " (2005) Theor. Appl. Genet. 111: 1532-1544; Kusterer, et al., "Molecular Mapping of the Fertility Restoration Locus Rf1 in Sunflower and Development of Diagnostic Markers for the Restorer Gene, " (2005) Euphytica 143: 35-42; PerezVich, et al., "Molecular Mapping of Nuclear Male Sterility Genes in Sunflower, " (2005) Crop Sci. 45: 1851-1857; і Chen, et al., "Molecular Mapping of a Nuclear Male-Sterility Gene in Sunflower using TRAP and SSR Markers, " (2006) Theor. Appl. Gen. 113(1): 122-127. Маркер може бути пов'язаний з одним або більше локусами, що представляють інтерес, наприклад, єдиним геном, локусом полігенної ознаки (QTL), або іншим маркером. В основі виявлення більшості генетичних маркерів лежить одна або кілька властивостей нуклеїнових кислот. Наприклад, у деяких методиках виявлення генетичних маркерів використовується гібридизація нуклеїнової кислоти-зонда з нуклеїновими кислотами, що відповідають генетичному маркеру. Способи гібридизації включають, але не обмежені, розчинну фазу, тверду фазу, змішану фазу, або методи гібридизації in situ. Маркери поліморфізмів довжини фрагментів рестрикції (RFLP) визначають за допомогою гібридизації зонда з розщепленої ендонуклеазою рестрикції геномної ДНК. Зонд, як правило, є субфрагментом (або синтетичний олігонуклеотид, що відповідає субфрагменту нуклеїнової кислоти, що потрібно визначити). Ендонуклеазу рестрикції вибирають так, щоб надати фрагменти рестрикції щонайменше двох альтернативних (або поліморфних) довжин у різних особин, і найчастіше буде варіювати від лінії до лінії. Визначення, яка(і) ендонуклеаза(и) рестрикції робить(ять) інформативні фрагменти для кожної комбінації особин, є простою процедурою, широко відомою в даній галузі техніки. Після поділу за розміром у відповідній матриці (наприклад, агарозі) і переносу на мембрану (наприклад, нітроцелюлоза, нейлон), мічений зонд гібридизують в умовах, які забезпечують рівноважне зв'язування зонда з мішенню, після чого надлишок зонда видаляють за допомогою промивання. Олігонуклеотидні зонди до маркерних локусів можуть бути клоновані і/або синтезовані. Мітки для детекції, що підходять для використання з олігонуклеотидними зондами, включають будьяку композицію, яку можливо визначити за допомогою спектроскопічних, радіоізотопних, фотохімічних, біохімічних, імунохімічних, електричних, оптичних або хімічних засобів. Підходящі мітки включають біотин для фарбування кон'югованим з міткою стрептавидином, магнітні кульки, флуоресцентні мітки, радіоактивні мітки, ферменти, і колориметричні мітки. Інші мітки включають ліганди, які зв'язуються антитілами, позначеними флуорофорами, хемілюмінесцентними засобами й ферментами. Мічені маркери швидко одержують як, наприклад, за допомогою позначених праймерів для ПЦР до маркерних локусів. Гібридизований зонд потім виявляють у більшості випадків за допомогою авторадіографії або іншого подібного методу виявлення (наприклад, флюорографії або рідинного сцинтиляційного лічильника). Приклади конкретних протоколів гібридизації широко доступні в даній галузі техніки, див., наприклад, Berger and Kimmel (1987) Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego ("Berger"); Sambrook, et al., (2001) Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 3rd ed. Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor ("Sambrook"); і Ausubel, et al., (eds) (supplemented through 2001) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. ("Ausubel"). "Ампліфіковані варіабельні послідовності" відносяться до ампліфікованих послідовностей генома рослини, які мають високу мінливість залишків нуклеїнової кислоти між членами тих самих видів. Всі організми мають варіабельні послідовності генома, і кожний організм (за винятком клону) має різний набір варіабельних послідовностей. Після визначення, присутність певної варіабельної послідовності може бути використана для пророкування фенотипових ознак. Переважно, ДНК із рослини служить матрицею для ампліфікації праймерaми, які примикають до варіабельної послідовності ДНК. Варіабельну послідовність ампліфікують і потім секвенують. Методи ампліфікації in vitro широко відомі в даній галузі техніки. Приклади методів, достатніх для ознайомлення фахівця з даними in vitro методами, включаючи полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР), лігазну ланцюгову реакцію (LCR), ампліфікацію Qβ-репліказою і інші методи, у яких використовуються РНК-полімерази (наприклад, NASBA), можуть бути знайдені в 4 UA 104711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Berger, Sambrook і Ausubel (усе вище) так само як і в Mullis, et al., (1987) патент США № 4 683 202, PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (Innis, et al., eds.) Academic Press Inc., San Diego Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (October 1, 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3: 81-94; Kwoh, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173; Guatelli, et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874; Lomell, et al., (1989) J. Clin. Chem 35:1826; Landegren, et al., (1988) Science 241: 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8:291-294; Wu and Wallace, (1989) Gene 4:560; Barringer, et al., (1990) Gene 89:117; і Sooknanan and Malek (1995) Biotechnology 13: 563-564. Поліпшені способи клонування in vitro ампліфікованих нуклеїнових кислот описані в Wallace et al., патент США № 5 426 039. Поліпшені способи ампліфікації більших фрагментів нуклеїнових кислот за допомогою ПЦР узагальнені в Cheng, et al., (1994) Nature 369:684, і в посиланнях там же, де одержували ПЦР-амплікони до 40 КБ. Середній фахівець у даній галузі техніки повністю розуміє, що по суті будь-яка РНК може бути перетворена у дволанцюгову ДНК, що підходить для розщеплення рестриктазами, ПЦР ампліфікації й секвенування, використовуючи зворотну транскриптазу й полімеразу. Див., Ausubel, Sambrook і Berger, усе вище. Олігонуклеотиди для використання в якості праймерів, наприклад, у реакціях ампліфікації й для використання як зонди з послідовності нуклеїнової кислоти, як правило, синтезуються хімічно згідно твердофазному фосфорамідитному триефірному методу, описаному в Beaucage and Caruthers (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859, або можуть бути просто замовлені комерційно. Як альтернатива, для ідентифікації генетичних маркерів може бути використана реплікація, що самопідтримується. Реплікація, що самопідтримується відноситься до методу ампліфікації нуклеїнової кислоти, використовуючи послідовності нуклеїнової кислоти-мішені, які експоненційно реплікуються in vitro у по суті ізотермічних умовах за допомогою використання трьох ферментативних активностей, залучених у реплікацію ретровірусів: (1) зворотна транскриптазу, (2) Rназа H, і (3) ДНК-залежна РНК-полімераза (Guatelli, et al., (1990) Proc Natl Acad Sci USА 87:1874). За допомогою наслідування ретровірусної стратегії реплікації РНК за допомогою проміжних кДНК, у даній реакції накопичується копії кДНК і РНК вихідної мішені. Картування маркерних локусів Для ідентифікації й аналізу молекулярних маркерів було розроблено кілька експериментальних парадигм. Як правило, такі парадигми включають схрещування однієї або декількох батьківських пар, які можуть бути, наприклад, єдиною парою, отриманою від двох інбредних ліній, або кілька родинних або неспоріднених батьків від різних інбредних штамів або ліній, які проявляють різні фенотипні родинні характеристики ознаки, що цікавить. Батьків і популяцію нащадків генотипують по маркерних локусах і фенотипово оцінюють за ознакою, яка цікавить. У контексті даного винаходу, батьківські рослини й рослини-нащадки генотипують за маркером BRSII або гомологам, або альтернативним маркерам, пов'язаним з маркером BRSII, і оцінюють на предмет стійкості до Orobanche. Маркери, пов'язані зі стійкістю, ідентифікують на основі значимих статистичних кореляцій між генотипом(ами) маркера й фенотипами оцінених рослин-нащадків. Численні методи визначення, чи зв'язані генетично маркери з геном, пов'язаним зі стійкістю до Orobanche, відомі фахівцям у даній галузі техніки й включають, наприклад, картування (Lander and Botstein (1989) Genetics 121:185), регресійне картування (Haley and Knott (1992) Heredity 69:315) і MQM картировання (Jansen (1994) Genetics 138:871). Див. також патенти США 6 399 855 і 6 368 806. Двома типами маркерів, часто використовуваних у маркер-опосередкованій селекції, є прості повторювані послідовності (SSR, також відомі як мікросателіти) і однонуклеотидні поліморфізми (SNP). Термін SSR відноситься взагалі до будь-якого типу молекулярної гетерогенності, що приводить до мінливості довжини, і найчастіше, є коротким (до декількох сотень пар азотистих основ) сегментом ДНК, що складається з послідовності багаторазових тандемних повторів двох або трьох пар азотистих основ. Ці повторювані послідовності складають високо поліморфні ділянки ДНК змінної довжини через низьку точність реплікації, наприклад, викликаною "прослизанням" полімерази. Уважається, що SSR розташовано в геномі випадковим чином і, як правило, оточені консервативними областями. Динуклеотидні повтори були знайдені у вищих рослин (Condit and Hubbell (1991) Genome 34:66). SSR геномна мінливість є наслідуваною, мультиалельною, кодомінантною і відтворено виявленою, роблячи SSR добре підходящими для використання як молекулярно-генетичні маркери. Швидке збільшення усе більше складних методів виявлення, заснованих на ампліфікації (наприклад, ПЦР), надає безліч чутливих методів детекції гетерогенності. Праймери створюються таким чином, щоб гібридизуватися з консервативними областями, які примикають до SSR домену, приводячи до ампліфікації варіабельної SSR області. Різні амплікони, отримані з однієї SSR області, мають характерні й відтворені розміри. Амплікони 5 UA 104711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SSR різного розміру, одержувані із двох гомологічних хромосом особини, або від різних особин у популяції рослин, як правило, називають "маркерними алелями". За умови, що існують щонайменше два алеля SSR, які роблять продукти ПЦР щонайменше двох різних розмірів, SSR можна використовувати як маркер. Маркери SSR можуть бути отримані на основі геномної ДНК або EST (маркерні експресуючі послідовності). Маркери, які засновані на однонуклеотидних поліморфізмах (SNP), також відомі в даній галузі техніки. SNP утворюється, коли єдиний нуклеотид (A, T, C або G) у геномній послідовності змінений або відбувається вставка/делеція. SNP може призводити, а може й ні, до функціональної зміни гена. Для виявлення SNP були розроблені різні методи, включаючи метод алельспецифічної гібридизації (АСГ; див., наприклад, Coryell, et al., (1999) "Allele specific hybridization markers for soybean, " Theor. Appl. Genet. 98: 690-696). Удосконалення SNP аналізу й пристосування для використання в системах з високою пропускною здатністю відомі фахівцям у даній галузі техніки; див., наприклад, Shirasawa, et al., (2006) Theor. Appl. Genet. 113 (1): 147155; Giancola, et al., (2006) Theor. Appl. Genet. 112 (6): 1115-1124. SSR маркер може служити першим кроком у розвитку маркера SNP; див., Brooks, et al., (2006) Crop Sci. 46(4): 1467-1470. SSR і SNP маркери можуть бути використані в комбінації; див., Gilson, et al., (2006) Transgenic Res. 15(6): 785-786. Про SNP аналіз промоторних послідовностей повідомляли (Schwarz, et al., (2003) J. Agr. Food Chem. 51(15): 4263-4267). Додаткові типи молекулярних маркерів також широко використовуються, включаючи поліморфізм довжини фрагментів рестрикції (RFLP), поліморфізм довжини ампліфікованих фрагментів (AFLP), довільно ампліфікована поліморфна ДНК (RAPD), і ізоферментні маркери. Широкий діапазон протоколів для детекції такої мінливості відомий фахівцям у даній галузі техніки, і ці протоколи часто є специфічними для типу поліморфізму, який вони призначені детектувати, включаючи, наприклад, ПЦР ампліфікацію, одноланцюгові конформаційні поліморфізми (SSCP) і самопідтримуючу реплікацію послідовності (3SR; див., Chan and Fox (1999) "NASBA and other transcription-based amplification methods for research and diagnostic microbiology, " Reviews in Medical Microbiology 10: 185-196). Незалежно від молекулярної природи, наприклад, чи є маркер SSR, SNP, RFLP, або іншим типом, маркери є, як правило, штам-специфічними; тобто, конкретний маркер є певним для батьківських ліній, які цікавлять. Для кожного маркерного локусу алелі стійкості й сприйнятливості ідентифіковані для кожної пари батьківських ліній. Додержуючись кореляції певних алелей зі стійкістю або сприйнятливістю в батьківських лініях, маркер може бути використаний для визначення генотипів потомства, які відповідають бажаному фенотипу. Зчеплення молекулярного маркера з локусом, який цікавить, вимірюється як частота рекомбінації, що визначає відстань (у сантіморганах, сМ) між орієнтирами на генетичній карті. Фізична відстань між локусами вимірюють у парах основ, наприклад, тисяч пар основ (т.пп.) або мільйонів пар основ (м.пп.), відстань між двома локусами на хромосомі. Як правило, чим ближче два локуси (наприклад, маркер SNP і QTL) перебувають на генетичній карті, тим ближче вони лежать один до одного на фізичній карті. У той час як відносна генетична відстань, як правило, пропорційна фізичній відстані між локусами, неточність кореляція між сМ і фізичною відстанню може бути результатом мінливості в частотах рекомбінації для різних хромосомних ділянок. Деякі хромосомні ділянки є "гарячими крапками" рекомбінації, у той час як інші області не показують рекомбінації, або демонструють тільки рідкі рекомбінаційні події. Як правило, чим ближче маркер до локусу, який цікавить, тим краще він підходить для вказівки на бажану ознаку селекції. Метою селекціонера рослин є збагачення популяції рослин особинами з бажаними властивостями, приводячи в остаточному підсумку до поліпшеної сільськогосподарської продуктивності. Очевидно, що певні хромосомні локуси (або інтервали), які можуть бути картовані в геномі організму, можуть корелювати з певними кількісними фенотипами. Такі локуси називають локусами полігенних ознак, або QTL. Селекціонер рослин може успішно використовувати молекулярні маркери для визначення бажаної особини за допомогою ідентифікації маркерного алеля, що проявляє статистично значиму ймовірність косегрегації з бажаним фенотипом, проявляючись у вигляді нерівноважного зчеплення. За допомогою ідентифікації молекулярного маркера або групи молекулярних маркерів, які косегрегують з полігенною ознакою, селекціонер ідентифікує QTL. Для ідентифікації й аналізу QTL було розроблено кілька експериментальних парадигм (див., наприклад, Jansen (1996) Trends Plant Sci 1:89). Більшість опублікованих повідомлень по картуванню QTL у сільськогосподарських культур було засновано на дискретному схрещуванні (Lynch and Walsh (1997) Genetics and Analysis of Quantitative Traits, Sinauer Associates, Sunderland). За допомогою ідентифікації й селекції маркерного алеля (або бажаних алелей декількох маркерів), зчепленого з бажаним 6 UA 104711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фенотипом, селекціонер рослин у стані швидко провести селекцію на користь бажаного фенотипу. Такий спосіб називають маркер-опосередкованою селекцією, або MAS. Чим більше молекулярних маркерів нанесено на генетичну карту, тим потенційно більш корисною стає карта для проведення MAS. Численні статистичні методи для визначення генетичного зчеплення маркерів з локусом, який цікавить, відомі фахівцям у даній галузі техніки й включають, наприклад, стандартні лінійні моделі, такі як ANOVA або регресійне картування (Haley and Knott (1992) Heredity 69:315), методи максимальної правдоподібності, такі як алгоритми максимізації очікування (наприклад, Lander and Botstein (1989) "Mapping Mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps, " Genetics 121:185-199; Jansen (1992) "A general mixture model for mapping quantitative trait loci by using molecular markers, " (1993) Theor. Appl. Genet, 85: 252-260; Jansen "Maximum likelihood in a generalized linear finite mixture model by using the EM algorithm, " Biometrics 49: 227-231; Jansen (1994) "Mapping of quantitative trait loci by using genetic markers: an overview of biometrical models, " In J. W. van Ooijen and J. Jansen (eds.), Biometrics in Plant breeding: applications of molecular markers, pp. 116-124, CPRO-DLO Netherlands; Jansen (1996) "A general Monte Carlo method for mapping multiple quantitative trait loci, " Genetics 142: 305-311; і Jansen and Stam (1994) "High Resolution of quantitative trait into multiple loci via interval mapping, " Genetics 136: 1447-1455). Ілюстративні статистичні методи включають метод аналізу маркера по одній крапці, картирування інтервалу (Lander and Botstein (1989) Genetics 121:185), комплексне картирування інтервалу, аналіз штрафної регресії, складний племінний аналіз, аналіз MCMC, аналіз MQM (Jansen (1994) Genetics 138:871), аналіз HAPLO-IM +, аналіз HAPLO-MQM, аналіз HAPLO-MQM +, Bayesian MCMC, гребнева регресія, аналіз методом визначення по родоводу й регресія Haseman-Elston, кожної з яких є підходящим у контексті даного винаходу. Додаткові подробиці щодо альтернативних статистичних методів, застосовних до складних перехресних популяцій, які можуть бути використані для ідентифікації й локалізації QTL, описані в: патенті США № 6 399 855 Beavis, et al., "QTL Mapping in Plant Breeding Populations" і WO2001/049104, Jansen, et al., "MQM Mapping Using Haplotyped Putative QTL-Alleles: A Simple Approach for Mapping QTLs in Plant Breeding Populations." Ці підходи вимагають великого обсягу обчислень і звичайно виконуються за допомогою системи з керуванням від ЕОМ і спеціалізованого програмного забезпечення. Підходящі статистичні пакети доступні в безлічі суспільних і комерційних джерел, і відомі фахівцям у даній галузі техніки. У даній галузі техніки назріла потреба в поліпшенні зародкової плазми соняшника, що була б стійкою до Orobanche сumana. У даній галузі техніки існує потреба в ідентифікації молекулярних маркерів, які зчеплені з локусами стійкості до Orobanche сumana для полегшення MAS. Такі маркери можуть бути використані для селекції індивідуальних особин рослин і популяції рослин, які мають сприятливі маркерні алелі, які можуть бути далі застосовані в селекції стійкого фенотипу. Як альтернатива, маркери можуть бути використані для негативної селекції рослини або популяції рослин, які сприйнятливі до Orobanche cumana. Даний винахід представляє композиції й способи, які задовольняють дані потреби і мають інші переваги. Заявлено способи ідентифікації рослини соняшника або зародкової плазми, які мають стійкість, поліпшену стійкість або сприйнятливість до Orobanche cumana. Також надані способи створення рослин соняшника або зародкової плазми, які є стійкими або мають поліпшену стійкість до Orobanche cumana, наприклад, де стійкі рослини отримані завдяки інтрогресії бажаних маркерних алелей стійкості (наприклад, маркер-опосередкована селекція), і/або за допомогою методів трансгеноза. Рослини або зародкова плазма, отримані за допомогою способів за даним винаходом, також є об'єктом даного винаходу. Системи ідентифікації рослини й зародкової плазми з передбаченою стійкістю, поліпшеною стійкістю або сприйнятливістю до Orobanche cumana, також є відмітною ознакою даного винаходу, так само як і набори, які полегшують способи за даним винаходом. У певних варіантах здійснення даний винахід надає способи для ідентифікації першої рослини соняшника, що має стійкість, поліпшену стійкість, або сприйнятливість до Orobanche cumana. У цих способах алель щонайменше одного маркерного локусу, що пов'язаний зі стійкістю, поліпшеною стійкістю, або сприйнятливим фенотипом, детектують у першої рослини соняшника. Маркерним локусом може бути BRSII. Як правило, близько зчеплений локус проявляє частоту генетичної рекомбінації відносно маркерного локусу менш чим приблизно 10 %. У бажаних варіантах здійснення зчеплений локус проявляє частоту генетичної рекомбінації 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,75 %, 0,5 або 0,25 %, або менше. При бажанні, визначають рослини, які володіють щонайменше одним сприятливим алелем, що позитивно корелює зі стійкістю або поліпшеною стійкістю. Необов'язково, у рослини 7 UA 104711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 визначають, або проводять ітрогресію, двох, трьох або більше сприятливих алелів. Для аналізу стійкості або сприйнятливості соняшника до Orobanche cumana може бути використаний будьякий підходящий метод. Наприклад, стійкість може бути розрахована на частині поля, про яке відомо, що на ньому поширені насіння Orobanche, або рівень стійкості може бути розрахований, використовуючи контрольовані тепличні або оранжерейні умови. Способи скринінга докладно описані в WO 2003/073837. Кожний з безлічі молекулярних методів може бути використаний для виявлення маркерного алеля. Наприклад, алельна форма поліморфного простого повтору (SSR) може бути виявлена за допомогою методики, заснованої на ампліфікації, як наприклад, ПЦР. Як альтернатива, маркерний алель, що несе однонуклеотидний поліморфізм (SNP), може бути виявлений за допомогою кроку ампліфікації, за яким йде метод алель-специфічної гібридизації (ASH). У цих і інших методах детекції, заснованих на ампліфікації, маркерний локус або його частину ампліфікують (наприклад, за допомогою ПЦР, LCR або транскрипції, використовуючи як матрицю нуклеїнову кислоту, виділену від рослини, що цікавить, і визначають отриманий амплікон маркера. В одному із прикладів, запал для ампліфікації або пару праймерів для ампліфікації (наприклад, пару праймерів представлених в SEQ ID NO: 5 і 6) змішують із геномною нуклеїновою кислотою, ізольованою від першої рослини соняшника, при цьому праймер або пара праймерів є комплементарними або частково комплементарними щонайменше частині маркерного локусу, і здатні до ініціації полімеризації ДНК за допомогою ДНК-полімерази, використовуючи як матриця геномну нуклеїнову кислоту соняшника. Праймер або пару праймерів (наприклад, пару праймерів, що ампліфікують маркерний локус BRSII) добудовується в реакції полімеризації ДНК у присутності ДНК-полімерази й матричної геномної нуклеїнової кислоти з одержанням щонайменше одного амплікона. У кожному разі, дані, що представляють визначений(і) алель(і), можуть бути перенесені (наприклад, за допомогою електроніки або через інфрачервону, бездротову або оптичну передачу) на комп'ютер або на носій, що читається комп'ютером, для аналізу або зберігання. Фахівцям ясно, що здатність детектувати сприятливий маркерний локус, що корелює зі стійкістю до Orobanche, представляє спосіб для селекції рослини зі сприятливою ознакою стійкості. Таким чином, будь-яка рослина, що ідентифікована як носій бажаного маркерного локусу, може бути позитивно селектована, у той час як рослини, що не мають цього локусу, або що мають локус, що негативно корелює зі стійкістю, можуть бути селектовані проти. Таким чином, в одному зі способів, після ідентифікації сприятливого маркерного локусу, способи включають селекцію першої рослини соняшника або селекцію потомства першої рослини. Крім того, обрана перша рослина соняшника може бути схрещена із другою рослиною соняшника (наприклад, елітний або екзотичний соняшник, залежно від ознак, які бажані в потомстві). Точно так само, якщо алель корелює зі стійкістю до Orobanche, спосіб може містити інтрогресію алеля в другу рослину соняшника. За бажанням, друга рослина соняшника має меншу стійкість до Orobanche, чим перша рослина соняшника, у той час як рослина соняшника після інтрогресії має підвищену толерантність до Orobanche у порівнянні із другою рослиною. У деяких варіантах здійснення елітна рослина соняшника використовується як друга рослина для інтрогресії. Рослина соняшника після інтрогресії або зародкова плазма, отримані за допомогою кожного з наведених у даному описі способів, також є відмітними ознаками за даним винаходом. Трансгенні підходи також можуть бути використані для одержання рослин соняшника або зародкової плазми, стійких до Orobanche. Наприклад, способи одержання рослини соняшника з підвищеною стійкістю до Orobanche, можуть включати введення екзогенної нуклеїнової кислоти в цільову рослину соняшника, при цьому екзогенна нуклеїнова кислота отримана з геномної нуклеотидної послідовності, що близько зчеплена зі сприятливим маркерним локусом, що асоційований з підвищеною стійкістю до Orobanche. Маркерним локусом може бути BRSII, і/або генетичний локус, зчеплений з ним. Для одержання екзогенної нуклеїнової кислоти може бути використаний кожний з безлічі способів. В одному способі нуклеотидна послідовність виділена шляхом позиційного клонування, і ідентифікована як зчеплена зі сприятливим алелем. Точний склад екзогенної нуклеїнової кислоти може варіювати; в одному варіанті здійснення екзогенна нуклеїнова кислота відповідає відкритій рамці зчитування (ORF), що кодує поліпептид, що при експресії в рослині соняшника, приводить до появи рослини соняшника з поліпшеною стійкістю до Orobanche. Системи для ідентифікації рослини соняшника, що очікувано має стійкість, поліпшену стійкість або сприйнятливість до Orobanche, також є відмітною ознакою даного винаходу. Як правило, система може включати (a) набір маркерних зондів або праймерів, що підходять для 8 UA 104711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 детекції щонайменше одного сприятливого алеля маркерного локусу, пов'язаного зі стійкістю до Orobanche, при цьому маркерним локусом може бути BRSII або генетичний локус, зчеплений з ним; (b) детектор, що підходить для виявлення одного або більше вихідного(их) сигналу(ів) від набору маркерних зондів, або праймерів, або їх амплікона, ідентифікуючи в такий спосіб присутність або відсутність алеля; і (c) системні інструкції, які визначають кореляцію присутності або відсутності сприятливого алеля з очікуваною стійкістю або сприйнятливістю. У деяких варіантах здійснення набір маркерних зондів або праймерів містить нуклеотидні послідовності, надані в SEQ ID NO: 3-6. Точна конфігурація детектора буде залежати від типу мітки, використовуваної для виявлення маркерного алеля. Типові варіанти здійснення включають детектори світла, детектори радіоактивності, і т.п. Виявлення емісії світла (або комплексної емісії світла) або іншого міченого зонда вказує на присутність або відсутність маркерного алеля. Подібним чином, точна форма інструкцій може змінитися залежно від компонентів системи, наприклад, вони можуть бути присутнім або в системному програмному забезпеченні в одній або декількох інтегрованих групах систем, або можуть бути присутнім в одному або більше комп'ютерах або носіях, що читаються на комп'ютері, функціонально з'єднаних з датчиком. В одному типовому варіанті здійснення системні інструкції включають щонайменше одну довідкову таблицю, що включає кореляцію між присутністю або відсутністю сприятливого алеля й очікуваною стійкістю або поліпшеною стійкістю. Система може складатися з окремих елементів або може бути об'єднана в одне ціле для зручності детекції маркерних алелей і для визначення кореляції між маркером і ознакою. Дана система може також включати пробу, як наприклад, геномну ДНК, ампліфіковану геномну ДНК, кДНК, ампліфіковану кДНК, РНК, або ампліфіковану РНК від соняшника або від обраної тканини рослини соняшника. Якщо не зазначено інакше, всі технічні й наукові терміни, використані в даному описі, мають таке ж значення, як і загальновідомі фахівцям у даній галузі техніки, до якої належить даний винахід. Якщо не зазначено інакше, методи, використовувані або розглянуті тут, є стандартними методиками, відомими кваліфікованому фахівцеві в даній галузі техніки. Матеріали, способи й приклади є лише ілюстративними й не обмежують обсяг даного винаходу. У контексті даного опису будуть використані багато термінів. Щоб надати ясне й погоджене розуміння опису й формули винаходу, включаючи галузь, у якій представлені ці терміни, надані нижченаведені визначення. "Алель" відноситься до одного із двох або декількох нуклеотидних послідовностей, які можуть зустрічатися в певному хромосомному локусі. У гетерозиготній диплоїдній особі є дві різні форми послідовності, або алеля, у відповідних локусах на парі хромосом. У гомозиготній диплоїдній особі є дві копії того самого алеля у відповідних локусах гомологічних хромосом. "Сприятливий алель" може бути алелем у певному локусі, що наділяє, або сприяє, агрономічно бажаним фенотипом. При інших випадках, "сприятливий алель" може бути таким, котрий дозволяє ідентифікувати рослини з невигідними агрономічними ознаками, як наприклад, схильність до захворювання. Алель "позитивно" корелює з ознакою, якщо присутність алеля є індикатором того, що рослина, що містить даний алель, має бажану ознаку або форму ознаки. Алель "негативно" корелює з ознакою, якщо присутність алеля є індикатором того, що рослина, що містить даний алель, не має бажану ознаку або форму ознаки. "Алельна частота" відноситься до частоти, з якої алель перебуває в локусі в особини, у лінії або в популяції ліній. Наприклад, для алелі "A", диплоїдні особини з генотипами "AA", "Aa" або "aa" мають алельні частоти 1,0, 0,5, або 0,0, відповідно. Термін "зчеплений з" або "зчеплений" у контексті даного винаходу відноситься, наприклад, до нуклеїнової кислоти й фенотипової ознаки, які перебувають у нерівноваговому зчепленні, тобто, нуклеїнова кислота й ознака визначаються разом у рослин потомства частіше, ніж якщо нуклеїнова кислота й фенотип успадковуються окремо. "Заразиха", "Orobanche cumana" "Orobanche cumana Wallr.", "O. Cumana Loefl", "Orobanche", і "O. cumana" взаємозамінно використовуються в рамках даного опису для посилання на описаний паразитуючий бур'ян і його види. Термін "сантіморган" означає одиницю виміру частоти рекомбінації. Один сантіморган представляє 1 %-ий шанс, що маркер в першому генетичному локусі, у рамках одного покоління, буде відділений від маркера в другому локусі в результаті кроссинговера. "Цитоплазматично чоловічо-стерильний" або "ЦЧС": лінія соняшника, що не виробляє життєздатного пилка, називається чоловічо-стерильною. Цитоплазматична чоловіча стерильність передається по материнській лінії, тобто, чоловічу стерильну рослину 9 UA 104711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використовують в якості жіночого батька при схрещуванні з пилком від іншого соняшника. ЦЧС лінії одержують за допомогою схрещування відтвореної лінії з рослиною соняшника із цитоплазматичною чоловічо-стерильною ознакою, і потім проводять поворотне схрещування з відтвореною лінією до одержання лінії із чоловічою стерильністю, що є гомологічною до відтворюючої лінії за всіма іншими ознаками. ЦЧС лінії також згадуються як жіночі лінії. "Генетична карта" є описом взаємовідносин генетичного зчеплення між локусами на одній або декількох хромосомах (або груп зчеплення) у межах даного виду, як правило, зображеною в схематичній або табличній формі. "Генетичне картування" є способом визначення взаємовідносин зчеплення локусів за допомогою генетичних маркерів, популяцій, різнорідних по маркерах, і стандартних генетичних принципів частоти рекомбінації. "Місце розташування на генетичній карті" є контрольною крапкою на генетичній карті, щодо навколишніх генетичних маркерів у межах однієї групи зчеплення, де може бути знайдений зазначений маркер. Напроти, фізична карта генома відноситься до абсолютних відстаней (наприклад, обмірюваних у парах азотистих основ або ізольованих і суміжних генетичних фрагментах, які перекриваються або контигах). Фізична карта генома не бере до уваги генетичне поводження (наприклад, частоти рекомбінації) різних сегментів хромосоми. Термін "генетично зчеплений" відноситься до генетичних локусів, які перебувають у нерівноважному зчепленні й відповідно до статистики успадковуються не незалежно. Генетично зчеплені локуси успадковуються зчеплено у від 51 % до 99 % випадків або будь-якому цілочисельному значенні в даному інтервалі, переважно щонайменше 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % або 99 %. Термін"однорідність" указує на те, що члени групи мають однаковий генотип за одним або декількома конкретними локусами. Термін "гетерогенність" указує на те, що особини в межах групи відрізняються за генотипами за одним або більше конкретними локусами. Термін "гомологічний" відноситься до послідовностей нуклеїнових кислот, які походять від загального предкового гена за допомогою природних або штучних механізмів (наприклад, члени одного сімейства генів), і таким чином, як правило, розділяють подібність послідовностей. Гомологічні нуклеїнові кислоти найчастіше мають достатній ступінь подоби послідовностей так, що одна з послідовностей або комплементарна їй здатна вибірково гібридизуватися з іншою в жорстких умовах гібридизації. Термін "вибірково гібридизується" включає посилання на гібридизацію в жорстких умовах послідовності нуклеїнової кислоти з певною послідовністю нуклеїнової кислоти-мішені до більшого ступеня визначення (наприклад, щонайменше 2-кратно перевищуючи вихідний), чим її гібридизація зі сторонніми послідовностям нуклеїнових кислот й до істотного виключення нуклеїнових кислот, що не відносяться до нуклеїнової кислоти-мішені. Послідовності, які гібридизуються вибірково, володіють щонайменше приблизно 80 % ідентичністю послідовності, часто щонайменше 90 % ідентичністю послідовності, і можуть володіти 95 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентичністю між послідовностями. Нуклеїнова кислота, що володіє щонайменше деяким ступенем гомології з вихідною нуклеїновою кислотою, може бути відмінною або ідентичною вихідній нуклеїновій кислоті або комплементарної їй послідовності. Термін "клітина-хазяїн" означає клітину, що містить гетерологічну нуклеїнову кислоту, таку як вектор, і підтримує реплікацію і/або експресію даної нуклеїнової кислоти. Клітини-хазяї можуть бути прокаріотичними клітинами, як наприклад, E. coli, або еукаріотичними клітинами, як наприклад, клітини дріжджів, комах, амфібій, або клітини ссавців. Переважно, клітиною-хазяїном є клітини рослини. У рамках даного винаходу, однією особливо кращою клітиною-хазяїном є клітина соняшника. Термін "інтервал" відноситься до безперервної лінійної ділянки хромосомної ДНК, кінці якої обмежені й включають молекулярні маркери. Термін "уведений" при застосуванні до гетерологічної або виділеної нуклеїнової кислоти, відноситься до введення нуклеїнової кислоти в еукаріотичну або прокаріотичну клітину, причому нуклеїнова кислота може бути інкорпорована в геном клітини (наприклад, хромосома, плазмида, пластида або мітохондріальна ДНК), перетворена в автономний реплікон, або тимчасово експресована (наприклад, трансфікована мРНК). Даний термін включає такі засоби введення нуклеїнової кислоти як "трансфекція", "трансформація" і "трансдукція". Термін "інтрогресія" відноситься до переносу бажаного алеля генетичного локусу з одного генетичного фонду в інший. Наприклад, інтрогресія бажаного алеля в певному локусі може відбутися при статевому схрещуваванні двох рослин, причому щонайменше одна рослина володіє бажаним алелем у складі свого генома. Алель інтрогресується у потомство. В іншому прикладі передача алеля може відбутися за допомогою рекомбінації між геномами двох донорів in vitro, наприклад, у протопласті, що 10 UA 104711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 злився, де щонайменше один протопласт-донор володіє бажаним алелем у складі свого генома. Бажаний алель може бути, наприклад, трансгеном або обраним маркерним алелем або локусом полігенної ознаки. Термін "ізольований" або "виділений" відноситься до матеріалу, такого як нуклеїнова кислота або білок, що по суті вільний від компонентів, які звичайно супроводжують або взаємодіють із ним, в оточенні, що зустрічається в природних умовах. Ізольований матеріал необов'язково містить матеріал, що не перебуває з даним матеріалом у його природному середовищі, наприклад, клітині. Крім того, якщо даний матеріал перебуває у своєму природному середовищі, як наприклад, у клітині, то даний матеріал був поміщений в область у клітині (наприклад, геном або субклітинна органела), що є неприродною для даного матеріалу, що перебуває в цьому навколишньому середовищі. Наприклад, нуклеїнова кислота, що зустрічається в природі (наприклад, промотор), як уважається, є ізольованою, якщо вона уведена за допомогою засобу, що не зустрічається в природі, у геномний локус, що не є природним для цієї нуклеїнової кислоти. Нуклеїнові кислоти, які є "ізольованими" як зазначено в даному описі, також позначені як "гетерологічні" нуклеїнові кислоти. "Лінія" означає групу рослин, які є генетично гомогенними й мають низьку варіабельність між особинами, як правило, у результаті декількох генерацій самозапилення. Крім того, лінія може включати групу рослин, розмножених вегетативним способом з однієї вихідної рослини, використовуючи методику клітинних і тканинних культур. Термін "нерівноважне зчеплення" відноситься до невипадкової сегрегації генетичних локусів. Мається на увазі, що такі локуси перебувають у достатній фізичній близькості по всій довжині хромосоми, і вони мають тенденцію сегрегувати разом, тобто, з більшою частотою, чим при випадковому розподілі. Терміни "маркер", "молекулярний маркер" і "маркерний локус" відносяться до нуклеотидної послідовності або кодованого ними продукту (наприклад, білку), що використовують як крапку відліку, ідентифікуючи зчеплений локус, як наприклад, локус полігенної ознаки (QTL). Маркер може походити з геномної нуклеотидної послідовності або з нуклеотидних послідовностей, що експресуються, або з кодованого поліпептида. Термін може також відноситися до послідовностей нуклеїнової кислоти, комплементарним, або пов'язаним з послідовністю маркера, як наприклад, нуклеїнові кислоти, використовувані як зонди або пари праймерів, за допомогою яких може бути ампліфікована послідовність маркера. Така послідовність нуклеїнової кислоти або молекула, що може бути використана для ідентифікації наявності маркерного локусу, наприклад, зонд нуклеїнової кислоти, що є комплементарним послідовності маркерного локусу, можуть також згадуватися як "маркерний зонд". Як альтернатива, у деяких аспектах маркерний зонд відноситься до будь-якого зонда, що здатний відрізнити (тобто, визначити генотип) певний алель, що є присутнім у маркерному локусі. Терміни "нуклеїнова кислота", "полінуклеотид", "полінуклеотидна послідовність" і "послідовність нуклеїнової кислоти" відносяться до одноланцюгового або дволанцюгового дезоксирибонуклеотиду або рибонуклеотидних полімерів або їхніх химер. Як використовуються в даному описі, ці терміни можуть додатково або як альтернатива включати аналоги нуклеотидів що зустрічаються в природі, що володіють важливою властивістю природних нуклеотидів, а саме, вони гібридизуються з одноланцюговими нуклеїновими кислотами подібно тому, як нуклеотиди, що зустрічаються в природі (наприклад, пептидно-нуклеїнові кислоти). Якщо не зазначено інакше, конкретна послідовність нуклеїнової кислоти за даним винаходом на додаток до послідовності, зазначеної явно, необов'язково охоплює комплементарні послідовності. Термін "ген" використаний як для позначення, наприклад, кДНК і мРНК, кодованої геномною послідовністю, так і цієї геномної послідовності. "Рослини або частини рослини" відносяться до рослинних клітин, рослинних протопластів, культур клітинних тканин рослин з яких можуть бути регенеровані рослини, калюсів рослин, пагонів рослин і клітин рослин, які не ушкоджені на рослинах, або частин рослин, як наприклад, ембріони, пилок, яйцеклітини, квіти, листи, шкірочки, стебла, коріння, кореневі кінчики, пильовики, насіння й борошно з насінь, і т.п. Термін "локус полігенної ознаки" або "QTL" відноситься до поліморфного генетичного локусу щонайменше із двома алелями, які диференційовано відображають експресію безперервно розподіленої фенотипової ознаки. У рамках даного винаходу, "стійкість", "стійкість до заразихи" або "стійкість до Orobanche" визначаються як генетично-обумовлена властивість рослин соняшника, що перешкоджає прикріпленню паразитуючої рослини заразихи до рослини соняшника й дозволяє закінчити свій життєвий цикл, пройшовши через репродуктивну (сім'яносну) стадію. Стійкість може бути результатом однієї або декількох взаємовідносин рослини й паразита, включаючи, але без 11 UA 104711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 обмеження: (1) відсутність необхідного стимулу для проростання насіння заразихи від рослини соняшника (передбачається, що це хімічний компонент пасоки); (2) запобігання проникнення гаусторій заразихи через поверхню кореня соняшника; або (3) запобігання доступу гаусторій заразихи до судинної системи рослини соняшника. Термін "рекомбінантний" відноситься до матеріалу (наприклад, нуклеїнової кислоти або білку), що був штучно (неприродним чином) змінений за допомогою втручання людини. Така зміна для одержання синтетичного матеріалу може бути виконана на матеріалі поза або в межах його природного середовища або стану. Наприклад, нуклеїнова кислота, що зустрічається в природі вважається рекомбінантною нуклеїновою кислотою, якщо вона змінена, або якщо вона була транскрибована із ДНК, що була змінена за допомогою людського втручання, проведеного в межах клітини, з якої вона походить. Див., наприклад, Compounds and Methods for Site Directed Mutagenesis in Eukaryotic Cells, Kmiec, U.S. Patent № 5565350; In Vivo Homologous Sequence Targeting in Eukaryotic Cells; Zarling, et al., PCT/US93/03868. "Відновлююча лінія" відноситься до лінії, що має геном або геноми, що відновлюють чоловічу фертильність або життєздатність пилка в гібридного соняшника або інбредної лінії, що має материнську цитоплазму, що служить причиною чоловічої стерильності. Даний термін також обговорюється в літературі. Див., наприклад, Fick, "Breeding and Genetics, " in Sunflower Science and Technology 279-338 (J. F. Carter, ed., 1978), зміст якого включено в справжній опис посиланням. "Селекція" означає відбір бажаного фенотипу із широкої, генетично гетерогенної популяції, що бере участь у схрещуванні, звичайно названою популяцією. Індивідуальні рослини в межах популяції проходять селекцію на користь кращих проявів таких ознак як морфологія рослини, морфологія квітки, стійкість до комах або хвороб, зрілість і врожайність. Термін "простий повтор послідовності" або "SSR" відноситься до типу молекулярних маркерів (також відомий як мікросателіт), утворених короткими послідовностями нуклеотидів (26 основ у довжину), які повторюються в тандемі. Наприклад, динуклеотидний повтор може бути GAGAGAGA, а тринуклеотидний повтор може бути ATGATGATGATG. Вважається, що при реплікації ДНК робляться помилки, і додаткові набори цих повторюваних послідовностей вбудовуються в ланцюг. Із часом ці повторювані послідовності змінюються по довжині між одним культурним сортом рослини й іншим. Приклад алельної мінливості в SSR був би: Алель A: GAGAGAGA (4 повтори послідовності GA) і Алель B: GAGAGAGAGAGA (6 повторів послідовності GA). Такі варіації довжини можуть бути легко визначені в лабораторних умовах і дозволяють відслідковувати генотипову варіабельність у програмах схрещування. Термін "однонуклеотидний поліморфізм" або "SNP" відноситься до однонуклеотидної зміни в геномній послідовності. Це може відбутися, коли єдиний аденін, тимін, цитозин, або гуанін (представлені за допомогою A, T, C або G) змінені на кожний з інших чотирьох нуклеотидів, або коли єдиний нуклеотид вставлений або вилучений. SNP може як приводити, так і не приводити до функціональної зміни гена. Термін "трансгенна рослина" відноситься до рослини, що містить у складі свого генома гетерологічний полінуклеотид. Як правило, гетерологічний полінуклеотид стабільно інтегрується в геном таким чином, що полінуклеотид передається наступним поколінням. Гетерологічний полінуклеотид може бути впроваджений у геном лише один або в складі рекомбінантної експресуючої касети. "Трансгенний" використовується в даному описі для позначення будь-якої клітини, клітинної лінії, калюсу, тканини, частини рослини або рослини, генотип якої був змінений за допомогою наявності гетерологічної нуклеїнової кислоти, включаючи ті трансгенні організми або клітини, спочатку змінені таким методом, так само як і ті, які отримані за допомогою статевого або безстатевого розмноження початкового трансгенного організму або клітини, зберігаючи гетерологічну нуклеїнову кислоту. Термін "трансгенний" у рамках даного опису не охоплює зміни генома (хромосомного або поза хромосомного) за допомогою традиційних способів рослинництва (тобто, схрещувань) або за допомогою подій, що зустрічаються в природі, як наприклад, випадкове перехресне запилення, зараження нерекомбінантними вірусами, трансформація нерекомбінантними бактеріями, нерекомбінантна транспозиція або спонтанна мутація. "Сорт" або "культурний сорт рослини" відносяться до групи рослин у межах одного виду (наприклад, Helianthus annuus), які розділяють певні незмінні особливості, які виділяють їх з типової форми й від інших можливих сортів у межах одного виду. Польові зернові культури вирощують за допомогою методів, які використовують перевагу способів запилення рослин. Рослина є самозапилювальною, якщо пилок від однієї квітки 12 UA 104711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 переноситься до тієї ж або до іншої квітки тієї ж самої рослини або генетично ідентичної рослини. Рослина є перехреснозапилювальною, якщо пилок попадає від однієї квітки на генетично відмінну рослину. Таким чином, термін "самозапилювальний" у програмі схрещування відноситься до самозапилення, і термін " перехреснозапилювальний" відноситьсядо перехресного запилення. Соняшники мають суцвіття типу мітелки зі стерильними язичковими квітками й повноцінними (що мають тичинку і маточку) трубчастими квітками. У дикому стані соняшник був аутостерильним або самонесумісним, таким чином, він є переважно перехреснозапилювальною культурою, що у значній мірі залежить від медоносних бджіл або інших комах для запилення. Більшість областей розведення не має достатньої популяції бджіл для необхідного рівня запилення сільськогосподарської культури. Це привело до відбору селекціонерами за ознакою аутосумісності або аутофертильності, що збільшує врожайність при невеликій кількості бджіл. Популяція соняшника, яка розводиться, повинна бути по суті однорідною й відтворюватися, щоб бути корисною або подальшому розведенні або у виведенні комерційного культурного сорту. Існує кілька аналітичних методів, придатних для визначення фенотипової стабільності популяції соняшника. Самим старим і самим традиційним способом аналізу є спостереження за фенотиповими ознаками. Дані звичайно збираються в польових експериментах протягом життя рослин соняшника, які треба бути досліджувати. Найчастіше відзначають фенотипові характеристики, пов'язані із урожайністю, вмістом масла в насінні, вмістом білка в насінні, складом жирних кислот масла, вмістом глюкозинолату в борошні, формою росту, стійкістю до полягання, висотою рослин, стійкістю до опадання, і т.ін. Інші фенотипові характеристики, звичайно спостережувані, включають стійкість до хвороб або комах, і толерантність до гербіцидів. Було відзначено, що композиції й способи за даним винаходом можуть бути корисні при ідентифікації нових ліній соняшників, стійких до Orobanche cumana. Біля кореневої зони вразливого сорту Orobanche насіння проростає, утворює гаусторію на корені прихильної рослини й закінчує свій життєвий цикл одержуючи живильні речовини від рослини-хазяїна, приносячи у такий спосіб серйозну шкоду для росту рослини-хазяїна й дозрівання врожаю. Див., наприклад, Dominguez, (1996) Plant Breed. 115: 203-204; Ish-ShalomGordon, et al., (1993) Phytopathology 83: 1250-1252; Kirichenco, et al., (1987) Plant Breed. Abstr. 57:1392; Melero-Vara, et al. (2000), Helia 23: 45-56; і Sukno, et al., (1999) Crop Sci. 39: 674-678). Система 1 стійкості до Orobanche cumana приводить до нездатності насіння Orobanche заразити рослину-хазяїна в кореневій зоні стійкого сорту. Ця форма стійкості представлена в лінії соняшника U00S9LM і ATCC, номер доступу PTA-3793. На відміну від випадку системи 1 стійкості, насіння Orobanche cumana у кореневій зоні рослин соняшника, які мають ген систему 2 стійкості, проросте, проникаючи в тканину кореня хазяїна й утворюючи гаусторію. Коріння заразихи приступають до розвитку під землею. Однак, для рослин соняшника з геном системи 2 стійкості, вторгнення Orobanche призводить до того, що рослина зів'яне й помре перш, ніж з'явиться із ґрунту, нездатна закінчити свій життєвий цикл на кореневій системі стійкої рослини. Така форма стійкості представлена в лінії соняшника 8556UG і депозиті ATCC, номер доступу РОТА-3792; див., WO 2003/073837. У деяких варіантах здійснення даний винахід представляє молекулярні маркери для гена, що наділяє системою 2 стійкості до Orobanche cumana. Третій механізм сполучає механізми стійкості обох систем з одержанням більше високої стійкості. Така форма стійкості представлена в гібриді соняшника 01 UL2365 і ATCC номер доступу PTA-3791. Стійкість до заразихи посилена за допомогою об'єднання особливості системи 2 стійкості з іншими генами стійкості. У минулому селекціонери покладалися на біологічний метод при селекції стійких рослин, проводячи пошук живої заразихи в радіусі 50 см навколо кожної рослини й перевіряючи підґрунтя на предмет коріння заразихи, прикріплених до кореневої системи. Цей спосіб надзвичайно стомлюючий і може бути неточний через фактори навколишнього середовища. Молекулярний маркер, зчеплений зі стійким алелем гена стійкості системи 2, дозволив би селекціонерам набагато швидше й надійніше проводити селекцію стійких рослин у процесі схрещування. У певних варіантах здійснення даний винахід надає молекулярні маркери для системи 2 стійкості до Orobanche cumana. Раніше не було доступно жодного молекулярного маркера для ідентифікації або диференціації системи 2 стійкості до Orobanche у соняшника. Селекціонерам соняшника доводилося покладатися на польові спостереження при введенні гена системи 2 стійкості до Orobanche у свої розводимі популяції. Нові молекулярні маркери полегшують зусилля селекціонерів соняшника. Наприклад, застосування маркерів дозволяє селекціонерам: 13 UA 104711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1) Диференціювати рослини в межах сегрегуючої розводимої популяції з метою визначення тих, які мають ген системи 2 стійкості. 2) Схрестити систему 2 стійкості з елітними інбредними лініями, які раніше мали низьку або не мали стійкості до Orobanche, підвищуючи в такий спосіб розмаїтість сортів соняшника, доступних для виробників в областях, заражених Orobanche. 3) Об'єднати ген системи 2 з іншими генами стійкості, одержуючи рослини, які володіють як системою 1, так і системою 2 стійкості, і, таким чином, надають комбінацію стійкості, що перевершує як систему 1, так і систему 2 стійкості окремо. 4) Об'єднати ген системи 2 з генами, які надають інші корисні ознаки, як наприклад, стійкість до інших паразитів або хвороб, які вражають соняшник, або толерантність до гербіцидів. 5) Створювати нові комерційні продукти, які можуть бути використані для виснаження існуючих банків насінь Orobanche у ґрунтовому профілі й обмеження утворення нових відкладень насінь Orobanche у системі землеробства. 6) Ідентифікувати області і/або кластери генів у геномі соняшника, які наділяють соняшник стійкістю до Orobanche і клонувати корисні гени із цих локусів для подальшого розвитку маркерів або створення нових конструкцій для трансгеноза, які можуть бути використані для одержання трансгенного соняшника зі стійкістю до Orobanche. Композиції й способи за даним винаходом можуть допомогти у відтвореному створенні ліній соняшника, які мають властивість стійкості до Orobanche у контексті відповідного фенотипового фону, що має одну або декілька бажаних властивостей, як наприклад, висока врожайність насіння, рання зрілість, стійкість до посухи, холодостійкість, відповідний вміст білка в насінні й профілю амінокислот, карликовість, стійкість до полягання, стійкість до комах або хвороб, викликаним бактеріями, грибами або вірусами, і толерантність до обробки гербіцидами. Одержання гібридів соняшника Насіння гібридного соняшника, як правило, одержують за допомогою системи чоловічої стерильності, прибігаючи до інбредних рослин з генетичною або цитоплазматичною чоловічою стерильністю (ЦЧС). Інбредні ЦЧС-рослини характеризуються чоловічою стерильністю в результаті факторів, що відбуваються із цитоплазми, на противагу ядру, геному. Таким чином, ця особливість успадковується винятково від батьківської жіночої особини, оскільки тільки жіноча батьківська рослина надає цитоплазму заплідненому насінню. ЦЧС можна одержати із широко розповсюджених ліній соняшника, відомих у даній галузі техніки, і привселюдно доступної, як наприклад, CMS HA89 (USDA). Джерелом CMS HA89 є матеріал Leclercq, "Cytoplasmic Sterility in the Sunflower, " (1969) Ann. Amelior Plant 19: 99-106. Рослини з ЦЧС запліднюють пилком від іншої рослини, що не є чоловічо-стерильним. Пилок від другої рослини може або, можливо, не вносить гени, які роблять чоловічі рослини потомства фертильними. Лінії із цитоплазматичною чоловічою стерильністю традиційно одержують методом зворотного схрещування, у якому бажані лінії, які пройшли інбридинг і селекцію в декількох поколіннях, спочатку схрещують із рослиною із цитоплазматичною чоловічою стерильністю. Після того бажана інбредна лінія використовується як поворотного(возвратного) батька в процедурі зворотного схрещування. Підсумкове потомство буде генетично подібно поворотному батькові за винятком того, що воно буде мати чоловічу стерильність. Лінії, що відновлюють фертильність, можуть бути отримані при зворотному схрещуванні для переносу домінантного відновлюючого гена до встановленої інбредної лінії з нормальною цитоплазмою. При використанні даного методу рослини, що пройшли селекцію, повинні бути схрещені з лінією із цитоплазматичною чоловічою стерильністю після кожної генерації для визначення, чи присутні гени, що відновлюють фертильність. Більш розповсюдженою процедурою є самозапилення й селекція чоловічих фертильних рослин від комерційних гібридів або запланованих схрещувань батьків, що мають гени, що відновлюють чоловічу цитоплазматичну стерильність. Цей метод не вимагає аналітичного схрещування із чоловічою стерильною лінією при проведенні селекції, оскільки рослини будуть повністю фертильні, якщо присутні необхідні відновлюючи гени. Підходяща ЦЧС відновлююча лінія може бути отримана за допомогою схрещування з кожною із широко доступних відновлюючих ліній, як наприклад, RHA274, RHA271 і RHA273 (USDA), або іншими лініями, що володіють генами для відновлення чоловічої фертильності. Лінії й сорти, отримані таким чином, які виробляють насіння, що володіють стійкістю до заразихи і які є чистосортними щонайменше відносно генів відновлюючих фертильність, можуть бути потім ізольовані за допомогою безперервного самозапилення й схрещені з раніше описаними ЦЧС лініями, стійкими до заразихи. Одержання інбредної лінії соняшника 14 UA 104711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Використання інбредних ліній із чоловічою стерильністю є всього лише одним фактором при одержанні гібридів соняшника. Для одержання гібридів соняшника, як правило, потрібно одержання гомозиготних інбредних ліній, схрещування цих ліній, і оцінка потомства. Методи племінного розмноження й розмноження з рекурентною селекцією використовуються для одержання інбредних ліній з популяцій, що розмножуються. Програми розведення поєднують генетичні фонди від двох або декількох інбредних ліній або інших різних універсальних джерел популяцій, що схрещуються, від яких нові інбредні лінії одержують за допомогою самозапилення й селекції бажаних фенотипів. Нові інбредні лінії схрещують із іншими інбредними лініями, і гібриди від цих схрещувань оцінюють на предмет комерційного потенціалу. Чистосортне розведення звичайно використовується для вдосконалення зернових культур. Чистосортне розведення починається зі схрещування двох генотипів, кожний з яких може володіти одним або декількома бажаними ознаками, яких бракує в іншому, або які служать доповненням іншим. Якщо два вихідних батьки не надають всі бажані ознаки, у схему схрещування можуть бути включені додаткові батьки. Цих батьків схрещують за простою або складною схемою для одержання F1. Популяцію F2 одержують у результаті самозапилення одного або декількох F1 або шляхом схрещування двох F1 (тобто, близько родинне схрещування). Селекція найкращої особини може початися в популяції F2. Починаючись із F3, проводять селекцію найкращих родин, і найкращої особини в межах найкращих родин. Повторне тестування родин (ліній) може бути почате в поколінні F4 для підвищення ефективності селекції на користь ознак з низькою спадковістю. На пізній стадії інбридингу (тобто, F6 і F7), найкращі лінії або суміші фенотипово подібних ліній звичайно перевіряють на потенційний перехід до нового сорту. Поліпшені сорти можуть також бути отримані в результаті рекурентної селекції. Генетично варіабельну популяцію гетерозиготних особин або визначають або одержують, схрещуючи кілька різних батьків. Найкращі рослини відбирають, ґрунтуючись на індивідуальних перевагах, винятковості потомства і/або чудової схрещуваності. Відібрані рослини схрещують між собою для одержання нової популяції, з якої продовжують проводити наступні цикли селекції. Ціль комерційних програм виведення гібрида соняшника полягає в тому, щоб одержати нові інбредні лінії, які поєднують властивості виробляти гібриди з високою врожайністю й чудовими агрономічними властивостями. У першу чергу селекціонери звертають увагу на врожайність. Однак багато інших основних агрономічних властивостей мають високе значення в комбінаціях гібридів і впливають на врожай або інакше забезпечують чудові властивості в комбінації гібридів. Основні цілі при селекції соняшника включають поліпшену врожайність насіння, поліпшену маслянистість насіння або якість олії, ранню зрілість, більш низьку висоту, однорідність типу рослини й стійкість до комах або хвороб. Крім того, лінії по суті переважно мають прийнятні показники як батьківські властивості, як наприклад, урожайність насіння й виробництво пилка, кожний з яких впливає на здатність надавати батьківські лінії в достатній кількості і якості для схрещування. Було показано, що ці ознаки перебувають під генетичним контролем і багато, якщо не всі властивості, визначаються декількома генами. За допомогою методів схрещування поліпшена стійкість до Orobanche cumana може бути сполучена або "укомплектована" з будь-якою іншою бажаною властивістю насіння, агрономічною, або стійкістю до комах або хвороби. Приклади інших бажаних ознак включають, але не обмежені, змінений профіль масел насіння або вміст, високий урожай насіння, більш рання зрілість, посухостійкість, холодостійкість, підвищений вміст білка в насінні, змінений профіль вмісту амінокислот у насіннях, карликовість, стійкість до полягання, стійкість до комах або хвороб, викликаних бактеріями, грибами або вірусами, або толерантність до обробки гербіцидами. Способи за даним винаходом знаходять конкретне застосування в програмах селекції ліній соняшника, стійких до гербіциду на основі сульфонілсечовини. Було встановлено, що гербіциди на основі сульфонілсечовини є ефективними проти паразитних бур'янів соняшника, як наприклад, повитиця й різновидів Orobanche (L. Garcia-Torres, et al., (1994) Weed Research 34: 395-402). Регенерація рослин Даний винахід також відноситься до частин рослин, розкритим у даному описі, включаючи рослинні клітини, протопласти рослин, клітинні тканині культури рослин, з яких можуть бути регенеровані рослини соняшника, калюси рослин, пагони рослин, і клітини рослин, які збережені в рослинах або частинах рослин, як наприклад, ембріони, пилок, яйцеклітини, квіти, листи, шкірочки, стебла, коріння, кінчики корінь, пильовики, насіння й макуха, і т.п. 15 UA 104711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Рослини, отримані відповідно до даного винаходу, можуть бути регенеровані із частин рослини, використовуючи відомі методики. Наприклад, насіння з рослин за даним винаходом можуть бути щеплені відповідно до звичайної процедури вирощування соняшника. Такі рослини вироблять додаткові насіння. Рослини соняшника можуть також бути регенеровані, використовуючи культуру тканини й регенерацію. Культура різних клітин і тканин соняшника й регенерація рослин з них відомі кваліфікованим фахівцям у даній галузі техніки. Наприклад, вирощування соняшника за допомогою культури тканини описано в наступних посиланнях: Henderson, et al, (1952) "The culture of normal sunflower stem callus.", Am. J. Bot. 39: 444-451; Levine, M., (1951) "Response of fibrous roots of sunflower and tobacco tissue cultures to plant growth substances", Bot. Gaz. 112: 281-289; Henrickson, CE., (1954) "The flowering of sunflower explants in aseptic culture", Plant Physiol. 29: 536-538; і Sadhu, M. K., (1974) "Effect of different auxins on growth and differentiation in callus tissue from sunflower stem pith", Indian J. Exp. Biol. 12: 110-111. Рослинне масло і їжа Насіння рослин за даним винаходом може використовуватися для одержання рослинного масла і їжі. Насіння цих сортів, рослина, отримана з такого насіння, гібридна рослина соняшника, отримана після схрещування цих сортів з іншими сортами, одержуване насіння від такого гібрида, і різні частини гібридної рослини соняшника, можуть бути використані для одержання їстівного рослинного масла або інших продовольчих продуктів відповідно до відомих методів. Одиниці, префікси й символи використані за правилами, прийнятим у Міжнародній Системі Одиниць (СІ). Якщо не зазначено інакше, нуклеїнові кислоти написані до орієнтації ліворуч праворуч від 5' до 3'; амінокислотні послідовності написані ліворуч праворуч в орієнтації від амінокислотного кінця до карбоксильного. Числові діапазони, наведені в даному описі, включають числа, що обмежують діапазон, і включають кожне ціле число в межах певного діапазону. Нуклеотиди можуть бути згадані тут за допомогою їхніх однобуквених символів, що рекомендуються комісією з номенклатури IUPAC-IUBMB. Терміни, визначені в даному описі, більш повно розкриті в посиланнях до даного опису в його повноті. Заголовки розділів, надані на всьому протязі опису, надані для зручності й не обмежені різними предметами й варіантами здійснення за даним винаходом. Надані далі Приклади представлені як певні ілюстрації до заявленого винаходу. Варто мати на увазі, однак, що даний винахід не обмежений певними подробицями, сформульованими в Прикладах. Приклади Приклад 1: Скринінг у полі Скринінг нового джерела для селекції зародкової плазми й інбредних ліній зі стійкістю до заразихи проводився протягом декількох років у літньому розпліднику в Ahmetbey, LuleburgazKirklarli, Туреччина. Розплідник був штучно заражений насінням нових видів O.cumana. Зараження ґрунту розплідника повторювали щороку. Скринінг проводили шляхом висаджування 15 рослин в 4-метровий по довжині ряд для кожної селекції перехресної зародкової плазми й інбредних ліній. Стійкість до заразихи оцінювали безпосередньо перед збором урожаю за допомогою видалення рослини із землі й підрахунку числа рослин соняшника з мертвими пагонами заразихи, прикріпленими до кореневої системи соняшника під поверхнею ґрунту. Рослини із системою 2 стійкості, які знаходили, мали мертві первинні пагони заразихи, прикріплені до їхніх кореневих систем під землею. Сприйнятливі до заразихи лінії були заражені пагонами заразихи, які з'явилися над землею. Сприйнятливі рослини характеризувалися різним ступенем інтенсивності атаки заразихи. Приклад 2: Молекулярне картування QTL, що наділяє системою 2 стійкості до заразихи Одним підходом до визначення, які алелі відіграють роль у фенотиповій ознаці, є порівняння штамів рослин з високо дивергентними фенотипами за зацікавленою ознакою. Розподіл алелей для всієї бази даних маркерів були проаналізовані для двох фенотипових груп. Наприклад, тест "Intergroup Allele Distribution" можна провести, використовуючи GeneFlow ™ програмне забезпечення версії 7.0 (GENEFLOW, Inc, Олександрія, Вірджинія). Міжгруповий аналіз алельної частоти надає спосіб для знаходження невипадкових розподілів алелей між двома фенотиповими групами. Під час аналізу була складена таблиця статистичної структури досліджуваної популяції з алельними частотами, і на основі її були обчислені статистична величина G і ймовірність (статистичну величину G скорегували за допомогою використання виправлень William). Значення ймовірності було скоректовано таким чином, щоб ураховувати той факт, що були проведені багаторазові тести (таким чином, є деяка очікувана ймовірність помилковопозитивних значень). Скорегована ймовірність пропорційна ймовірності того, що 16 UA 104711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 спостережувані розходження в розподілі алелей між двома даними класами відбулися випадково. Чим нижче значення ймовірності, тим більше значима асоціація між генотипом маркера в тому локусі й фенотипом, що цікавить, у цьому випадку фенотип стійкості до Orobanche. Більш повне обговорення одержання значень ймовірностей можна знайти в документації до програмного забезпечення GeneFlow™ версії 7.0. См. також, Sokal and Rolf (1981), Biometry: The Principles and Practices of Statistics in Biological Research, 2nd ed., San Francisco, W. H. Freeman and Co. У даному аналізі скореговані ймовірності менш чим 0,05 уважають значимими (маркер і фенотип показують нерівноважне зчеплення), і скореговані ймовірності менш, ніж приблизно 0.01 вважають високо значимими. Класи алелей, представлені менш, ніж мінімальним значенням спостережень в обох групах, не включені в статистичний аналіз. Основна логіка полягає в тому, що маркери з вірогідно різними розподілами алелей між стійкими й сприйнятливими групами могли б бути пов'язані з ознакою, і можуть бути використані для їхнього розрізнення. За допомогою даного методу проводили аналіз одного маркерного локусу за один раз і визначали, чи був розподіл алеля в межах стійкої групи вірогідно відмінним від розподілу алеля в межах сприйнятливої групи. Статистично різний розподіл алелей є вказівкою на те, що маркер зчеплений з локусом, що пов'язаний зі стійкістю до Orobanche. Щоб ідентифікувати генетичні маркерні локуси соняшника, пов'язані зі стійкістю до Orobanche, картована популяція 182 F2:3 ліній соняшника була отримана при схрещуванні U0151LG (стійкий батько) X E0005LG (сприйнятливий батько). Стійкість або сприйнятливість батьківських ліній були визначені раніше. Геномна ДНК була ізольована від батька й рослин потомства й проаналізована в реакціях ПЦР, використовуючи публічно доступні праймери для ампліфікації, специфічні для великої кількості SSR маркерів, які всі разом покривали всі хромосоми в геномі соняшника. Потомство й батьківські рослини також оцінювали по стійкості до Orobanche у польових умовах. У результаті даного аналізу передбачуваний локус системи 2 стійкості до заразихи раси H був картирований із групою зчеплення 4 (LG-04) на загальнодоступній консенсусній карті соняшника, приблизно в 3 см від SSR HT 0664-СА (Wills, D. M. and Burke, J. M. (2007) Genetics 176: 2589-2599). Див. Фіг. 1. Для заповнення області більшою кількістю маркерів зі стандартної карти зчеплення для соняшника (Yu, J., et al., (2003) Crop Science 43: 367-387; Gentzbittel, L., et al., (1999) Theor. Appl Gen 99: 218-234), два SNP маркери були ідентифіковані як потенційні маркери, що представляють інтерес, , HT0183 і HT090 (Theor. Appl.Gen. 11: 1532-1544; Perez-Vich, B. (2004) Theor. Appl Gen. 109: 92-102). Див. фіг. 2. Праймери (SEQ ID NO: 5 і 6), були розроблені таким чином, щоб ампліфікувати фрагмент приблизно 278 пар основ, і ПЦР проводили як із двома батьківськими лініями, U0151 LG і E0005LG, так само як і з U01P6LM і четвертою лінією. Продукт ПЦР ампліфікували для кожної із чотирьох ліній, використовуючи пару праймерів HT 183-F1/HT 183-R1. Отримані послідовності даних чотирьох смуг свідчать про те, що є три потенційно справжніх SNP маркерних локусів. Ці три SNP відзначені зірочками у вирівнюванні, наданому на Фіг. 3. Аналіз TAQMAN® (Roche Molecular Systems, Inc) був потім розроблений і застосований для виявлення SNP HT183, використовуючи праймери SEQ ID NO: 3 і 4. Асоціація SNP HT183 зі стійкістю до BRSII була затверджена, використовуючи зразки виведених ліній з відомими фенотипами стійкості до хвороби. Результат генотипування погоджувався з польовими спостереженнями в 98,2 % зразків (N=167). HT183 SNP локус був нанесений на карту на відстані 1 см від раніше ідентифікованого локусу QTL стійкості до Orobanche у групі зчеплення 4. 167 особин потомства були відібрані з п'яти популяцій, представлених на Фіг. 4. 17 UA 104711 C2 18 UA 104711 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 1. Спосіб ідентифікації рослини соняшника або зародкової плазми соняшника, що має фенотип системи II стійкості до Orobanche, що включає виявлення в рослині соняшника або зародковій плазмі соняшника щонайменше одного поліморфізму маркерного локусу, що асоційований із зазначеним фенотипом, де маркерний локус представлений послідовністю SEQ ID NO:2, або має частоту рекомбінації менш ніж 10 % щодо маркерного локусу SEQ ID NO:2. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що виявлення включає ампліфікацію маркерного локусу або частини маркерного локусу й детекцію отриманого ампліфікованого амплікона маркера. 3. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що ампліфікація включає: 19 UA 104711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 a) змішування праймерів для ампліфікації або пари праймерів для ампліфікації з нуклеїновою кислотою, ізольованою від рослини соняшника або зародкової плазми, причому праймер або пари праймерів є комплементарними або частково комплементарними до щонайменше частини маркерного локусу і здатні до ініціації полімеризації ДНК за допомогою ДНК-полімерази, використовуючи нуклеїнову кислоту соняшника як матрицю; і b) подовження праймера або пари праймерів у реакції полімеризації ДНК, що містить ДНКполімеразу й матричну нуклеїнову кислоту, для одержання щонайменше одного амплікона. 4. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що праймер або пари праймерів вибрані із групи, що складає з SEQ ID NO:3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 і 10. 5. Рослина або зародкова плазма, ідентифіковані способом за п. 1, яка відрізняється тим, що вказана рослина соняшника або зародкова плазма соняшника мають фенотип системи II стійкості до Orobanche і включають в своєму геномі щонайменше один поліморфізм маркерного локусу, що асоційований із зазначеним фенотипом, де маркерний локус представлений послідовністю SEQ ID NO:2, або має частоту рекомбінації менш ніж 10 щодо маркерного локусу SEQ ID NO:2. 6. Спосіб селекції, який відрізняється тим, що включає схрещування рослини соняшника або зародкової плазми за п. 5 із другою рослиною соняшника або зародковою плазмою, який включає: (а) одну або кілька стадій зворотного схрещування, самозапилення, випадкового схрещування і селекції рослин; і (b) стадію аналізу молекулярних маркерів для зразків ДНК, виділених від одної або більше рослин, отриманих при здійсненні даного способу, причому зазначений аналіз ідентифікує рослину, що містить щонайменше один поліморфізм SEQ ID NO:2, асоційований зі стійкістю до Orobanche. 7. Спосіб за п. 6, який відрізняється тим, що зазначена ідентифікована рослина проявляє підвищену стійкість до Orobanche у порівнянні із другою рослиною соняшника або зародковою плазмою. 8. Спосіб за п. 7, який відрізняється тим, що рослина, отримана за ним, має фенотип системи II стійкості до Orobanche і включає в своєму геномі щонайменше один поліморфізм маркерного локусу, що асоційований із зазначеним фенотипом, де маркерний локус представлений послідовністю SEQ ID NO:2, або має частоту рекомбінації менш ніж 10 щодо маркерного локусу SEQ ID NO:2. 9. Рослина, що отримується способом, який включає: (і) ідентифікацію способом за п. 1 формули першої рослини соняшника або зародкової плазми соняшника, що мають фенотип системи II стійкості до Orobanche і включають маркерний локус, як визначено в п. 1 формули; і (іі) схрещування ідентифікованої рослини соняшника або зародкової плазми соняшника з другою рослиною соняшника або зародковою плазмою, що виявляє меншу стійкість до Orobanche, аніж рослина за (і); і необов’язково додатково включає (ііі) одну або кілька стадій зворотного схрещування, самозапилення, випадкового схрещування, і селекції рослин, і необов’язково додатково стадію аналізу молекулярних маркерів зразків ДНК, виділених від одної або більше рослин, отриманих при здійсненні даного способу, причому зазначений аналіз ідентифікує рослину, що містить щонайменше один поліморфізм SEQ ID NO:2, асоційований зі стійкістю до Orobanche; де вказана рослина виявляє підвищену стійкість до Orobanche у порівнянні із другою рослиною соняшника або зародковою плазмою, визначеною в частині (іі) та включає маркерний локус, визначений в п. 1 формули. 10. Рослина за п. 8 або 9, яка відрізняється тим, що додатково містить систему I стійкості до Orobanche. 11. Рослина за п. 8 або 9, яка відрізняється тим, що додатково містить щонайменше один ген, уведений за допомогою інтрогресії або трансформації. 12. Рослина за п. 11, яка відрізняється тим, що зазначений уведений ген забезпечує стійкість до комах, толерантність до гербіцидів, стійкість до хвороби або толерантність до абіотичного стресу. 13. Спосіб ідентифікації нуклеїнової кислоти як індикатор системи 2 стійкості до Orobanche у соняшнику що включає взаємодію нуклеїнової кислоти соняшника з молекулярним маркером, вибраним із групи, що складається з SEQ ID NO:1 або 2. 14. Виділений і очищений генетичний маркер, пов'язаний із системою 2 стійкості до Orobanche і картирований до групи зчеплення 4 Helianthus annuus, де маркер містить нуклеотидну 20 UA 104711 C2 5 10 15 послідовність SEQ ID NO:2, або варіант, що містить щонайменше один з поліморфізмів SEQ ID NO:2 відносно SEQ ID NO:1. 15. Застосування маркера за п. 14 для одержання додаткових маркерів стійкості до Orobanche. 16. Спосіб зниження існуючого насінного фонду Orobanche у ґрунтовому профілі, що включає вирощування рослини, що містить алель системи 2 стійкості SEQ ID NO:2, або похідний алель, що містить щонайменше один поліморфізм, ідентифікований у даному описі відносно SEQ ID NO:1. 17. Спосіб ідентифікації генів або кластерів генів у геномі соняшника, що забезпечують стійкість до Orobanche, що включає ампліфікацію хромосомної ділянки, ідентифікованої за допомогою гібридизації із праймером, вибраним із групи, що складається з SEQ ID NO:3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10. 18. Спосіб за п. 17, що додатково включає послідовні раунди скринінга й ізоляції клонів для складання контига, що містить відкриту рамку зчитування. 19. Спосіб по п. 17, який відрізняється тим, що включає застосування гена або кластерів генів для одержання трансгенних соняшників з поліпшеною стійкістю до Orobanche. 21 UA 104711 C2 22 UA 104711 C2 23 UA 104711 C2 24 UA 104711 C2 25 UA 104711 C2 26 UA 104711 C2 27 UA 104711 C2 Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 28
ДивитисяДодаткова інформація
Автори російськоюEl Sayed, Sadik, Hoeft, Eric, Li, Zenglu, Tulsieram, Lomas
МПК / Мітки
МПК: A01H 5/00, C12N 15/82, A01H 1/00
Мітки: маркери, соняшника, пов'язані, стійкості, генетичні, orobanche, системою
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/30-104711-genetichni-markeri-povyazani-iz-sistemoyu-2-stijjkosti-do-orobanche-u-sonyashnika.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Генетичні маркери, пов`язані із системою 2 стійкості до orobanche у соняшника</a>
Спосіб прискореного визначення стійкості зразків соняшнику до вовчка (orobanche cumana wallr.)
Номер патенту: 79519
Опубліковано: 25.04.2013
Автори: Чигрин Тамара Володимирівна, Задорожна Ольга Анатоліївна
МПК: A01H 1/04
Мітки: соняшнику, спосіб, стійкості, orobanche, вовчка, визначення, wallr, cumana, зразків, прискореного
Формула / Реферат:
Спосіб прискореного визначення стійкості зразків соняшнику до вовчка (Orobanche cumana Wallr.), що включає отримання проростків соняшнику та визначення стійкості до вовчка, який відрізняється тим, що диференціація стійких та сприйнятливих зразків здійснюється на 13-16-денних проростках за активністю ферменту каталази.
Генетичні маркери високого вмісту олеїнової кислоти у рослин
Номер патенту: 97642
Опубліковано: 12.03.2012
Автори: Брежон Мішель, Ренар Мішель, Люка Марі Оділь, Фалентен Сіріль
МПК: C12N 15/82, C12N 15/53, C12N 9/02, A01H 5/00, C07K 16/40
Мітки: генетичні, вмісту, маркери, рослин, високого, олеїнової, кислоти
Формула / Реферат:
1. Мутована послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує фермент дельта-12-фосфатидилхоліндесатуразу (FAD2) з рослини Cruciferae, причому дана мутована послідовність має неконсервативну мутацію щонайменше одного нуклеотиду щонайменше одного кодону, який представляє амінокислоту, вибрану з групи, яку складають:амінокислота у положенні 259 амінокислотної послідовності згаданого FAD2, коли послідовність FAD2 складається з 384 амінокислот,...
Спосіб вибірного застосування гербіциду імазетапіру для боротьби з бур’янистою рослиною-паразитом orobanche cernua loefl./o. cumana waller при оброблянні соняшників
Номер патенту: 67786
Опубліковано: 15.07.2004
Автори: Родрігес Огеда Ma Ізабель, Саллаго Бернал Франсіско Хосе, Алонсо Арнедо Луіс Карлос, Фернандес Ескобар Хуан, Лопез Рюіз-Калеро Герман, Рефьо Піріс Антоніо
МПК: A01P 13/02, A01N 43/50
Мітки: боротьби, імазетапіру, cernua, бур'янистою, оброблянні, спосіб, застосування, вибірного, гербіциду, waller, cumana, рослиною-паразитом, соняшників, orobanche
Формула / Реферат:
1. Спосіб вибірного застосування гербіциду імазетапіру для боротьби з бур'янистою рослиною-паразитом заразихою (Orobanche cernua Loefl./O. cumana Waller) на вирощуваному сорті соняшника, стійкому або толерантному до гербіциду, де гербіцид застосовують після появи сходів культурного соняшника шляхом разового або двократного застосування розчину гербіциду...
Спосіб ідентифікації стійких до вовчка генотипів соняшника
Номер патенту: 10339
Опубліковано: 15.11.2005
Автори: Сиволап Юрій Михайлович, Солоденко Анжелла Євгенівна
МПК: A01H 1/04
Мітки: ідентифікації, стійких, генотипів, соняшника, вовчка, спосіб
Формула / Реферат:
Спосіб ідентифікації стійких до вовчка генотипів соняшника, що включає оцінку стійкості інбредних ліній і гібридів соняшника до "молдавської" раси вовчка, який відрізняється тим, що спосіб здійснюють за допомогою електрофорезу в 10 % поліакриламідному гелі продуктів ампліфікації ДНК локусу генома соняшника RTS 29 та ідентифікації аналізованого генотипу як стійкого до вовчка при наявності в спектрі ДНК алеля з молекулярною вагою...
Спосіб підвищення гетерозису гібридного насіння соняшника на ділянках гібридизації та вирощених з нього урожаїв
Номер патенту: 54320
Опубліковано: 10.11.2010
Автори: Анішин Леонід Андрійович, Пономаренко Сергій Платонович
МПК: A01C 21/00
Мітки: насіння, ділянках, соняшника, гібридизації, гібридного, спосіб, гетерозису, нього, підвищення, вирощених, урожаїв
Формула / Реферат:
Спосіб підвищення гетерозису гібридного насіння соняшника на ділянках гібридизації та вирощених з нього урожаїв, що включає підбір насіння відповідних батьківських і материнських форм, оптимальне співвідношення між рядками рослин цих форм, дотримання норм просторової ізоляції між ділянками гібридизації та іншими посівами соняшника, роздільне збирання урожаю з рядків материнської і батьківської форм, який відрізняється тим, що включає...
Попередній патент: Навантажувальна машина
Наступний патент: Спосіб обробки бананів
Випадковий патент: Пристрій для транспортування і очистки коренебульбоплодів