Спосіб одержання prrsv у комерційному масштабі

Реферат: Винахід належить до способу одержання в комерційному масштабі вірусу репродуктивнореспіраторного синдрому свиней (PRRSV), який полягає в тому, що: а) паралельно засівають в біореактор середовище для великомасштабного культивування лінії клітин ссавців, пермісивних до зараження PRRSV, і заражають клітини ссавців PRRSV; б) розмножують вірус протягом 5-7 днів після зараження; в) здійснюють першу стадію збору шляхом видалення середовища з біореактора і виділення з нього одержаного в результаті розмноження вірусу; г) поповнюють середовище в біореакторі і розмножують вірус протягом 1-4 днів; д) здійснюють другу стадію збору шляхом видалення середовища з біореактора і виділення з неї одержаного в результаті розмноження вірусу; є) поповнюють середовище в біореакторі і розмножують вірус протягом 1-4 днів; і ж) здійснюють третю стадію збору шляхом видалення середовища з біореактора і виділення з неї одержаного в результаті розмноження вірусу. UA 112860 C2 (12) UA 112860 C2 UA 112860 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід належить до одержання в комерційному масштабі живого ослабленого вірусу репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (PRRSV), який можна застосовувати для виробництва вакцин на його основі і використовувати їх для лікування свиней. Передумови створення винаходу Репродуктивно-респіраторний синдром свиней (PRRS) розглядається багатьма фахівцями як найбільш важливе захворювання, яке в даний час завдає шкоди свинарству в усьому світі. Синдром був описаний вперше в 1987 р. в Сполучених Штатах як "загадкова хвороба свиней" і він швидко поширився по всьому світу. Цей синдром викликає значні репродуктивні втрати, він асоційований з підвищеним рівнем смертності від вторинних інфекцій і пов'язаний зі зниженням конверсії корму та середнього добового приросту маси. На жаль, виявилося, що здійснення контролю вірусу, що викликає PRRS, є важким. Вірус PRRS (PRRSV) являє собою покритий оболонкою одноланцюговий РНК-овий вірус, який згідно з класифікацією належить до сімейства Arteriviridae (Cavanaugh, 1997). Він викликає широко поширене захворювання свиней, яке було вперше описано в США в 1987 р. як "загадкова хвороба свиней" (Hill, 1990). Хвороба проявляється у формі респіраторного захворювання у всіх вікових групах свиней, приводячи до загибелі деяких більш молодих свиней і до серйозних проблем, пов'язаних з репродуктивною здатністю у самок случного віку. Передача PRRSV може відбуватися і часто відбувається шляхом безпосереднього контакту між інфікованими і сприйнятливими свинями. Перенесення вірусу може відбуватися також по повітрю на дуже короткі відстані або разом зі спермою. Після зараження вірус може зберігатися в крові дорослих тварин протягом приблизно двох тижнів, а в організмі заражених молодих свиней протягом одного-двох місяців або більше. Заражені кнури можуть передавати вірус зі спермою протягом більш ніж 100 днів. Такий тривалий період віремії значно підвищує можливість трансмісії захворювання. Крім того, вірус PRRS може проникати через плаценту протягом останньої третини періоду вагітності, заражаючи поросят в матці і приводячи до народження мертвих або ослаблених поросят. Вірус PRRS може заражати стада всіх типів і розмірів, включаючи стада, що характеризуються високим або звичайним статусом здоров'я, а також утримуються в закритих приміщеннях або на відкритому повітрі. У заражених стадах можуть мати місце значні втрати репродуктивності, а також підвищені рівні поствід'ємної пневмонії, що супроводжується слабким зростанням. Репродуктивна фаза, як правило, триває протягом двох-трьох місяців; однак проблеми в поствід'ємний період часто набувають ендемічний характер. Репродуктивне захворювання характеризується спалахом викиднів, що вражає як свиноматок, так і підсвинок на останньому триместрі вагітності. Мають місце передчасні опороси в період приблизно з 109 по 112 день вагітності. Зростає кількість мертвонароджених плодів і випадків народження ослаблених поросят, що призводить до значного збільшення смертності в передвід'ємний період. Традиційно респіраторна фаза спостерігалася в розплідниках, насамперед у розплідниках з безперервно-потокової системою виробництва. Однак респіраторні проблеми, викликані вірусом PRRS, можуть виявлятися також у свиней на завершальному періоді відгодівлі у формі компонента респіраторного симптомо-комплексу свиней (PRDC). Може мати місце зниження швидкості росту, збільшення відсотка нетоварних свиней і підвищення поствід'ємної смертності. Результати діагностичних досліджень свідчать про високі рівнях пневмонії, асоційованої з вірусом PRRS а також з широким розмаїттям інших мікроорганізмів, які зазвичай виступають у ролі вторинних збудників інфекції. Бактеріальні ізоляти можуть включати серед іншого Streptococcus suis, Haemophilus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Mycoplasma hyopneumoniae і Pasteurella multocida. Зазвичай виявленими в цьому випадку вірусними агентами є вірус свинячого грипу і респіраторний коронавірус свиней. Уражені свині рідко дають відповідь на застосовувані у високих дозах лікарські засоби і захворювання не вдається контролювати за допомогою систем одночасного заповнення приміщення тваринами і одночасного їх видалення. Вірус PRRSV існує у вигляді двох генотипів, позначених як "US-тип" - і "EU-тип", що характеризуються приблизно 50 %-ною гомологією послідовностей (Dea S. та ін, Arch Virol 145, 2000, сс. 659-688). Ці два генотипу можна розрізняти також по їх імунологічних властивостях. Найбільший обсяг інформації при секвенуванні різних ізолятів отримують на основі структурних білків, а саме, оболонкового білка GP5, на частку якого припадає лише приблизно 4 % вірусного генома, в той час як про неструктурні білки (nsp) є дуже мало відомостей. Виділення PRRSV та одержання вакцин описано в численних публікаціях (WO 92/21375, WO 93/06211, WO93/03760, WO 93/07898, WO 96/36356, EP 0 676 467, EP 0 732 340, EP 0 835 930). 1 UA 112860 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вакцинація являє собою метод зниження пов'язаного з PRRS навантаження який має вирішальне значення, оскільки у свиней, які одужали після PRRS-інфекції, повинна розвинутися імунна відповідь, яка в звичайних умовах має захищати їх від повторного зараження тим же штамом вірусу. Проте вірус PRRS має здатність змінюватися з високою швидкістю в результаті мутації, яка часто має місце в РНК-ових одноланцюгових з позитивною полярністю вірусах; і, отже, можуть виникати нові вірусні штами. У таких випадках може не мати місце перехресний захист від різних штамів і на фермах, які були інфіковані раніше, можуть відбуватися нові спалахи захворювання. Таким чином, все ще існує необхідність у розробці додаткових вакцин. Найбільш часто вживаний метод одержання ослабленої вакцини з живим вірусом полягає у здійсненні серійного пересіву вірусу в субстрат (як правило, представляє собою клітинну культуру з клітинною лінією, пермісивною для вірусу (сприйнятливі до вірусу клітини, здатні забезпечувати його репродукцію)), відмінний від виявленого в природних умовах господаря (S), до тих пір, поки не відбудеться достатнє ослаблення вірусу (тобто зниження вірулентності або здатності викликати хворобу) для того, щоб його можна було застосовувати в якості вакцини. Під час першого пасажу клітинну культури заражають відібраних інокулятом. Після одержання чіткого доказу реплікації вірусу (наприклад, шляхом оцінки індукованого вірусом цитопатичної дії [ЦПД] в інфікованих клітинах), аліквоту середовища для культури клітин або заражених клітин, або і те, й інше використовують для зараження другої культури клітин. Процес повторюють до виникнення однієї або декількох мутацій, які мають вирішальне значення у вірусному геномі, які викликають достатнє ослаблення, в результаті чого застосування вірусу у вакцині може ставати безпечним. Ступінь ослаблення, як правило, визначають емпірично, оцінюючи вплив на господаря, який зустрічається в природних умовах (S) вірусу, одержаного після постійно зростаючої кількості пасажів. Описана вище процедура має фундаментальне значення і її з успіхом застосовували для розробки численних вакцин для людини і для застосування у ветеринарії. Однак при переході до виробництва в промисловому масштабі залишається потреба в розробці ефективного і економічного методу одержання PRRSV. Короткий виклад суті винаходу Даний винахід належить до нового способу одержання живого вірусу PRRS, призначеного для застосування при одержанні зазначених вакцин. Способи, представлені в даному описі, можна застосовувати для великомасштабного одержання будь-якого вірусу PRRS, включаючи (але, не обмежуючись лише ними) штам PRRSV 94881, де штам PRRSV 94881 депонований відповідно до Будапештського договору в Європейській колекції клітинних культур (ECACC) під реєстраційними номерами ECACC 11012501 і ECACC 11012502, кожен 25 січня 2011 р., чи будь-яке потомство або покоління будь-якого із зазначених вище штамів. Більш конкретно даний винахід належить до способу одержання в комерційному масштабі вірусу репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (PRRSV), що полягає в тому, що: a) паралельно засівають в біореакторі середовище для великомасштабного культивування лінією клітин ссавців, пермісивних до зараження PRRSV, і заражають клітини ссавців PRRSV, б) розмножують вірус протягом 5-7 днів, після зараження; в) здійснюють першу стадію збору шляхом видалення середовища з біореактора і виділення з неї одержаного в результаті розмноження вірусу; г) поповнюють середовище в біореакторі і розмножують вірус протягом 1-4 днів; д) здійснюють другу стадію збору шляхом видалення середовища з біореактора і виділення з неї одержаного в результаті розмноження вірусу; е) поповнюють середовище в біореакторі і розмножують вірус протягом 1-4 днів; і ж) здійснюють третю стадію збору шляхом видалення середовища з біореактора і виділення з неї одержаного в результаті розмноження вірусу. У деяких варіантах здійснення винаходу спосіб може додатково полягати в тому, що здійснюють після третьої стадії збору щонайменше одну стадію підживлення і стадію збору, які полягають в тому, що поповнюють середовище в біореакторі і розмножують вірус протягом 1-4 днів, і здійснюють четверту стадію збору шляхом видалення середовища з біореактора і виділення з нього одержаного в результаті розмноження вірусу. Бажано в способі одержання задана множинність зараження (MOI) становить від 0,01 до 8 9 0,30 і клітини ссавців висівають з густиною приблизно від 7 × 10 до 1,0 × 10 на 300-літровий 9 біореактор. Більш конкретно клітини ссавців висівають з густиною приблизно 1,0 × 10 на 3008 літровий біореактор. У конкретних варіантах здійснення винаходу MOI становить 7 × 10 вірусних частинок. Спосіб може полягати в тому, що здійснюють моніторинг концентрації глюкози в середовищі, при цьому першу стадію збору здійснюють у перший день, коли концентрація глюкози в 2 UA 112860 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 середовищі знижується до рівня, що становить менш ніж 0,1 г/л. У способі одержання в комерційному масштабі другий збір здійснюють бажано через 1 або 2 дні після підживлення середовищем, а третій збір здійснюють через 1-4 дні після другого підживлення середовищем. У конкретних варіантах здійснення винаходу культуральне середовище додають в біореактор за день до або в той же день, коли додають клітинну лінію ссавців і PRRS. Бажано культуральне середовище додають в біореактор за один день до додавання клітинної лінії ссавців і PRRSV. Температуру біореактора встановлюють на рівні 34ºC-38ºC. У конкретних варіантах здійснення винаходу середовище містить 5 об. % опроміненої фетальної бичачої сироватки. Спосіб можна застосовувати для одержання в комерційному масштабі будь-якого PRRSV, включаючи (але, не обмежуючись лише ними) PRRSV, вибраний з групи, що включає штам PRRSV 94881, депонований відповідно до Будапештського договору в Європейській колекції клітинних культур (ECACC) під реєстраційними номерами ECACC 11012501 і ECACC 11012502, кожен 25 cічня 2011 р., VR 2332, вірусний штам Lelystad (агент Lelystad (CDI-NL-2.91) або інші штами, наприклад, депоновані під реєстраційними номерами ECACC 04102703, ECACC 04102702, ECACC 04102704, реєстраційним номером CNCM I-1140, CNCM I-1387, CNCM I-1388, ATCC VR 2332, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474 і VR 2402; CNCM I-1102, CNCM I-1140, CNCM I-1387, CNCM I-1388 або ECACC V93070108; ATCC-депозит VR-2332, ATCC-депозит VR2368; ATCC VR-2495; ATCC VR 2385, ATCC VR 2386, ATCC VR 2429, ATCC VR 2474 і ATCC VR 2402, або будь-яке потомство або покоління будь-якого із зазначених вище штамів. Під обсяг винаходу підпадає також спосіб одержання PRRSV в комерційному масштабі, що полягає в тому, що a. паралельно засівають як клітини ссавців, пермісивні до зараження PRRSV, так і PRRSV в біореактор, який містить середовище, придатне для вирощування клітин; і б. здійснюють три послідовні стадії збору, під час яких збирають PRRSV, при цьому після кожної першої і другої стадії збору середовище поповнюють, і при цьому: I. перший збір здійснюють у перший день, коли концентрація глюкози у середовищі знижується до рівня, що становить менш ніж 0,1 г/л; II. другий збір здійснюють у день 1 або 2 після додавання середовища після першого збору; і III. третій збір здійснюють між 1 і 4 вдень після додавання середовища після другого збору. Можна застосовувати також альтернативний спосіб, в якому застосовують паралельний процес у ролер-флаконах, що еквівалентно описаному вище процесу в біореакторі. Більш конкретно, даний винахід належить до способу одержання в комерційному масштабі вірусу репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (PRRSV), що полягає в тому, що: a) паралельно засівають в ролер-флаконі середовище для великомасштабного культивування лінією клітин ссавців, пермісивних до зараження PRRSV, і заражають клітини ссавців PRRSV, б) розмножують вірус впродовж 5-7 днів після зараження; в) здійснюють першу стадію збору шляхом видалення середовища з ролер-флакона і виділення з неї одержаного в результаті розмноження вірусу; г) поповнюють середовище в ролер-флаконі і розмножують вірус протягом приблизно 2 днів; д) здійснюють другу стадію збору шляхом видалення середовища з ролер-флакона і виділення з неї одержаного в результаті розмноження вірусу; е) поповнюють середовище в ролер-флаконі і розмножують вірус протягом приблизно 2 днів; і ж) здійснюють третю стадію збору шляхом видалення середовища з ролер-флакона і виділення з неї одержаного в результаті розмноження вірусу. Іншим об'єктом винаходу є MLV PRRSV (модифікована жива вакцина на основі PRRSV), яка містить PRRSV, одержаний згідно з описаними вище варіантами способу, приготована в поєднанні з прийнятним ад'ювантом або носієм для введення свині. Короткий опис деяких аспектів креслень На кресленнях показано: на фіг. 1 - паралельний процес великомасштабного одержання PRRSV; на фіг. 2 - опис та часові параметри паралельного процесу для 300-літрових біореакторів; на фіг. 3 - титри вірусу і профілі декстрози у трьох паралельних прогонах в 300-літрових біореакторах; на фіг. 4 - титри вірусу і профілі глутаміну в трьох паралельних прогонах в 300-літрових біореакторах; на фіг. 5 - титри вірусу і профілі розчиненого кисню (DO) у трьох паралельних прогонах в 3 UA 112860 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 300-літрових біореакторах; на фіг. 6 - результати ОТ-ПЛР у реальному часі, виражені у вигляді % віремії у тварин, вакцинованих PRRSV 94881; на фіг. 7 - паралельний процес одержання PRRSV 94881 в ролер-флаконі; на фіг. 8 - опис та часові параметри паралельного процесу для ролер-флакону. Детальний опис винаходу Даний винахід належить до способів великомасштабного одержання вірусу репродуктивнореспіраторного синдрому свиней (PRRSV), призначеного для застосування для виробництва вакцин та інших композицій. У загальноприйнятих методах виробництва вірус вирощують на клітинній лінії, пермісивній до зараження PRRSV. Однак у таких звичайних методах клітинну лінію вирощують до конфлюентності або до стану, близького до конфлюентності, перед зараженням PRRSV. При створенні даного винаходу неочікувано було встановлено, що клітинну лінію не потрібно висівати і вирощувати перед зараженням PRRSV, а можна паралельно вносити PRRSV і клітинну лінію в процесі культивування клітин. Таким чином, важливою перевагою даного винаходу є економія часу, вартості та матеріалів, при цьому можна отримувати масу вірусу в комерційних масштабах. Поняття комерційний масштаб належить до обсягів клітинних культур, які перевищують 10 л. Наприклад, комерційний масштаб належить до масштабу виробництва від 10 до 3000 л живого PRRSV. У більш конкретних варіантах здійснення винаходу обсяг становить від 30 до приблизно 300 л. Способи, запропоновані в даному винаході, можна застосовувати для одержання будь-якого штаму PRRSV, включаючи (але, не обмежуючись лише ними) штам PRRSV, депонований під реєстраційним номером ATCC VR 2332, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474 і VR 2402; CNCM I-1102, CNCM I-1140, CNCM I-1387, CNCM I-1388 або ECACC V93070108. У найбільш бажаних варіантах здійснення винаходу способи, пропоновані у винаході, використовують для одержання штаму PRRSV 94881, депонованого фірмою Bioscreen GmbH, Mendelstrasse 11, 48149, Мюнстер, Німеччина, в Європейській колекції клітинних культур (ECACC), Портон Даун, Солсбері, 30, графство Уїлтшир, SP4 0JG, Великобританія, під реєстраційними номерами ECACC 11012501 (батьківський штам) і ECACC 11012502 (ослаблений вихідний вакцинний вірус (MSV), одержаний після великої кількості пересівань), кожен з яких депонований 25 січня 2011 відповідно до Будапештського договору, або будь-якого потомства або покоління будь-якого із зазначених вище штамів. Вирощені віруси можуть являти собою будь-які з перерахованих вище вірусів в ослабленій формі. Альтернативно цьому, вірус може бути генетично модифікований таким чином, що він містить одну або кілька гетерологичних нуклеїнових кислот, які кодують додаткові антигенні детермінанти, з якими асоційовані одна або кілька хвороб свиней. Фахівцеві в даній галузі повинно бути очевидно, що існує ряд клітинних ліній, пермісивних до зараження PRRSV. Прикладами клітин є клітини альвеолярних макрофагів свиней, наприклад, виведені з MARC-145-клітин. Інші клітини, які можна інфікувати PRRSV, включають MA-104клітини; клітини нирки дитинчати хом'яка (BHK); клітини яєчника китайського хом'ячка (CHO) і клітини зеленої африканської мавпи, відмінні від MA-104-клітин або MARC-145-клітин, такі як клітини VERO, трансфекцію яких здійснюють. Крім того, клітини можуть являти собою первинні клітини, одержані зі свиней, які адаптовані до тривалого вирощування в культурі. Найбільш прийнятними клітинами-господарями є мавпячі клітини лінії MA-104, клітини Vero або альвеолярнімакрофаги свиней. PRRSV бажано вирощують в альвеолярних легеневих макрофагах (Wensvoort та ін, 1991). Кілька інших клітинних ліній, таких як CL2621, і інші клітинні лінії, клоновані з клітинної лінії нирки мавп MA-104 (Benfield та ін, 1992; Collins та ін, 1992; Kim та ін, 1993), також мають чутливість до вірусу, і їх можна застосовувати в представлених у даному описі способах великомасштабного одержання. У наведеному в якості прикладу способі, який запропоновано в даному винаході, який описано нижче у прикладі 1, представлений паралельний процес одержання MLV PRRSV 94881. Хоча ця процедура описана на прикладі MLV PRRSV 9488, фахівцеві в даній галузі повинно бути очевидно, що для цієї процедури можна застосовувати будь-який PRRSV, для якого потрібно одержання в промисловому масштабі. Віруси, одержані за допомогою способу одержання, який запропоновано у винаході, можна використовувати для будь-яких варіантів застосування, відомих у даний час для PRRSV. У конкретному варіанті здійснення винаходу вірус, одержаний за допомогою способів, представлених у даному описі, застосовують для приготування MLV на основі PRRSV. Штами вірусу, вирощені згідно способу, пропонованому у винаході, можуть являти собою вірулентні PRRS-віруси, ослаблені PRRS-віруси або істинні PRRS-віруси, модифіковані з метою надання їм додаткових необхідних властивостей. Для досягнення цього можна використовувати класичні методи розмноження та селекції, наприклад, тривале розмноження в прийнятних 4 UA 112860 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітинах-господарях до досягнення ослабленого фенотипу. Альтернативно цього, штами можна генетично модифікувати за допомогою спрямованої мутації нуклеотидної послідовності генома цих штамів з використанням прийнятних методів генетичної інженерії. Геном PRRSV повністю або частково секвенований (Conzelmann ін, 1993; Meulenberg та ін, 1993a, Murthaugh та ін, 1995), і кодує крім РНК-залежної РНК-полімерази (ОРС 1a і 1b), шість структурних білків, з яких чотири являють собою оболонкові глікопротеїни, позначені як GP2 (ОРС2), GP3 (ОРС3), GP4 (ОРС4) і GP5 (ОРС5), неглікозильовані мембранний білок M (ОРС6) і нуклеокапсидний білок N (ОРС7) (Meulenberg та ін, 1995, 1996; van Nieuwstadt та ін., 1996). Імунологічна характеризація і нуклеотидне секвенування штамів PRRSV європейського та US-генотипу дозволили ідентифікувати мінорні відмінності в антигенах між штамами PRRSV, локалізовані в структурних білках вірусів (Nelson та ін, 1993; Wensvoort та ін, 1992; Murtaugh та ін., 1995). Фактично, прикладом вірусу, який вирощується згідно з винаходом, є вірус PRRSV 94881. Коли вирощують ослаблений штам за допомогою способів, представлених у даному описі, то вірус може являти собою просто вірус PRRSV 94881, перетворений на химерний вірус, в якому каркас вірусу PRRSV 94881, депонований в ECACC під реєстраційним № 11012502 або істинний батьківський штам, депонований в ECACC під реєстраційним № 11012501, модифікований для заміни ендогенної послідовності однієї або декількох з ОРС 1a, ОРС 1b, ОРС 2, ОРС 3, ОРС 4, ОРС 5, ОРС 6 або ОРС 7 відповідної ОРС з іншого штаму PRRS-вірусу. Наприклад, інший штам PRRS-вірусу може являти собою інший європейський штам, такий як штам вірусу Lelystad (агент Lelystad (CDI-NL-2.91), або інші штами, які депоновані під реєстраційними номерами ECACC 04102703, ECACC 04102702, ECACC 04102704, CNCM, який має реєстраційний №. I-1140, CNCM, який має реєстраційний №. I-1387, CNCM, який має реєстраційний №. I-1388, ATCC VR 2332, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474 і VR 2402; CNCM I-1102, CNCM I-1140, CNCM I-1387, CNCM I-1388 або ECACC V93070108, або фактично може представляти собою штам USгенотипу, такий як Північноамериканський штам PRRS-вірусу, pT7P129A; депозит ATCC VR2332, депозит ATCC VR-2368; ATCC VR-2495; ATCC VR 2385, ATCC VR 2386, ATCC VR 2429, ATCC VR 2474 і ATCC VR 2402. Методи рекомбінації, призначені для одержання модифікованих послідовностей, добре відомі фахівцям в даній галузі, і їх, як правило, застосовують для конструювання повнорозмірних ДНК-копій (інфекційні клони) вірусного генома, які потім можна модифікувати за допомогою методів рекомбінації і маніпуляції з ДНК (типу сайтнаправленного мутагенезу і т.д.). Таким шляхом, наприклад, можна модифікувати антигенні сайти або ферментативні властивості вірусних білків. Інфекційні клони штамів PRRS-вірусу європейського та північноамериканського генотипу описані в літературі і їх можна вирощувати за допомогою способів, запропонованих у винаході. Бажано вакцини, запропоновані в даному винаході, являють собою модифіковані живі вакцини, що містять один або кілька живих зазначених штамів в прийнятному носії, але можна застосовувати також інактивований вірус для приготування убитої вакцини (KV). MLV, як 1 7 правило, готують таким чином, щоб можна було вводити від 10 до 10 вірусних частинок на 3 5 4 5 дозу, краще від 10 до 10 частинок на дозу, більш переважно від 10 до 10 частинок на дозу (4,0-5,0 log10 TCID50). KV можна готувати на основі попередньо інактивованих вірусних частинок 3 10 з титром проти 10 до 10 на дозу. Вакцина може містити фармацевтично прийнятний носій, наприклад, фізіологічний соляний розчин. Вакцина може містити або не містити ад'ювант. Прикладом прийнятного ад'юванта є α-токоферолацетат, який можна отримувати, наприклад, у вигляді продукту під товарним знаком Diluvac Forte ®. Альтернативно цьому, наприклад, можна застосовувати ад'ювант на основі квасців. Свиней можна заражати PRRSV ороназальним шляхом. Вірус в легенях поглинається легеневими альвеолярними макрофагами і в цих клітинах реплікація PRRSV закінчується протягом 9 год. PRRSV переміщається з легенів в легеневі лімфатичні вузли протягом 12 год. і периферичні лімфатичні вузли, кістковий мозок і селезінку протягом 3 днів. У цих областях лише невелика кількість клітин дають позитивну щодо вірусного антигену забарвлення. Вірус присутній у крові щонайменше протягом 21 дня і часто набагато довше. Через 7 днів у крові виявляють антитіла до PRRSV. Одночасна присутність вірусу і антитіла в організмі інфікованих PRRS свиней свідчить про те, що вірусна інфекція може зберігатися протягом тривалого періоду часу, хоча і на низькому рівні, незважаючи на присутність антитіла. Протягом щонайменше 7 тижнів популяція альвеолярних клітин у легенях відрізняється від популяції в здорових вільних від патогенів (SPF) легень. Вакцина може перебувати у формі висушеного виморожуванням препарату живого вірусу, її можна відновлювати в розчиннику з одержанням розчину для ін'єкцій. Таким чином, після стадій збору, пропонованих в даному винаході, вірус можна об'єднувати і піддавати сушці 5 UA 112860 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виморожуванням. Розчинник може являти собою, наприклад, воду, фізіологічний розчин або буфер, або розчинник, що представляє собою ад'ювант. Розчинник може містити ад'юванти, наприклад, α-токоферолу ацетат. Відновлену вакцину можна потім ін'єктувати свині, наприклад, шляхом внутрішньом'язової або внутрішньошкірної ін'єкції в шию. Для внутрішньом'язової ін'єкції можна застосовувати об'єм 2 мл, для внутрішньошкірної ін'єкції, як правило, застосовують обсяг 0,2 мл. Таким чином, наступним об'єктом даного винаходу є продукт у вигляді вакцини, який містить в різних контейнерах висушену виморожуванням композицію, що включає вірус, і розчинник для відновлення і необов'язково додатково містить листівку або етикетку, що включає інструкції по застосуванню. Вакцина, приготовлена з вірусу, який отримували способом, запропонованим у винаході, може містити не тільки один чи декілька з вищезазначених штамів, але може включати також і інші компоненти, які мають активність щодо PRRS або інших вірусних або бактеріальних хвороб свиней, типу цирковірус свиней або класичного вірусу свинячого грипу. Крім того, винахід також стосується зазначеної вакцини, що відрізняється тим, що вона містить щонайменше один додатковий антиген, активний відносно хвороби свиней, відмінної від PRRS. Крім того, вакцина може містити певні застосовувані у фармацевтиці або ветеринарії ад'юванти. Одним з таких ад'ювантів є α-токоферол. Таким чином, нові композиції вакцин, зокрема, вакцин, що містять PRRS-вірус, такий як PRRSV 94881, можна додатково покращувати, додаючи ад'юванти. Такі поліпшення передбачають приготування вакцин в поєднанні з ад'ювантами, що підвищують ефективність вакцини, в результаті чого отримують кращу клінічну відповідь / результат при введенні в поєднанні ад'юванта і вакцини в порівнянні з застосуванням тільки вакцини. Наприклад, композиції вакцин, пропоновані у винаході, можуть містити вакцину на основі вірусу PRRSV 94881 і ад'ювант, вибраний з групи, що включає MCP-1, фракції Haemophilus sonmus, Carbapol™ та їх комбінації. У деяких варіантах здійснення винаходу вірусна вакцина являє собою вакцину на основі вірусу PRRSV 94881, яка може містити рекомбіновану суб'одиничну вакцину або в альтернативному варіанті може являти собою вакцину на основі живого ослабленого вірусу. Прикладом відомої живої вакцини є Ingelvac ® PRRS MLV, і на основі PRRSV 94881 можна приготовляти форму методом, аналогічним методом, застосовуваним для одержання Ingelvac®PRRS MLV. Крім того, композиції вакцин можуть містити інші інгредієнти, якщо інші інгредієнти не впливають на властивості ад'ювантів, таких як MCP-1, фракції Haemophilus sonmus, Carbapol™ або інший карбомер, або що лежить в основі композиції вірусної вакцини. Такі інші інгредієнти включають, наприклад, сполучні речовини, барвники, десиканти, антисептики, агенти, які змочують, стабілізатори, наповнювачі, адгезиви, пластифікатори, прилипачі, розпушувачі, матеріали пластирів, мазеві основи, речовини для видалення кератину, оснòвні субстанції, підсилювачі абсорбції, жирні кислоти, ефір жирної кислоти, вищі спирти, поверхнево-активні речовини, воду і забуферюючі агенти. Кращими додатковими інгредієнтами є забуферюючі агенти, мазеві основи, жирні кислоти, антисептики, оснòвні субстанції або поверхнево-активні речовини. Вміст або кількість ад'ювантів, застосовуваних згідно винаходу, можна варіювати і його можна визначати, беручи до уваги, наприклад, властивості застосовуваної вакцини на основі PRRSV і форму лікарського засобу. Компонент, що представляє собою ад'ювант, може містити, наприклад, від 1 до 100 мас. %. Композиції на основі PRRSV 94881, пропоновані у винаході, отримують шляхом змішування компонента, що представляє собою ад'ювант, і компонента, що представляє собою вірусну вакцину, або індивідуально, або в поєднанні з різними іншими інгредієнтами. Композиції можуть являти собою такі композиції, в яких вірусна вакцина і ад'ювант присутні в складі однієї препаративної форми, або в альтернативному варіанті ад'ювант і вакцина присутні в складі окремих препаративних форм, які можна вводити одночасно або послідовно. Так, при введенні в організм тварин компонент, що представляє собою ад'ювант, запропонованих у винаході імуногенних композицій можна вводити окремо від вірусної вакцини. В альтернативному варіанті ад'ювант, застосовуваний відповідно до винаходу, можна вводити спільно з вірусною вакциною у формі єдиної композиції вакцини. Вірусна вакцина може являти собою будь-яку вірусну вакцину. У більш конкретних варіантах здійснення винаходу пропонується застосовувати вакцину на основі вірусу PRRS, що містить PRRSV 94881. Крім того, таку вакцину можна об'єднувати з іншими вакцинами, такими як MLV PRRS Ingelvac ® та / або Porcilis ®. Це є лише одним із прикладів комбінованої вакцини на основі вірусу PRRS, можна легко приготовляти та інші подібні комбінації вакцин. Імуногенні композиції, представлені в даному описі, найбільш доцільно застосовувати для індукції гуморальної імунної відповіді на PRRS-вірус. Зокрема, при створенні даного винаходу 6 UA 112860 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 встановлено, що застосування зазначених специфічних ад'ювантів, і зокрема MCP-1, підвищує імунну відповідь на PRRS-вірус при спільному введенні ад'юванта і вакцини на основі PRRSвірусу в порівнянні з введенням тільки вакцини. Встановлено, що при такому застосуванні відбувається зменшення серйозності клінічних симптомів, таких як легеневі ушкодження, анорексія, знебарвлення шкіри, загальмованість, респіраторні симптоми, муміфікація поросят, кашель, діарея та їх комбінації, які асоційовані з зараженням PRRSV. Фактично при застосуванні комбінації вакцини та ад'юванта виявлено більш значне зниження серйозності клінічних симптомів, асоційованих із зараженням вірусом PRRS, порівняно зі зниженням серйозності зазначених симптомів при введенні тільки вакцини у відсутності зазначеного ад'юванта. У результаті композиції істотно поліпшують клінічний результат у хворої тварини в порівнянні з результатом при введенні тільки вакцини на основі PRRS-вірусу. У конкретних варіантах здійснення винаходу покращений клінічний результат являє собою зниження відсотка легеневих ушкоджень в порівнянні з тваринами, яким не вводили імуногенну композицію в поєднанні з вказаним ад'ювантом. В інших варіантах здійснення винаходу покращений клінічний результат являє собою зниження рівня віремії у тварин в порівнянні з тваринами, яким не вводили імуногенну композицію в поєднанні з вказаним ад'ювантом. Таким чином, одним з об'єктів винаходу є покращена вакцина, більш конкретно поліпшена вакцина на основі PRRS-вірусу, де удосконалення включає змішання з вірусною вакциною ад'юванта, вибраного з групи, що включає MCP-1, фракції Haemophilus sonmus, карбапол та їх комбінації. Композиція вакцини, запропонованої у винаході, може включати також фармацевтично прийнятний носій. Крім того, вакцини можуть містити інші діючі речовини, включаючи HS, ОРС 5, INF-альфа, полі ICLC, IL-12, для додаткового посилення функції вакцини проти PRRS. Зазначені ад'юванти можна вводити індивідуально або в поєднанні з MCP-1. Композиції вакцин, пропоновані у винаході, можна приготувати за допомогою будь-якого методу, відомого в області приготування препаративних форм, наприклад, у вигляді, рідких препаратів, суспензій, мазей, порошків, лосьйонів, W / O-емульсій, O / W-емульсій, емульсій, кремів, катаплазм, пластирів і гелів, і їх переважно застосовують як лікарських засобів. Таким чином, іншим об'єктом даного винаходу є фармацевтична композиція, що містить вищевказану композицію вакцини. Композиція вакцини, пропонована в даному винаході, при її шкірному введенні може істотно індукувати вироблення антитіл. Таким чином, в іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу композиція вакцини може перебувати у формі трансдермального препарату. На додаток до описаного вище, вірус і ад'ювант, запропоновані в даному винаході, можна вводити в організм разом у вигляді однієї композиції вакцини або у вигляді препарату ад'юванта, окремого і відмінного від антигенного компонента вакцини, що представляє собою PRRS-вірус, при цьому дія ад'юванта полягає в тому, що титр антитіл, що виробляються в організмі у відповідь на введення вакцини на основі PRRS-вірусу, може істотно зростати в порівнянні з введенням тільки вакцини на основі PRRS-вірусу. Таким чином, ще одним об'єктом даного винаходу є спосіб підвищення титру антитіл проти PRRS-вірусу, що полягає в тому, що вводять в організм одночасно або послідовно в імунологічно ефективній кількості вакцину на основі PRRS-вірусу і ад'ювант, вибраний з MCP-1, фракцій Haemophilus sonmus, Карбопол та їх комбінацій, або індивідуально, або в поєднанні з додатковим компонентом, вибраним з групи, що включає HS, ОРС 5, INF-альфа, полі ICLC, IL-12 та їх комбінації, в кількості, ефективній в якості імуноадьювантів. Коли ад'ювант і вакцину на основі PRRS-вірусу вводять в організм, то клінічний результат у тварини поліпшується. Ефективну кількість ад'юванта і імунологічно ефективну кількість вакцини на основі PRRS-вірусу може легко визначати звичайний фахівець у даній галузі з урахуванням, наприклад, типу і властивостей антигенної субстанції, виду організму, віку, ваги тіла, серйозності захворювань, типу захворювань, часу введення і методу введення, а також використовуючи як показника титр антитіла, що утворився проти антигенної субстанції в організмі. Вакцину на основі PRRS-вірусу, ад'ювант чи комбінацію можна вводити в організм будьяким прийнятним методом, вибраним, наприклад, залежно від стану пацієнтів та особливостей захворювань. Прикладами таких методів є внутрішньоочеревинне введення, шкірне введення (наприклад, підшкірна ін'єкція, внутрішньом'язова ін'єкція, внутрішньошкірна ін'єкція і застосування пластирів), назальні введення, оральне введення, нанесення на слизову оболонку (наприклад, ректальне введення, вагінальне введення і введення в рогівку). Кращим є внутрішньом'язове введення. Прикладом терапевтичної дози MLV PRRSV є доза об'ємом приблизно два мілілітри (2 мл). Фахівцям у цій галузі має бути очевидно, що кількість дози може змінюватись в залежності від 7 UA 112860 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 породи, розміру та інших фізичних факторів індивідуума, в також від специфічної форми MLV PRRSV і шляху введення. Краще MLV PRRSV вводять у вигляді одноразової дози; однак можна застосовувати додаткові дози. І в цьому випадку фахівцеві в області, до якої належить даний винахід, має бути очевидно, що на дозу і кількість доз впливає вік і фізичний стан конкретної свині, а також інші загальновідомі в промисловості обставини і специфічні умови введення MLV PRRSV. У деяких інших варіантах здійснення винаходу вакцина може являти собою мультивалентну вакцину, яка містить два або більшу кількість PRRS-вірусів, з яких щонайменше один з PRRSвірусів являє собою ослаблений штам 94881 вірусу, депонований в ECACC під реєстраційним № 11012502. Інші PRRS-віруси можуть являти собою один або кілька вірусів, вибраних з групи, що включає штам PRRSV, депонований під реєстраційними номерами вірусного штаму Lelystad (агент Lelystad (CDI-NL-2.91)), або інші штами, такі як депоновані під реєстраційними номерами ECACC 04102703, ECACC 04102702, ECACC 04102704, реєстраційним номером CNCM I-1140, реєстраційним номером CNCM I-1387, реєстраційним номером CNCM I-1388, ATCC VR 2332, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474 і VR 2402; CNCM I-1102, CNCM I-1140, CNCM I-1387, CNCM I-1388 або ECACC V93070108, або також можуть являти собою US-штам, такий як північноамериканський PRRS-вірус, pT7P129A; ATCC-депозит VR-2332, ATCC-депозит VR-2368; ATCC VR-2495; ATCC VR 2385, ATCC VR 2386, ATCC VR 2429, ATCC VR 2474 і ATCC VR 2402. Вакцини на основі PRRS-вірусів можна застосовувати для вакцинації, як поросят, так і свиноматок. В одному з об'єктів винаходу конкретний режим введення доз вибирають на основі віку свиню та антигену, відібраного для введення. Можна обробляти свиней будь-якого віку найбільш ефективною дозою з урахуванням одержаних при створенні винаходу даних про те, що зараження PRRSV (як при впливі вірусом дикого типу, так і при вакцинації) є істотно більш швидким у разі тварин старшого віку. Так, в деяких аспектах кращою є вакцинація тварин старшого віку, але вакцинація більш молодих свиней, включаючи тварин віком три тижні і менше, сприяє індукції активного імунітету і також є дуже цінною. Вік тварин може являти собою важливий фактор при контролі PRRS і може являти собою фактор, що впливає на вакцинацію і розвиток ефективної імунної відповіді. Таким чином, вік, план лікування захворювання, тваринницьке господарство, вроджений і активний імунітет є важливими, і їх слід розглядати при створенні стратегій контролю. Вакцину на основі PRRSV 94881 можна вводити будь-яким загальноприйнятим чином і в деяких бажаних методах її вводять назально. Краще, щоб введення одноразової дози вакцини на основі PRRSV забезпечувало сприятливі впливи щодо лікування або зниження серйозності або частоті виявлення інфекції, спричиненої PRRSV, як це має місце у випадку Ingelvac®, однак, якщо вибирають інші антигени або комбінації, або мультивалентні вакцини, то має бути очевидно, що їх можна вводити прийнятим для них чином, який може передбачати застосування однієї або декількох бустерних доз після початкового введення. Фахівці в даній галузі можуть визначати відповідні рівні доз залежно від вибраної вакцини на основі PRRSV і вікового діапазону тварин, яким слід вводити антиген. Приклад 1: Приклад підвищення масштабу виробництва MLV PRRSV 94881 Підвищення масштабу процесу одержання PRRSV 94881 з використанням MA104-клітин, які були піддані 64-84 пасажів, здійснювали в 300-літровому біореакторі. Зазначені клітини 2 розмножували в ролер-флаконах площею 850 см (фірма Corning). Клітини культивували паралельно із зараженням вірусом в 300-літрових ерліфтних біореакторах. У процесі культивування здійснювали моніторинг концентрацій (в г / л) декстрози / лактози в середовищі. При зборі рідини відкидали, а зразки з вірусом зберігали. Склад середовища представлений у наведеній нижче таблиці: Компонент фетальна бичача сироватка, опромінена гамма-випромінюванням Середовище MEM без порошку фенолового червоного неоміцину сульфат бікарбонат натрію соляна кислота Кількість 5% 9,6 г/л 30 мг/л 1,4 г/л до досягнення необхідного значення pH 50 Готували суміш, що містить середовище MEM без фенолового червоного, неоміцин і 1,4 г / л бікарбонату натрію, і фільтрували. Водночас із внесенням до біореактор в середовище 8 UA 112860 C2 5 10 15 20 додавали FBS. Кількість доданого неоміцину розраховували згідно з такою формулою: об. (Л) × 30 мг / л ÷ концентрація (мг / г основи). Паралельний процес вирощування PRRSV 94881 включав внесення AK MA104-клітин в біореактор і одночасне зараження клітин за допомогою посіву вірусу PRRSV 94881. На фіг. 1 представлена схема паралельного процесу. На фіг. 2 наведені часові параметри паралельного процесу, представленого на фіг. 1. При здійсненні паралельного процесу середовище обсягом 270 л стерилізували фільтрацією в біореакторі. Середовище додавали в посудину в той же день, коли додавали клітини і сироватку, або за день до цього. Якщо середовище додають в біореактор за 1 день до додавання клітин і сироватки, то рекомендується активувати контроль температури для того, щоб забезпечити підтримку температури середовища на рівні 35 º C, здійснюючи при цьому контроль значення рН, підтримуючи його на рівні 7,25±0,1, і здійснювати моніторинг рівня DO і перемішування зі швидкістю 35 об / хв. У день додавання клітин і опроміненої фетальної бичачої сироватки (IFBS) пристрій для контролю температури налаштовували на 36 º C. IFBS вносили в біореактор після додавання середовища і перед посівом клітин. Необхідна концентрація IFBS становила 5 об. %, Тобто на обсяг 270 л середовища в біореакторі додавали 14,0 л IFBS. Здійснювали три прогони в 300-літровому біореакторі. Використовували наступні параметри біореактора: температура - 36 º C, pH-7,25 в режимі контролю, моніторинг рівня DO і перемішування при 35 об / хв. У таблицях 3, 4 і 5 представлені дані реєстрації рівнів DO (%) на основі індукційного часу окислення (OIT), декстрози і лактату на основі аналізу фірми YSI і pH і L-глутаміну на основі аналізу фірми NOVA. PD-титри дані тільки для порівняння. QC-титри представляють собою офіційні титри. Таблиця 3: Результати прогону партії 00lPD-X в 300-літровому біоректорі Дні pH DO % 168 Декстроза г/л YSI N/A Лактат г/л YSI N/A Gln моль/л NOVA N/A Титр PD TCID50 N/A Титр QC TCID50 N/A -1 7,24 0PI 1PI 2PI 3PI 4PI 5PI 6PI 7PI 7,2 7,26 7,25 7,23 7,24 7,06 7,25 7,24 92 168 83 74 63 30 30 30 N/A 1 0,95 0,742 0,408 0,044 0,011 0 N/A 0,073 0,12 0,262 0,58 0,921 0,902 0855 N/A 2,63 2,36 2,14 1,72 1,19 0,74 0,49 N/A 3,67 4,9 5,88 6,45 6,50 6,38 7,40 N/A N/A N/A N/A 7,0 7,3 6,7 7,4 Коментар тільки середовище N/A N/A N/A N/A N/A контроль DO прозорий мутний 25 30 35 У таблиці 3 представлені результати для партії 001PD-X, одержані протягом 7 днів після зараження. Зразки відбирали щодня і прогін закінчували в день 7PI (після зараження). Значення pH було встановлено на 7,25, і воно знаходилося на постійному рівні протягом прогону за винятком дня 4PI, коли воно впало нижче 7,0. У день 4P рівень глюкози знизився до 0,4 з рівня 0,74, який мав місце за 1 день до цього, починалося поглинання глутаміну і вихідний титр зростав приблизно на 1 log. Величина титру досягала піку в день 5PI, коли мало місце повне поглинання глюкози (≤ 0,1 г / л). Крім того, в день 5PI рівень DO знижувався до 30 %, і в цей момент часу починали його контроль для того, щоб уникнути падіння рівня DO до нуля протягом ночі. У день 6PI титр знижувався, а потім зростав до 7,4 в день 7PI. Зразок ставав каламутним на день 7PI. 9 UA 112860 C2 Таблиця 4: Результати прогону партії 002PD-X у 300-літровому біоректорі Дні 7,27 0PI 116 Декстроза г/л YSI N/A Лактат г/л YSI N/A Gln моль/л NOVA N/A Титр PD TCID50 N/A Титр QC TCID50 N/A 7,2 83 1,04 0 N/A N/A N/A 1PI 2PI 3PI 4PI 5PI R0PI (підживлення) R1PI R2PI 7,25 7,25 7,24 7,19 7,21 7,24 75 74 70 60 30 116 1,01 0,954 0,762 0,409 0,005 0,001 0,073 0,105 0,223 0,561 0,881 0,858 1,64 1,73 1,41 1,25 0,9 0,64 3,88 5,5 5,93 6,62 6,79 N/A N/a N/a 6 6,5 7,5 N/A 6,99 7,15 116 116 0,247 0,0 0,726 0,894 1,38 0,95 7,13 7,06 7,5 7,0 R3PI R4PI R5PI 10 DO % -1 5 pH 7,13 7,13 7,13 116 116 116 0,0 0,0 0,0 0,865 0,819 N/A 0,66 0,21 0,1 6,69 7,52 7 7,5 7,5 7,3 Коментар додавання середовища додавання клітин/сироватки/посів вірусу N/A N/A N/A N/A збір-I відсутність DO в пробі N/A рівень декстрози знизився до нуля прозорий прозорий деяке помутніння У таблиці 4 представлені результати для партії 002PD-X (R0P1 - момент часу, коли виробляли підживлення культури). З урахуванням титрів, одержаних для партії 001PD-X, в якості дня збору вибирали день 5PI. Для партії 002PD-X дні з 1PI до 5PI відповідали днях для партії 001PD-X. Здійснювали збір вмісту біореактора і потім проводили підживлення в день 5PI. Будували криву зростання для визначення моменту для збору-II. Зразки відбирали щоденно протягом 5 днів. Повне поглинання глюкози сталося до дня R2PI (день 2 після підживлення). Було встановлено, що титр перебував на піковому рівні протягом 5 днів (варіації на рівні 0,5 log знаходилися в межах похибки методу). Повне поглинання глутаміну сталося до дня R5PI. Після підживлення DO в пробі був відсутній. Рівень DO не вдалося виміряти (найбільш ймовірно він близький до нуля). У день R4PI клітини все ще знаходилися в прикріпленому стані, оскільки зразок у посудині був прозорим. У день R5PI у зразку в посудині виявлена деяке помутніння, яке свідчить про те, що клітини могли починати від'єднуватися від спіралі (носія). 15 Таблиця 5: Результати прогону партії 003PD-X у 300-літровому біоректорі Дні pH DO % 78 69 Декстроза г/л YSI N/A 0,987 Лактат г/л YSI N/A 0,078 Глутамін моль/л NOVA N/A 2,05 Титр PD TCID50 N/A 4,38 Тито QC TCID50 N/A 4,7 0PI 1PI 7,49 7,25 2PI 3PI 4PI 5PI 0PI (підживлення) R1PI R2PI 0PI 2-ая підживлення 7,23 7,22 7,29 7,1 7,19 66 60 53 30 71 0,935 0,783 0,453 0,049 N/A 0,107 0,221 0,519 0,899 N/A 1,9 1,71 1,45 1,17 N/A 5,13 6,2 6,36 6,36 N/A 5,7 6,5 6,6 7,0 N/A 6,98 7,23 7,21 18 7 74 0,305 0,0 N/A 0,702 0,917 N/A 2,69 1,82 N/A 7,26 6,85 N/A 7,3 7,5 N/A 10 Коментар N/A моніторинг DO /контроль значення pH N/A N/A N/A збір-I моніторинг DO N/A збір-II N/A UA 112860 C2 Таблиця 5: Результати прогону партії 003PD-X у 300-літровому біоректорі Дні 25 30 35 40 Лактат г/л 0,853 Глутамін моль/л 1,69 Титр PD 7,0 Тито QC 7,5 7,19 3 0,0 0,883 0,82 7,2 7,3 7,17 7,24 2 18 N/A N/A N/A N/A 0,42 0,22 7,46 7,0 7,5 7,5 2R5PI 2R6PI 2R7PI 20 13 Декстроза г/л 0,097 2R3PI 2R4PI 15 6,91 2R2PI 10 DO % 2R1PI 5 pH 7,24 7,22 7,24 47 62 68 N/A N/A N/A N/A N/A N/A 0,13 0,06 0,04 6,68 6,5 6,36 7,0 7,0 6,2 Коментар контроль DO на рівні 10 % моніторинг DO мутність підвищення рівня DO мутність мутність мутність У таблиці 5 представлені результати для партії 003PD-X. З урахуванням титрів, одержаних для партії 002PD-X, в якості дня збору-II можна було вибирати день 1PI або 2PI. Було вирішено збирати рідини на день 2PI для додання гнучкості процесу одержання. Будували криву зростання за 7 днів для визначення моменту для збору-II. Зразки відбирали щодня. Повне поглинання глюкози сталося до дня 2R2PI. Титр зберігався на піковому рівні протягом 4 днів, а потім знижувався до 7,0 протягом 2 днів (варіації на рівні 0,5 log знаходилися в межах похибки методу), після чого знижувався до 6,2 в день 7PI. Повне поглинання глутаміну сталося до дня 2R5PI. DO контролювали в день 2R2PI для моніторингу загибелі клітин. Фаза збору-I при розмноженні вірусу в 300-літровому масштабі: За кривою зростання для збору-I (партія 001PD-X) видно, що кількість вірусних частинок продовжувала збільшуватися до дня 7PI, незважаючи на повне поглинання глюкози (≤ 0,1 г / л) до дня 5PI. Поглинання глутаміну починалося, коли концентрація декстроза становила приблизно половину від початкової концентрації 1 г / л (день 4PI), а потім після поглинання глюкози глутамін, ймовірно, ставав основним джерелом енергії. Нестабільність даних для глутаміну для перших 2-3 днів могла бути пов'язана з флуктуаціями, характерними для влаштування NOVA, оскільки його концентрація в середовищі становила тільки 2 моль / л. Зниження рівня DO узгоджувалося з процесом метаболізму глюкози / глутаміну і рівнем розмноження вірусу. На основі кінетики розмноження вірусу було зроблено припущення про те, що вірус слід збирати у дні 5-7PI. Варіація в QC-титрах між днем 4PI і 7PI знаходилася в межах похибки методу (± 0,71 log / мл). Критерієм для здійснення збору-I був момент часу, коли відбувалося повне поглинання глюкози (≤ 0,1 г / л), що узгоджувалося з даними, одержаними в 30-літровому масштабі (досвід № 6127-1310-09K-198). Таким чином, для відстеження рівнів глюкози було необхідно періодично здійснювати вимірювання рівня декстрози, починаючи з дня 4PI. У таблиці 3 продемонстровано, що вірус PRRSV 94881 зберігав стабільність протягом 3 днів (дні 5-7PI) в 300-літровому біореакторі після виснаження декстрози. Однак, якщо здійснювати другий збір на основі результатів, представлених в таблицях 4 і 5, то слід рекомендувати здійснювати збір-I в перший день, коли концентрація глюкози досягне рівня