Комбінація рекомбінантної мікобактерії і біологічно активного агента як вакцини

Реферат: UA 101140 C2 (12) UA 101140 C2 Винахід належить до комбінації для застосування у способі викликання ТН1 імунної відповіді, де комбінація містить першу складову і окремо другу складову, де першою складовою є бактеріальна клітина, яка включає, принаймні, одну молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує фаголізосомальний вислизаючий пептид або поліпептид, де бактеріальною клітиною є уреазо-дефіцитна клітина Mycobacterium; і де другою складовою є біологічно активний агент, що викликає імунну відповідь. UA 101140 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Представлений винахід стосується комбінації, що містить, принаймні, дві складові, застосування такої комбінації як фармацевтичної композиції, її застосування для виготовлення медикаменту, способів лікування пацієнта використовуючи таку комбінацію і способу виготовлення такої комбінації. Сучасна молекулярна медицина надзвичайно сфокусована на застосуванні імуногенних сполук або сполук, що модулюють імунну систему пацієнта, для лікування такого пацієнта. Відповідними захворюваннями є, серед інших, пухлини і інфекційні захворювання. В обох випадках, антигенні сполуки, тобто, сполуки, які придатні для викликання імунної відповіді або для підсилення імунної відповіді вводять в тіло пацієнта. Придатність відповідних сполук є, однак, в багатьох випадках обмеженою, що потребує підтримки імунної відповіді для того щоб досягти клінічно релевантного рівня ефективності і дії. Така підтримка може бути спровокована неодноразовим введенням відповідного агенту або шляхом використання ад'юванту. Попередній рівень техніки забезпечує декілька ад'ювантів, такі як мінеральні олії, інактивовані мікобактерії, сполуки алюмінію і їм подібні. Однак, ад'юванти відомі з рівня техніки не завжди виконані таким чином, що придатні для задовольняння медичних потреб, зокрема, для поєднання з новими режимами лікування, такими як застосування клітин, що експресують цитокін, наприклад, як описано в міжнародній патентній заявці PCT/US94/01631. Таким чином, проблемою, на вирішення якої спрямований представлений винахід, є забезпечення композиції, більш особливо фармацевтичних композицій, які включають, принаймні, першу складову і другу складову, де першою складовою є ад'ювант і другою складовою є біологічно активний агент. Ця проблема вирішується в першому аспекті за допомогою комбінації, що містить першу складову і другу складову, де першою складовою є бактеріальна клітина, яка включає, принаймні, одну молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує фаголізосомальний вислизаючий пептид або поліпептид; і де другою складовою є біологічно активний агент. У втіленні винаходу, бактеріальна клітина є уреаза-дефіцитною. В наступному втіленні, бактеріальна клітина є клітиною Mycobacterium. В переважному втіленні, клітиною є клітина Mycobacterium bovis. В переважному втіленні, принаймні, одна клітинна субодиниця уреази, що кодується нуклеїновою кислотою бактеріальної клітини, є інактивованою. В більш переважному втіленні, принаймні, кодувальна послідовність С субодиниці бактеріальної уреази є інактивованою. У втіленні винаходу, фаголізосомальним вислизаючим доменом є фаголізосомальний вислизаючий домен Listeria. У втіленні винаходу, фаголізосомальний домен кодується молекулою нуклеїнової кислоти, що вибирають з групи, яка включає а) нуклеотидну послідовність, що включає нуклеотид 211-1722, як показано в SEQ. ED. NO. 1; б) нуклеотидну послідовність, яка кодує ту ж саму амінокислотну послідовність як і послідовність з а); і в) нуклеотидну послідовність, що гібридизує за жорстких умов з послідовністю з а) або б). У втіленні винаходу, бактеріальна клітина включає, принаймні, одну молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує пептид або поліпептид здатний викликати імунну відповідь у ссавця. В переважному втіленні, пептид або поліпептид вибирають з аутоантигенів, пухлинних антигенів, вірусних антигенів, паразитних антигенів, бактеріальних антигенів і їх імуногенних фрагментів. В наступному переважному втіленні, пептид або поліпептид є частиною злитого поліпептиду. У втіленні винаходу, злитий поліпептид включає а) принаймні, один домен поліпептиду, де поліпептидний домен здатний викликати захворювання, що вибирають з групи, що включає рак і інфекційні захворювання. Спеціалісту в цій галузі повинно бути зрозуміло, що композиція представленого винаходу і її складові або окремо, або в комбінації можуть також переважно використовуватись для профілактики захворювання. Це в переважному втіленніґрунтується на тому факті, що перша складова комбінації згідно з представленим винаходом є придатною для викликання імунної відповіді і більш особливо специфічної імунної відповіді, яка дозволяє забезпечити відповідній 1 UA 101140 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 людині або тварині захист від хвороби перед появою хвороби і більш особливо перед клінічно або медично релевантним проявленням захворювань. В переважному втіленні рак є імуногенною пухлиною і де пухлину, переважно, вибирають з групи, що включає рак простати, меланому, рак нирки, пухлину молочної залози, пухлини мозку, немілкоклітинний рак легені, рак товстої кишки, і сквамозну пухлина голови і шиї. В альтернативному втіленні, інфекційним захворюванням є малярія. В переважному втіленні, біологічно активним агентом є gp190/MSP1 протеїн Plasmodium або його фрагмент здатний викликати імунну відповідь у ссавця. В альтернативному втіленні, інфекційним захворюванням є HCMV інфекція, переважно HCMV інфекція людини. В переважному втіленні, біологічно активним агентом є щільне тіло як тут описано. В альтернативному втіленні інфекційним захворюванням є туберкульоз. Переважно, біологічно активним агентом є антиген з Mycobacterium, переважно Mycobacterium ssp.. Більш переважно, мікобактерію вибирають з групи, що включає М. tuberculosis, Μ. bovis, M. canettii, Μ. africanum і М. paratuberculosis. Навіть більш переважно, антигеном є антиген 85. В четвертому аспекті проблема, що лежить в основі представленого винаходу, вирішується за допомогою застосування комбінації згідно з першим аспектом представленого винаходу або кожної складової такої комбінації для виготовлення вакцини. В п'ятому аспекті проблема, що лежить в основі представленого винаходу, вирішується за допомогою способу лікування пацієнта, що страждає на захворювання і потребує такого лікування, що включає введення комбінації згідно з першим аспектом представленого винаходу або фармацевтичної комбінації згідно з другим аспектом представленого винаходу. В шостому аспекті проблема, що лежить в основі представленого винаходу, вирішується за допомогою способу виготовлення фармацевтичної комбінації, переважно фармацевтичної композиції згідно з другим аспектом представленого винаходу, що включає стадії - одержання, як першої складової, бактеріальної клітини, яка включає, принаймні, одну молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує фаголізосомальний вислизаючий пептид або поліпептид; - одержання, як другої складової, біологічно активного агенту; і - формулювання першої складової і другої складової в фармацевтичну композицію. В сьомому аспекті проблема, що лежить в основі представленого винаходу, вирішується за допомогою способу виготовлення фармацевтичної комбінації, переважно, фармацевтичної композиції згідно з другим аспектом представленого винаходу, що включає стадії - одержання, як першої складової, бактеріальної клітини, яка включає, принаймні, одну молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує фаголізосомальний вислизаючий пептид або поліпептид; - одержання, як другої складової, біологічно активного агенту; і - формулювання окремо першої складової і другої складової. У втіленні винаходу, сформульовану першу складову і сформульовану другу складову пакують у одну упаковку. Альтернативно, сформульовану першу складову і сформульовану другу складову пакують у окремі упаковки. В більш переважному втіленні, пакетики є одиничними дозованими формами або включають мікрокапсульовані одиничні дозовані форми. Винахідники неочікувано знайшли, що бактеріальна клітина, яка може або бути Грампозитивною або Грам-негативною бактеріальною клітиною, яка експресує фаголізосомальний вислизаючий пептид або поліпептид, є особливо корисним ад'ювантом, який може бути використаний в комбінації з біологічно активним агентом. Більш особливо, винахідники зрозуміли, що Mycobacterium bovis, переважно бацила Кальметта-Герена (BCG) Mycobacterium bovis і більш переважно Mycobacterium, така як BCG, що кодує або експресує фаголізосомальний вислизаючий пептид або поліпептид, є придатним засобом для викликання імунної відповіді або підсилення імунної відповіді, особливо, опосередкованої використанням біологічно активних агентів і більш особливо інших біологічно активних агентів, що викликають імунну відповідь. Особливо переважним типом біологічно активних агентів, що викликають імунну відповідь, є клітина, що експресує, принаймні, один цитокін або паразитний антиген, або пухлинний або паразитний антиген або вірусний антиген. Без бажання пов'язати з будь-якої теорією, винахідники встановили, що такий фаголізосомальний вислизаючий пептид або поліпептид, беручи до уваги, що будь-які антигени похідні з бактеріальної клітини або з біологічно активного агенту і придатні для викликання імунної відповіді, є більш ефективними у випадку коли доступний такий фаголізосомальний 2 UA 101140 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вислизаючий пептид. Іншими словами, дозволяючи антигенам, що створюються у провокованій бактеріальній клітині в фаголісосомах, вислизати з них і таким чином бути присутніми у імунній системі збільшуючи доступність BCG специфічних антигенів і створюючи таким чином відмінно діючий ад'ювант, що використовується у поєднанні з представленим винаходом. Цей вид вивільнення пептидів в МНС класу І шляху представлення може підсилювати вже існуючу BCG-специфічну імунну відповідь і активність ад'юванту. Дія ад'юванту BCG і більш особливо BCG або будь-якого мікроорганізму, переважно будьякого організму Mycobacterium, який кодує або експресує фаголізосомальний вислизаючий пептид або поліпептид, є наступним неочікуваним відкриттям винахідників, який можна, переважно, здійснити коли така дія ад'юванту, що продукується мікроорганізмом, поєднується або спільно вводиться з іншим або другим біологічно активним агентом. На відміну від інших ад'ювантів, які стимулюють ТН2 імунну відповідь, згаданий вище ад'ювант, тобто мікроорганізм, може використовуватись для викликання ТН1 імунної відповіді. Така ТН1 імунна відповідь є корисною доки вона індукує клітинну імунну відповідь. Тому, в наступному аспекті, винахід стосується застосування мікроорганізму, який кодує і/або експресує фаголізосомальний вислизаючий пептид, де мікроорганізмом є переважно BCG і більш переважно BCG, як тут описано, і найбільш переважно уре С-дефіцитна BCG, як ад'ювант. Навіть більш неочікувано, винахідники знайшли, що мікроорганізм, переважно BCG або його похідні, які кодують і/або експресують фаголізосомальний вислизаючий пептид і більш переважно BCG, як тут описано, в його різних втіленнях, включаючи, але не обмежується, rBCG.Hly і більш переважно уре С-дефіцитну BCG, таку як BCG: rBCG ureC: НІу і її похідні знаходяться над BCG без фаголізосомального вислизаючого пептиду доки вони здатні індукувати визначену CD8 відповідь, яка є специфічною для відповідного мікроорганізму, такого як Mycobacterium, і, крім того, також виражати CD8 відповідь, яка є специфічною для антигену представленого або даного біологічно активного агенту як тут описано і/або визначено. Іншими словами, мікроорганізм, який використовується або розглядається тут як перша складова, в цьому втіленні, тобто, включає фаголізосомальний вислизаючий пептид і більш переважно додатково є ureC негативною, не обмежується викликанням мікроорганізм-специфічної CD8 імунної відповіді на відміну від того, що очікувалось спеціалістом в цій галузі. В переважному втіленні, таким фаголізосомальним вислизаючим пептидом або поліпептидом є фаголізосомальний вислизаючий поліпептид L. monocytogenes, лістеріооізин (НІу). Лістеріолізин є поро-утворюючим сульфігідрилактивуючим цитолізином і відповідає за вивільнення мікроорганізмів L. monocytogenes з фаголізосомальних вакуолей в цитозоль клітин хазяїв. Ця функція вислизання може бути перенесена до різних бактеріальних клітин, таких як Bacillus subtilis, ослаблених штамів Salmonella ssp. і Mycobacterium, як наприклад описано в міжнародній заявці РСТ/ЕР2004/004345. Також, Міжнародна заявка WO 99/101496 описує рекомбінантні штами Mycobacterium bovis, що секретують біологічно активні лістеріолізинзлиті протеїни. Бактеріальна клітина, що формує першу складову композиції згідно з представленим винаходом, таким чином проявляє поро-формуючий механізм пробивання ендосомальних мембран, що призводить до відмінного імунозахисту. Спеціалісту в цій галузі бути зрозуміло, що існують деякі фаголізосомальні вислизаючі домени, де фаголізосомальний вислизаючий домен Listeria, який, наприклад, описаний в US 5,733,151, є переважним. Більш переважно, фаголізосомальний вислизаючий домен є похідним від організму L. monocytogenes, найбільш переважно, фаголізосомальний вислизаючий домен кодується молекулою нуклеїнової кислоти, що вибирають з а) нуклеотидної послідовності, що включає нуклеотиди 211-1.722 як показано в SEQ. ID. NO. 1, б) нуклеотидної послідовності, яка кодує ту ж саму амінокислотну послідовність як послідовність з а) і в) нуклеотидної послідовності, що гібридизує за жорстких умов з послідовністю з а) або б). Іншими фаголізосомальними вислизаючими поліпептидами, які можуть бути використані для таких цілей є, серед інших, гемолізин (Perfringolysin) з Clostridium perfringens (O'Brien DK, et al. Infect Immun. 2004 Sep; 72(9):5204-15); гемолізин з Vibrio, більш особливо Vibrio vulnificus (Lee SE et al., Biochem BiophysRes Commun. 2004 Nov 5; 324(1): 86-91); гемолізин/цитолізин з групи В streptococcus (Liu GY et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Oct 5;101(40):14491-14496. Epub 2004 Sep 20); гемолізин BL з Bacillus, більш особливо Bacillus cereus (Moravek Μ et al., FEMS Microbiol Lett. 2004 Sep l;238(l): 107-13); гемолізин з Bordetella, більш особливо Bordetella pertusis (Bassinet L et al., Infect Immun. 2004 Sep;72(9):5530-3); гемолізин з Escherichia coli (Wyborn NR et al., Microbiology. 2004 May;150(Pt 5): 1495- 505) і гемолізин з Shigella (Sharma К et al., Microbios. 2001;106(413):31-8). Окремо від нуклеотидної послідовності зображеної на SEQ ID No. 1, представлений винахід також включає послідовності нуклеїнової кислоти, що з нею гібридизують. В представленому 3 UA 101140 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаході, термін "гібридизація" використовується у значенні описаному в Sambrook et al. (Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104). У відповідності з представленим винаходом термін "гібридизація" використовується, якщо сигнал позитивної гібридизації може все ще спостерігатись після промивання протягом однієї години 1  SSC і 0,1% SDS при 55°С, переважно при 62°С і більш переважно при 68°С. Послідовністю, що гібридизує з нуклеотидною послідовністю згідно з SEQ ID No. 1 за таких умов промивання, є фаголізосомальний вислизаючий домен, що кодується переважною нуклеотидною послідовністю представленого винаходу. Нуклеотидну послідовність, що кодує фаголізосомальний вислизаючий домен, як описано вище, можна безпосередньо одержати з організму Listeria або з будь-якого рекомбінантного джерела, наприклад, рекомбінантної клітини Е. coli, що містить відповідну молекулу нуклеїнової кислоти Listeria або її варіант, як описано вище. Зрозуміло, що така бактеріальна клітина включає, принаймні, одну молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує фаголізосомальний вислизаючий пептид і більш особливо такою бактеріальною клітиною є клітина Mycobacterium, що включає Нlу, і яка є особливо переважною для композиції згідно з представленим винаходом. В наступному переважному втіленні, згадана бактеріальна клітина є також уреазо-дефіцитною, більш особливо ureC дефіцитною. Такий організм також згадується як BCG: rBCG ureC: Нlу або як BKG. Mycobacterium і більш особливо Mycobacterium bovis бацила Кальметта-Герена (BCG) широко використовується як доступна вакцина для профілактики туберкульозу, хоча її ефективність все ще є сумнівною. Тим не менше, погоджуються з тим, що BCG може захищати від, або, принаймні, покращувати, стан при складних формах системного туберкульозу у дітей. Однак, зараз розроблюються нові форми BCG. Винахідники знайшли, що ці нові форми BCG є особливо корисними як ад'юванти, коли вводяться разом з біологічно активним агентом і можуть, таким чином, використовуватись як перша складова комбінації згідно з представленим винаходом. Бактеріальна клітина, яка використовується як перша складова комбінації згідно з представленим винаходом, переважно є уреазо-дефіцитною. Ця риса призводить до підвищення профілю безпеки внаслідок дефіциту сечовини, мікобактеріальна клітина не повинна виживати в оточенні, де необхідна така ферментна активність, така як в фаголізосомах. Уреазо-дефіцит може бути досягнутий шляхом часткового або повного інактивування однієї або декількох клітинних молекул нуклеїнової кислоти, яка кодує субодиницю уреази, особливо ureA, що кодує субодиницю уреази A, ureB, що кодує субодиницю уреази В і/або ureC, що кодує субодиницю уреази С Послідовності ureA, ureB і ureC в Mycobacteria, особливо Μ. bovis і Μ. Tuberculosis, і протеїни, що ними кодуються, описується Reyrat et al. (1995) і Clemens et al. (1995), які включені сюди як посилання. Переважно, уреазо-дефіцитний бактеріальний штам одержують делецією і/або вставкою одного або декількох нуклеотидів в послідовності нуклеїнової кислоти, що кодують уреазну субодиницю, і/або послідовності контролю експресії. Делеції і/або вставки можна одержати за допомогою рекомбінації гомологу, вставки транспозону або за допомогою інших придатних способів. У особливо переважному втіленні, ureC послідовність є інактивованою, наприклад, шляхом створення суіцидного вектору, що містить ureC ген розбитий селекційним маркерним геном, трансформування цільової клітини вектором і дослідження селекції маркер-позитивних клітин, що мають уреазу негативного фенотипу, проводили як описано Reyrat et al. (supra). Згідно з представленим винаходом, різні види Mycobacterium можуть використовуватись як бактеріальна клітина, що утворює першу складову композиції згідно з представленим винаходом, а саме М. bovis, Μ. tuberculosis, M. microti, Μ. smegmatis, M. canettii, Μ. marinum або М. fortuitum. Також попадає в межі представленого винаходу, що можуть бути використані інші мікроорганізми, переважно, внутрішньоклітинні мікроорганізми, які проявляють одну або обидві із згаданих вище характеристик, а саме кодування або екпресія фаголізосомального вислизаючого пептиду або поліпептиду, і які є уреазо-негативними, більш особливо ureCнегативними. В наступному втіленні винаходу, відповідна бактеріальна клітина є атенуірованою. В більш переважному втіленні, бактеріальна клітина є атенуірованою, але все ще живою і більш особливо є придатною для викликання ТН1 відповіді. В більш переважному втіленні винаходу, відповідна бактеріальна клітина є живою бактеріальною клітиною. 4 UA 101140 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В наступному втіленні винаходу, бактеріальна клітина також включає, принаймні, одну молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує пептид або поліпептид здатний викликати імунну відповідь у ссавця. Як тут використовується, термін викликати імунну відповідь у ссавця означає, що при взаємодії такого пептиду або поліпептиду або його частини з імунної системою ссавця, може виникати імунна відповідь, яка є В клітинно-опосередкованою імунною відповіддю. Альтернативно, однак, імунна відповідь є Т-клітинно-опосередкованою імунною відповіддю, більш переважно МНС клас 1-обмеженою CD 8 Τ клітинною відповіддю. Більш переважно, такий пептид або поліпептид вибирають з групи, що включає аутоантигени, пухлинні антигени, вірусні антигени, паразитні антигени, бактеріальні антигени і їх імуногенні фрагменти. Переважно, імуногенним фрагментом є частина такого антигену, який все ще здатен викликати імунну відповідь. Особливо переважним антигеном є gp190/MSP1 протеїн Plasmodium, як описано тут більш детально. Наступним особливо переважним вірусним антигеном є щільні тіла HCMV, як описано тут більш детально. Ще одним наступним антигеном є антигени придатні для викликання імунної відповіді проти туберкульозу і більш специфічно проти Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, M. canettii, Μ. africanum і М. paratuberculosis. Особливо переважним антигеном є антиген 85. Такий антиген є, в переважному втіленні, другою складовою. Як відомо спеціалісту в цій галузі, коли б тут не згадувався антиген, цей термін також включає його фрагменти або мутовані форми. Його фрагменти і мутовані форми розглядаються як відповідний антиген доки така мутована форма або її фрагмент проявляє, принаймні, одну характеристику повнодовжинного або дикого антигену. Переважно, такою характеристикою є його здатність викликати імунну відповідь, більш переважно імунну відповідь, коли використовується разом або в комбінації з першою складовою або ад'ювантом, як тут описано. В навіть більш переважному втіленні, такою імунною відповіддю є специфічна CD8 імунна відповідь. Відповідно, це стосується також поліпептидів і протеїнів. Як також відомо спеціалісту в цій галузі, коли б тут не згадувалась нуклеїнова кислота і нуклеїнова кислота, що кодує поліпептид або протеїн, відповідно, термін також включає такі нуклеїнові кислоти, що кодують поліпептид або протеїн, що необов'язково є фрагментом або його мутованою формою, як переважно тут визначено, в межах виродження генетичного коду або в межах необхідності адаптації послідовності до використовуваного кодону відповідного хазяїна або продукуючого організму. Термін, що поліпептид, протеїн або антиген є похідним з організму, переважно означає, що амінокислотна послідовність відповідного поліпептиду, протеїну або антигену є послідовністю відповідного організму, де послідовність, а таким чином також і відповідна нуклеїнова кислота, що його кодує, можуть бути фрагментами і її мутованими формами. Відомо, що пептид або поліпептид здатний викликати імунну відповідь у ссавця може бути другою складовою композиції. В межах представленого винаходу, що пептид або поліпептид є частиною злитого поліпептиду. Переважно, такий злитий поліпептид включає пептид або поліпептид здатний викликати імунну відповідь у ссавця або його домен все ще має цю рису, і злитий поліпептид також включає фаголізосомальний вислизаючий домен, переважно фаголізосомальний вислизаючий домен, як описано вище, у зв'язку із втіленнями першої складової представленого винаходу. Домен поліпептиду, який здатний викликати імунну відповідь у ссавця, може бути, у випадку такого пептиду, бактеріальним антигеном, похідним від мікроорганізму, переважно, з виду Mycobacterium і більш переважно з Mycobacterium tuberculosis або з Mycobacterium bovis. Цей домен має довжину, принаймні, 6, переважно, принаймні, 8 амінокислот. Імуногенний домен переважно є частиною природного поліпептиду Mycobacterium. Однак, модифіковані імуногенні домени, які можуть бути похідними від природного імуногенного домену внаслідок заміщення, делеції і/або додавання однієї або декількох амінокислот, також знаходяться в рамках представленого винаходу. В переважному втіленні, доменом є домен gp190/MSP1 протеїну Plasmodium. У втіленні винаходу, злитий протеїн кодується молекулою рекомбінантної нуклеїнової кислоти, тобто молекули нуклеїнової кислоти згідно з SEQ ID No. 1. Ця молекула нуклеїнової кислоти включає послідовність, що кодує сигнальний пептид (нуклеотиди 1 - 120), послідовність, що кодує імуногенний домен (нуклеотиди 112 - 153), послідовність, що кодує пептидний лінкер (нуклеотиди 154 - 210), послідовність, що кодує фаголізосомальний домен (нуклеотиди 211 1722), іншу послідовність, що кодує пептидний лінкер (нуклеотиди 1723 - 1800) і послідовність, що кодує випадковий пептид (нуклеотид 1801 - 1870). Відповідна амінокислотна послідовність показана на SEQ ID No. 2. У особливо переважному втіленні, більш особливо, коли першою складовою є або rBCG:Hly, або rBCGureC:Hly, другою складовою є біологічно активний агент і, більш особливо, 5 UA 101140 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 генетично модифікована клітина. Переважно, генетично модифікованою клітиною є еукаріотична клітина. Більш переважно, така генетично модифікована клітина експресує, принаймні, один цитокін. Цитокін, як тут використовується, секретується протеїном, який впливає на поведінку і характеристики інших клітин. Переважними цитокінами є інтерлейкіни, хемокіни, лімфокіни, монокіни і фактори росту. Особливо переважними цитокінами є інтерлейкіни і інтерферони, де переважними інтерлейкінами є інтерлейкін-2, інтерлейкін-4, інтерлейкін-12, переважно інтерлейкін-2, і інтерфероном є переважно інтерферон-альфа, інтерферон-бета або інтерферон-гама, більш переважно інтерферон-гама. Як переважно тут використовується, генетично модифікованою клітиною є клітина модифікована стосовно організації генетичного матеріалу, який присутній в клітині, шляхом вставки екзогенного генетичного матеріалу. Таке модифікування організації генетичного матеріалу включає введення генетичного матеріалу ще не присутнього в клітині, для того щоб чужорідна нуклеїнова кислота стала своєю, або для активування частини ендогенного генетичного матеріалу, де такий генетичний матеріал не присутній або активний без присутності згаданого екзогенного генетичного матеріалу, де екзогенний генетичний матеріал, необов'язково, є генетичним матеріалом, але можу бути будь-яким матеріалом активним до такої міри. Способи здійснення такої модифікації добре відомі в цій галузі. Наприклад, екзогенний ДНК матеріал можна ввести в клітину за допомогою технології осадження фосфату кальцію, технології вірусного вектору, електропорації, ліпофекції, систем вірусного вектору, таких як адено-зв'язані вірусні системи, мікроін'єкції або біолістичних підходів. Результатом такого генетичного маніпулювання є генетично модифікована клітина, що буде здатна експресувати певний генний продукт, який не експресувався до цього. Винахідники знайшли, що співекспресія інтерлейкінів, і більш особливо інтерлейкін-2 і інтерферон-гама, в комбінації з бактеріальною клітиною описаною, як перша складова комбінації згідно з представленим винаходом, забезпечує дуже ефективний шлях підвищення імунної відповіді організму, більш особливо ТН1 відповіді. Окрему клітину можна вибрати з різних клітин, таких як непрофесійні клітини, що представляють антиген, професійні клітини, що представляють антиген, пухлинні клітини і дендровидні клітини. Серед цих типів клітин, пухлинні клітини є с особливо переважними. При введенні таких пухлинних клітин, ракові пацієнти, яким вводять такі пухлинні клітини, зазнають підвищення ефективності дії пухлинної вакцинації. Переважно, клітини, що використовуються для такої вакцинації, беруть з тих же самих або подібних пухлинних утворювань, як і пухлина, що лікується використовуючи комбінації згідно з представленим винаходом. Корисна дія використовуваних генетично модифікованих клітин, які, серед іншого, описані в Міжнародній заявці WO 94/18995, таким чином, підвищується при використанні бактеріальної клітини, яка складає першу складову комбінації згідно з представленим винаходом. В межах представленого винаходу, професійним антигеном представленим клітиною є дендровидна клітина, яка використовується або як біологічно активний агент, як визначено вище, або використовується як інший компонент біологічно активного агенту, де переважно в такому втіленні біологічно активним агентом є генетично модифікована клітина, більш переважно клітина, що експресує цитокін, як тут описано, де клітина навіть більш переважно спів-експресує два цитокіни і найбільш переважно інтерлейкін-2 і інтерферон-гама. Дендровидні клітини переважно вводять з антигенів з пухлини, де пухлиною є пухлина для лікування якої використовується дендровидна клітина, переважно в комбінації з ад'ювантами, як тут описано, і/або комбінації ад'ювантів і біологічно активного агенту, такого як, наприклад, згадані клітини, що співекспресують цитокіни. Введення дендровидних клітин відоме середньому спеціалісту в цій галузі, наприклад, описується Van and Hart ((2004), Cytotherapy: 6(2): 111-121.)· Такі дендровидні клітини переважно використовуються для лікування будь-якого захворювання описаного тут або окремо, або в комбінації з будь-яким з ад'ювантів описаних тут, особливо BCG і BKG, або будь-якої комбінації першої і другої складової описаної тут. Переважно, таким захворюванням є будь-яке пухлинне захворювання описане тут. Переважними пухлинами і раковими утвореннями, відповідно, на які може бути спрямоване використання такого виду підходу, є, особливо, імуногенні пухлини або ракові утворення, такі як, серед інших, меланома, реальний рак, пухлина молочної залози, пухлина мозку, пухлина простати, немілкоклітинний рак легені, рак товстої кишки і пухлина сквамозних клітин голови і шиї. Експресія цитокіну і більш особливо спів-експресія інтерлейкіну-2 і інтерферону-гама дозволяє підвищити ефективність дії пухлинних антигенів представлених генетично модифікованою клітиною. Покращення протипухлинної відповіді відбувається приблизно по двом різним механізмам, які спрямовані у тому ж самому напрямкові. З одного боку, 6 UA 101140 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 секретування IFN підвищує експресію МНС і адгезію молекул на поверхню клітини для + покращення присутності специфічних пухлинних антигенів у CD8 Т-клітині МНС І молекул і, таким чином, покращує розпізнавання пухлинних клітин Т-клітинами. З іншого боку, + секретування IL-2 в закритій близькості до пухлинних клітин підвищує активність CD8 T-клітин. Переважно, генетично модифікована клітина, що експресує, принаймні, один цитокін, є в переважному втіленні, принаймні, до деякої міри залежною від пухлини для лікування якої вона використовується. Звичайно, повинно бути зрозуміло, що інші лінії клітин також можуть бути використані, де більш переважно, що згадані клітини на додаток до генетично модифікованих, як тут описано, також експресують деякі антигени, що характеризують пухлину, що таким чином лікується. Спеціалісту в цій галузі відомо, що, в принципі, генетично модифікованою клітиною може бути аутологічна клітина. Це означає, що клітина береться від пацієнта, що лікується, використовуючи комбінацію згідно з представленим винаходом, де клітини зазвичай відбираються з пухлини, що лікується, і клітини модифікують з одержанням генетично модифікованих клітин, як тут описано. Потім, цей вид клітин вводиться пацієнтові знову як частина комбінації згідно з представленим винаходом. Для того щоб підвищити ефективність генетично модифікованих клітин, ці клітини також можуть екпресувати інші імуномолекули. Як тут використовується, імуномолекулою є будь-яка молекула, яка здатна впливати на імунну систему. Імуномолекулами є, серед інших, цитокіни, адгезійні молекули, спів-стимуляторний фактор, пухлино-зв'язаний антиген, пухлино специфічний антиген і паразитний антиген. В наступному втіленні винаходу, генетично модифікованою клітиною є алогенна клітина. Алогенною клітиною є, в переважному втіленні, клітина, яка походить від тих же самих видів, однак, не є такою ж самою. Алогенними клітинами є клітини, що є похідними від тих же самих видів, але антигенно окремими. В особливо переважному втіленні винаходу, алогенна клітина підбирається за сумісністю до відповідної популяції клітин пухлини, що лікується. Більш переважно, сумісність буде залежати від деяких або всіх класів лімфоцитного антигену людини (HLA) у пацієнтів, що лікуються, використовуючи комбінацію згідно з представленим винаходом. Однак, можуть використовуватись різні ступені сумісності. Більш особливо, сумісність буде мати HLA клас І сумісності. HLA клас І включає підкласи А, В і С Буде наданий HLA клас І сумісності, якщо є сумісність між клітиною, що використовується як друга складова композиції згідно з представленим винаходом, і клітинами, що складають пухлину у пацієнта, що лікується, використовуючи згадану композицію. Відомо, що сумісність і рамки такої необхідної сумісності знаходяться в межах знань середнього спеціаліста в цій галузі. Один з експериментальних підходів полягає у інокулюванні різним групам тварин/пацієнтів з різними ступенями сумісності з наступним аналізом впливу на пухлину. Альтернативно, тест може бути проведений безпосередньо на пухлині пацієнтів. Особливо переважною лінією клітин є LNCaP, яка спів-експресує інтерлейкін-2 і інтерферонгама і яка використовується як друга складова у поєднанні з комбінацією згідно з представленим винаходом, більш особливо для лікування раку простати, де першою складовою є rBCG:Hly або rBCGureC:Hly. В наступному втіленні винаходу, біологічно активним агентом є паразитний антиген, більш особливо gp190/MSP1 протеїн Plasmodium. Переважно, відповідний антиген є похідним від Plasmodium falciparum. Переважно, відповідний антиген є похідним амінокислотної послідовності MSP-1 протеїну Plasmodium, переважно MSP-1 протеїну Plasmodium falciparum. Термін паразитний антиген, як тут використовується, означає повнодовжинний антиген, також як і його фрагменти доки вони придатні для викликання імунної відповіді, більш переважно ТН1 відповіді або ТН1 опосередкованої відповіді, переважно у ссавця, навіть більш переважно у поєднанні з композицією згідно з представленим винаходом, де першою складовою є найбільш переважно rBCG:Hly і rBCGureC:Hly, відповідно. Це втілення особливо корисне при лікуванні малярії. В межах представленого винаходу, такий паразитний антиген може бути експресований бактеріальною клітиною, що діє як перша складова, або комбінацією згідно з представленим винаходом, або еукаріотичною клітиною, що діє як друга складова композиції згідно з представленим винаходом. Однак, це також в межах представленого винаходу, що паразитний антиген експресується бактеріальною клітиною, яка включає, принаймні, одну молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує фаголізосомальний вислизаючий пептид або поліпептид, як розкрито для різних втілень представленого винаходу. Відомо, що gp190/MSP включає декілька доменів, що зустрічаються в природі, і що такі домени або індивідуально, або в комбінації можуть бути паразитним антигеном, як тут 7 UA 101140 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 переважно використовується. gp190/MSP1 розглядається для повноти як потенційний кандидат для вакцини проти малярії. Однак, його одержання розглядається як надзвичайно важке, що перешкоджає об'ємному виробництву цього антигену. З огляду на це, одержання сильних малярійних вакцин не доступне. Однак, ґрунтуючись на рівні техніки, а саме міжнародній заявці WO 98/14583, цей антиген Plasmodium може зараз бути доступним у великих кількостях. Відомо, що такий паразитний антиген не обмежується gp190/MSP1 антигеном, але також включає його гомологи знайдені в інших видах Plasmodium не говорячи вже про Plasmodium falciparum, такий як P. vivax. Згадана міжнародна заявка включена сюди як посилання і дозволяє спеціалісту в цій галузі одержати будь-яку кількість цього антигену, що необхідний для включення в композицію згідно з представленим винаходом як другої складової. ДНК вакцини, наприклад, описуються Grode L, Mollenkopf HJ, Mattow J, Stein M, Mann P, Knapp B, Ulmer J, Kaufmann SH. Application of mycobacterial proteomics to vaccine design: improved protection by Μycobacterium bovis BCG prime-Rv3407 DNA boost vaccination against tuberculosis. Infect Immun. 2004 Nov;72(ll):6471-9. В наступному втіленні винаходу, біологічно активним агентом є часточка або група вірусних часточок або множина вірусних часточок, яка переважно вивільнюється після інфікування клітин ссавця цитомегаловірусом людини (HCMV), часточки (а) є оточеними ліпідною мембраною в яку включені вірусні глікопротеїни, і (б) не містять ні вірусну ДНК, ні капсиди, або є щільними тілами, переважно щільними тілами цитомегаловірусу людини. Такі часточки, як буде описано тут більш детально, переважно використовуються для профілактики інфікування і/або лікування цитомегаловірусу людини, який є вірусом бета-герпесу. Особливо важною групою суб'єктів, яка може лікуватись використовуючи комбінацію згідно з цим аспектом представленого винаходу є пацієнти, які мають зазнати трансплантації кісткового мозку. У імунокомпетентних осіб, HCMV інфекція зазвичай не спостерігається, при наявності більшості середніх і неспецифічних симптомів. І навпаки, в деяких групах ризику, наприклад, у імнопригнічених пацієнтів, таких як СНІД пацієнти або пацієнти з трансплантованими органами, і після пренатальної інфекції, HCMV інфекція має серйозні проявлення, які, тому, складають наступну групу пацієнтів, яка може лікуватись використовуючи комбінацію ад'юванту і відповідних часточок. У відповідності з знаннями одержаними з міжнародної заявки РСТ/ЕР 00/01794, так звані щільні тіла HCMV перевіряли на ефективність по індукуванню імунної відповіді і в кінці кінців імунного захисту від HCMV інфекції. Таким чином, згадані щільні тіла забезпечують довготривале індукування нейтралізуючих антитіл, які захищають від HCMV інфекції в штамі, що перекривається. Це забезпечується ефективним індукуванням так званих "помічників клітинної відповіді" (СО4-позитивні Τ лімфоцити) проти HCMV із сприянням розвитку Влімфоцитів, що секретують антитіла. Крім того, згадані щільні тіла є придатними для індукування утворення цитотоксичних Т-клітин проти HCMV, де лімфоцити цього типу є надзвичайно важливими для припинення HCMV інфекції, яка має місце і обмежує розповсюдження вірусу у тілі. На кінець, такі щільні тіла є придатними для зменшення побічної дії вакцини. Щільні тіла індукуються HCMV інфекцією і вивільнюються в культуральне середовище вперше інфікованих культур фібробластів людини. Вони є структурами, що можна побачити у електронний мікроскоп і більше ніж 90 % протеїнової маси яких складає рр65. Вони співставимі з вірусними часточками по присутності клітинної ліпідної мембрани модифікованої вірусними глікопротеїнами і по виділенню з клітини. Вірусні глікопротеїни в цьому конверті дуже можливо знаходяться в природній конфігурації. Оскільки щільні тіла не містять ні вірусної ДНК, ні капсид, вони не є інфекційними. Вони можуть бути сконцентрованими у великій кількості з надсосадкової рідини культури клітин за допомогою звичайних методик. Профілактичне застосування, також як і застосування як терапевтичної вакцини можуть бути реалізовані використовуючи такі щільні тіла, особливо в комбінації з ад'ювантом описаним тут. Щільні тіла оточені мембраною, яка забезпечує можливість злиття часточок з деякими клітинами ссавців, так що їх вміст попадає в цитоплазму клітини. Мембрана часточок містить вірусні глікопротеїни, які представляють головні антигени для вірус-нейтралізуючих антитіл. Часточки також характеризуються тим, що вони не містять ні вірусної ДНК, ні капсид. Крім того, вони містять вірусний Т-клітинний антиген рр65 (ppUL83), який стимулює утворення Т-хелперів і є ессенціальним антигеном для індукування цитотоксичності Тлімфоцитів (CTL) проти HCMV. Ці властивості, особливо комбінація антигенів здатна індукувати нейтралізуючі антитіла, і адекватну клітинну відповідь, робить часточки придатними як вакцини проти HCMV. Також, щільні тіла індукують незалежно від шляху введення, відповідей клітин Т-хелперів Th1 типу, які визначають їх як вакцини проти HCMV. 8 UA 101140 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В наступному втіленні винаходу, описуються щільні тіла або відповідні часточки, які містять злитий протеїн, який включає в одній з частин один або декілька сегментів вірусного Тклітинного антигену рр65 (ppUL83) або протеїн і в іншій частині один або декілька сегментів одного або декількох протеїнів. Це робить можливим оптимізування антигенності часточок оскільки цей злитий протеїн присутній у часточках у великій кількості. Додатково відомо, що експресія клітинних антигенів і гуморальної імунної відповіді в одній молекулі може чітко збільшувати антигенність. Різні сегменти рр65 і інші протеїни можуть бути злиті разом безпосередньо, але це також можливо, наприклад, для чотирьох лінкерних послідовностей, які не є природними складовими одного з включених протеїнів, присутнього між різними сегментами. Послідовності цього типу можуть виникати завдяки клонуванню або бути об'єднаними для того щоб вплинути на властивості антигену. Однак, злитий протеїн переважно не містить сторонніх послідовностей, які не є складовими одного із злитих партнерів. В таких втіленнях, злитий протеїн включає одну або більше частин рр65 і одну або більше частин одного або декількох інших протеїнів. Це стосується всіх втілень згаданих тут вище, що повний рр65 або одна або декілька його частин можуть бути присутні у злитому протеїні. Формулювання "злитий протеїн (включає) рр65", як зрозуміло, призначене не для обмеження в цій заявці тільки повним рр65. "Частина" або "сегмент" протеїну присутній у злитому протеїні включає, принаймні, 6, переважно, принаймні, 8, найбільш переважно, принаймні, 9, 15 або 20 послідовних амінокислот протеїну з якого він походить. Переважне втілення включає злитий протеїн рр65 (ppUL83) і один або більше нейтралізуючих епітопів вірусних глікопротеїнів gB або gH. Часточки цього типу можна одержати, як описано в міжнародній заявці РСТ/ЕР 00/01794. Злитий протеїн може входити, через антиген-специфічне поглинання, в глікопротеїн-специфічні В клітини, які в свою чергу містять епітоми глікопротеїнів і рр65 в контексті МНС класу II. Крім того, також можливо для частин злитого протеїну представленого професійними антиген-вмісними клітинами (АРС) в контексті МНС класу II. У обох випадках, результатом є ефективне стимулювання Т H відповіді на рр65 і на вірусні глікопротеїни. Ці ТH клітини здатні стимулювати глікопротеїн-специфічні Вклітини, які містять пептиди рр65 і вірусні глікопротеїни у контексті МНС класу II, з утворенням нейтралізуючих антитіл гологічних і гетерологічних. Крім того, часточки цього типу можуть, подібно інфекційним віріонам, бути введенні у клітини і пептиди рр65 можуть бути введенні за допомогою екзогенного введення в МНС клас І шляху. Це досягається, незвичайно для мертвих вакцин, стимулюванням CTL відповіді до HCMV. В наступному переважному втіленні, часточки містять злитий протеїн, що включає рр65 і одну або більше частин іншого протеїну HCMV, IE1 протеїн (ppUL123). Зокрема, повинні бути присутні ті частини ІЕ1 протеїну проти яких спрямовані цитотоксичні Т-клітини, що утворюються в людях під час природного інфікування. В деяких випадках, пептиди ІЕ1 протеїну представлені молекулами МНС класу І, ніж пептидами рр65. Введення таких додаткових "CTL" епітопів з ІЕ1 призначено для того щоб гарантувати, що після імунізації, інокульовані суб'єкти, які екпресують різні молекули МНС класу І, здатні генерувати CTL проти HCMV як у всебічному способі, як це можливо. В наступному переважному втіленні, часточки містять злитий протеїн, що включає рр65, один або більше нейтралізуючих епітопів HCMV глікопротеїнів і один або більше CTL епітопів ІЕ1. Злитий рр65 з нейтралізуючими епітопами і CTL епітопами призначений для гарантування, що можливе одночасно утворення обох нейтралізуючих антитіл і CTL у суб'єкті, якому вони інокульовані, в найповнішому з можливих значень, тобто у максимальної кількості людей, що відрізняють в МНС класі І. В наступному переважному втіленні, часточки містять злитий протеїн рр65 і один або більше епітопів іншого патогенну людини. Придатними частинами інших патогенів людини є антигени проти яких в людині утворюються нейтралізуючі антитіла. Можливо через злиття таких "нейтралізуючих антигенів" з Т-клітинним антигеном рр65 очікувати значне збільшення імунної відповіді (антитілогенез) порівняно з використанням виділеного "нейтралізуючого антигену". Прикладами таких "нейтралізуючих антигенів", які слід згадати, є поверхневі протеїни вірусу гепатиту В (з HBsAG регіону), вірусу гепатиту С (наприклад Е2), вірусу імунодефіциту людини (HIV, з Env регіону), вірусу грипу (гемагглютинін, нейрамінідаза, нуклеопротеїн) або інші вірусні патогени. Такими придатними патогенами людини є бактерія, така як Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria, meningitidis і інші. На кінець, антигени з еукаріотичних патогенів, таких як Plasmodia (малярія), може бути злита з рр65. В наступному переважному втіленні, часточки містять злитий протеїн, що включає рр65 і одну або більше частин протеїнів інших патогенів проти яких генерується CTL в людині на 9 UA 101140 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 природну інфекцію, яка продукує ці патогени. Прикладами таких CTL епітопів, які можна згадати, є частини протеїнів HIV-1, HBV, HCV або вірусу грипу. Винахід таким чином використовує унікальні імуногенні властивості щільних тіл для генерування захисного CTL проти гетеро логічних патогенів у людей. В наступному переважному втіленні, часточки містять злитий протеїн, що включає рр65, один або більше нейтралізуючих епітопів гетерологічного патогену і один або більше CTL епітопів того ж самого патогену. Цей злитий протеїн призначений для гарантування того, що інокульовані суб'єкти будуть здатні утворювати і захисні антитіла, і CTL проти цього патогену. Винахід додатково стосується вірусних часточок, що містять, принаймні, два різні глікопротеїни, які є варіантами того ж самого глікопротеїну з різних штамів HCMV. Переважне втілення винаходу включає як раз два варіанти, один варіант відповідає штаму Тоуна HCMV, і інший варіант відповідає штаму Ad169 HCMV. Переважне втілення винаходу включає глікопротеїн gВ і штаму Тоуна, і штаму Ad169. Ці два протеїни можна включити з ідентичною ефективністю в мембрану рекомбінантних щільних тіл в інфікованих клітинах. Такі рекомбінантні щільні тіла придатні не тільки для штамуперекриття, але також штам-специфічної нейтралізуючої імунної відповіді на два прототипи штамів HCMV. На кінець, винахідтакож стосується способу за яким одержують вірусні часточки, які повністю вільні від інфекційного вірусу. Як тут переважно використовується, термін вільний від інфекційного вірусу означає, що одержані таким чином рецептури неінфіковані до рівня детектування. Якщо часточки одержуються з популяції клітин, яка інфікована HCMV, існує ризик, що часточки інфекційного вірусу будуть присутні під час очистки часточки. Це створює проблеми для вакцини. Спосіб винаходу мінімізує цей ризик. З цією метою, спочатку одержують штам HCMV, що зазнає делеції в ессенціальному гені. Під цим розуміють делецію функціонування гену. В більшості випадків, це грунтується на відсутності продукту функціонального гену, але також можливе для порушення функціонування регуляторної послідовності гену таких шляхом, що HCMV стає не життєздатним. Це може мати місце при зміні послідовності нуклеїнової кислоти HCMV, наприклад, шляхом точкових мутацій, реальних делецій, вставок або інших мутацій. Цей дефективний вірус може реплікуватись тільки в клітинах, які експресують ген, який видалений в HCMV і, таким чином, робить його доступним для збірки варіонів. Первинні фібробласти на даний момент представляють тільки помірно пермісивну систему для in vitro реплікації HCMV. Стабільна трансфекція таких клітин на даний момент можлива тільки за допомогою способі ретровірусного трансферу. Однак, це є серйозною перепоною, якщо такі клітини будуть використовуватись для одержання вакцин. Спосіб винаходу робить доступними стабільні трансфіковані клітини, які можна одержати без переносу ретровірусного гену, але в який також може бути реплікований HCMV. Переважне втілення винаходу включає фібробласти крайньої плоті людини, які стабільно трансфіковані геном UL86 основного капсидного протеїну. Трансфекцію переважно проводять з використанням ліпід-вмісного помічника, який забезпечує дуже високу ефективність трансфекції. В переважному втіленні, для трансфекції використовують "реагент Фугена", який можна одержати від Roche Diagnostics, Mannheim. Дефективний вірус, в якому видалений гену UL86 основного капсидного протеїну, можна реплікувати в ці клітини. Якщо "недоповнені" фібробласти інфікувати цим дефективним вірусом, тоді можна виділити вільні часточки вірусної вакцини з часточок інфекційного вірусу. Іншою можливістю одержання часточок винаходу без ризику інфекції є відтворення часточок в клітинах без інфікування HCMV. З цією метою, всі гени, які кодують складники часточок повинні бути експресовані в цих клітинах. З цією ціллю ці гени повинні бути вставлені в клітини. Переважно з цією цілю використовували клітини комах інфіковані бакуловірусами. Гени, які кодують поліпептидні складові часточок, клонували в бакуловірусних векторах експресії. Продування рекомбінантних бакуловірусів відбувалось із спів-інфікуванням клітин комах, переважно Sf9 клітини, різними вірусами. Гени експресували в клітинах комах і одержані полі пептиди одержували одержуючи бажані часточки. На кінець, часточки виділяли з клітин комах. Це розкриває одну з можливостей одержання неінфікованих часточок, які можна використати як вакцини. Альтернативною можливістю є клонування складових необхідних для відтворення щільних тіл у рекомбінантних бакуловірусах під контролем основного IE промотора/підсилювача (МІЕР) HCMV. Видно, що рекомбінантні бакуловіруси здатні інфікувати вищі еукаріотичні клітини, такі як, наприклад, клітини ссавців, і що інородні гени під контролем сильного еукаріотичного промотора, такого як МІЕР, сильно експресуються в таких клітинах. Перевагою такої процедури 10 UA 101140 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 буде те, що будь-які важливі модифікації, такі як глікозилювання, антигенних протеїнів щільних тіл будуть відбуватись більш природним чином в клітинах ссавця, ніж в клітинах комах. Крім того, існує ряд таких ліній клітин, які вже досліджені на придатність для одержання вакцини. В наступному втіленні винаходу, біологічно активним агентом є антигенпредставляюча клітина, де така антигенпредставляюча клітина представляє антигени придатні для викликання імунної відповіді проти туберкульоз і більш специфічно проти Mycobacterium tuberculosis, Μ. bovis, Μ. canettii, Μ. africanum і Μ. paratuberculosis. В переважному втіленні антигенпредставляючою клітиною є мікроорганізм, більш переважно мікроорганізм, що вибирають з групи, яка включає М. tuberculosis, Μ. bovis, M. canettii, Μ. africanum і М. paratuberculosis. Комбінація у відповідності з представленим винаходом включає бактеріальну клітину як першу складову і таку антигенпредставляючу клітину або такий антиген сам по собі як другу складову або як біологічно активний агент, може переважно бути використана для профілактики і/або лікування туберкульозу. Переважно, антигеном є антиген 85. В межах представленого винаходу, що перша складова композиції згідно з представленим винаходом в її різних формах описаних тут і, зокрема, мікроорганізми, що мають фаголізосомальний вислизаючий домен в їх різних втіленнях, таких як rBCG:Hly і rBCG ureC: Hly, діє і може таким чином використовуватись як ад'ювант, який є засобом, що відповідає за підвищення імунного статусу пацієнта, що лікується, або потребує лікування, більш переважно імунний статус стосується ТН1 і навіть більш переважно імунний статус характеризується підсиленням ТН1 відповіді, де така ТН1 відповідь підсилюється порівняно з необробленою особою. Як тут описано, друга складова є переважно фізично іншою або фізично відокремленої від першої складової оскільки вона є агентом, який призначений для специфічної біологічної, біохімічної, фізіологічної або медичної відповіді пацієнта. Дійсно, перша і друга складова є фізично розділеними, що дозволяє незалежне або окреме введення згаданих двох складових. У випадку коли біологічно активним агентом є генетично модифікована клітина, яка експресує цитокін і більш переважно такою клітиною є ракова клітина, специфічна імунна відповідь спрямована на антигени введенні в таку генетично модифіковану клітину. Тим не менше, відомо, що цитокіни завдяки їх способу дії забезпечують загальну прийнятну дію, яка можна розцінювати також як допоміжну дію, як вже забезпечується першою складовою. В наступному аспекті представлений винахід стосується фармацевтичної композиції, що містить комбінацію згідно з представленим винаходом і, необов'язково, фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або ад'юванти або інші наповнювач(і). Переважно, такі носії, розріджувачи, ад'юванти і наповнювачі є інертними і нетоксичними. Фармацевтична композиція, в її різних втіленнях, адаптована для введення різними шляхами. Таке введення включає системне і локальне введення, також як і оральне, підшкірне, парентеральне, внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, внутрішньом'язове, інтраперітоніальне, інтраназальне, інтратегральне і інтраокулярне. Переважна фармацевтична композиція є рідиною або фізіологічним буфером, що містить першу і другу складову. Спеціалісту в цій галузі зрозуміло, що кількість фармацевтичної композиції, що вводиться, залежить від клінічного стану окремого пацієнта, місця і способу введення, розкладу введення, віку пацієнта, статі, ваги тіла і інших факторів відомих медикам. Таким чином, фармацевтично ефективна кількість для цілей профілактики і/або лікування визначається виходячи з таких міркувань які відомо в цій галузі. Переважно, кількість є ефективною для досягнення покращення включаючи, але не обмежується, покращення хворобливого стану або забезпечення більш швидкого відновлення, покращення або усунення симптомів і інших показників як вибрано прийнятним вимірюванням спеціалістом в галузі медицини. В переважному втіленні, фармацевтична композиція згідно з представленим винаходом може включати інші фармацевтично активні сполуки. Фармацевтична композиція переважно формулюється таким чином, що забезпечує одиничну дозу для введення або багатодозове введення. У втіленні винаходу, перша складова і друга складова або як такі, або як частина фармацевтичної композиції, або як фармацевтична композиція, представлені одночасно, або як одинична рецептура, або як окрема рецептар кожної складової. У випадку окремої рецептури, перша рецептура містить першу складову і друга рецептура містить другу складову. Згадана перша і згадана друга рецептура, відповідно, є, в переважних втіленнях, сформованими як будь-яка з фармацевтичних рецептур описаних тут. Це також в межах представленого винаходу, що перша і друга складова, відповідно, вводяться окремо. Переважно, різниця в часі введення першої і другої складової, відповідно, 11 UA 101140 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 становить приблизно одну годину або менше ніж одну годину, переважно приблизно 30 хвилин або менше, і більш переважно приблизно 15 хвилин або менше. Зрозуміло, що також в межах представленого винаходу, що або перша або друга складова або обидві складові можуть, в різних формах, як тут описано, бути використані для профілактики будь-якого із захворювань описаних тут. Представлений винахід надалі ілюструється з посиланням на малюнки і приклади з яких можна взяти додаткові ознаки, втілення і переваги винаходу, де на Фіг. 1 показана діаграма, що зображає імунну відповідь виражену як CD8 + Tet + Τ клітини при спільному введенні BKG і вакцини порівняно з контролем; на Фіг. 2-4 показані схеми імунізації для профілактичної вакцинації пухлини; на Фіг. 5-7 показані схеми імунізації для терапевтичної вакцинації пухлини; і Фіг. 8 і 9 є діаграми, що зображають дію різних схем імунізації на ряд IFN-гама позитивних CD8 Τ клітин при стимулюванні використовуючи різні пептиди. Приклад 1: Застосування BKG як ад'юванту для пухлинної вакцини. В цих експериментальних прикладах описується визначення придатності BKG як ад'юванту для пухлинної вакцини. BKG, як згадується тут, експресує фаголізосомальний вислизаючий пептид з Listeria monocytogenes (Hly) і є додатково ureC дефіцитним. Такий модифікований BCG також згадується тут як rBCG: delta ureC: Hly. В основному, пацієнти і тваринні моделі, відповідно, вакцинували за стандартним протоколом вакцинації, який також згадується як первинна вакцинація. Після цього, тваринам вводять пухлину. За таких умов, у тварин вакцинованих BKG/пухлина клітина не спостерігався ріст пухлини або вони можуть довше опиратись розвитку пухлини, ніж тварина, якій проводили пухлинну вакцинацію без BKG як ад'юванту. Пацієнти вакциновані BKG/пухлинна клітина можуть довше опиратись пухлині порівняно з пацієнтами, яким проводили пухлинну вакцинацію без BKG як ад'юванту. Якщо не вказано інше, використовували наступні матеріали і способи. Клітини: mOVA Використовували наступні лінії клітин: J558 (J558-клітини, що експресують OVA і мають sOVA зв'язувати її з клітинною мембраною), J558 (J558-клітини, що експресують OVA і декретують OVA її в оточуюче середовище) і EL-4 (EL-4-клітини, що експресують OVA). Культури клітин спочатку витримували з G418 протягом 14 днів. Mycoplasma-тест був негативним. Після початку 6 пасажування для збільшення кількості клітин, ці лінії клітин заморожували порціями 10x10 з ДМСО і зберігали в рідкому N2 протягом, принаймні, 7 днів перед першим використанням в тварині. Бактерія Використовувану бактерію мітили: BKG (rBCG delta ureC:Hly); надалі згадується як "BKG". BKG вирощували в 7Н9 повному Середовищі і заморожували в 10 % гліцерин/PBS. Бактерію можна розморозити і заморозити один раз (але заморожувати тільки без розведення). 6 Для первинної вакцинації і наступних 2 ревакцинацій 19,3 мкл = 1x10 BKG вводили в мишу. Одержання вакцини: Заморожені клітини розморожували і двічі промивали стерильним DMEM середовищем. Після цього, клітини суспендували в стерильному DMEM і підраховували. Загальний об'єм ін'єктування складав 100 мкл (одержували згідно з Таблицею 1). Перед ін'єктуванням клітини опромінювали в стерильному шприці (150 Gy гама опроміненням). In vitro контролях: 3 розморожених клітин перед опроміненням і після опромінення, відповідно, відбирали одну аліквоту клітин і вводили в культуру клітин. Ці контролі показують добре відновлення після розморожування (неопромінені клітини) і відсутність проліферації клітин протягом більше ніж 14 днів після опромінення. Миші: С57/В6 самиць 12 тижнів (доставляли у віці 6 тижнів і поміщали на 6 тижнів в лабораторію для тестування); вакцинували п.ш. 100 мкл; голка 25 G; у основи хвоста; через 7 днів відбирали 0,3 мл крові для імуномоніторингу (тетраметр для OVA) при загальній анестезії. Використовуваних мишей приймало відповідне керівництво. Порядок BKG експ. #1: день 0 первинна вакцинація (Початок) ий 7 днів 1 відбір крові а ий 28 днів 1 ревакцинація (1 Повтор) ий 35 днів 2 відбір крові а ий 53 днів 2 ревакцинація (2 Повтор) ій 60 днів 3 відбір крові 74 днів введення пухлини 12 UA 101140 C2 5 Використовуваних мишей розділяли на 2 експериментальні і одну контрольну групи: • група, що одержувала вакцину, плюс BKG (n = 9): підгрупи #1.1, #1.3 і #1.5 (дивіться таблицю 1) • група, що одержувала вакцину, мінус BKG (n = 9): підгрупи #1.2, #1.4 і #1.6 • контрольна група (n = 2): підгрупа #1.7 Таблиця 1 Підгрупи і ін'єктовані вакцини Експ. група #1.1 #1.2 #1.3 #1.4 #1.5 #1.6 #1.7 10 15 20 25 30 35 Клітини mOVA J558 mOVA J558 sOVA J558 sOVA J558 OVA EL-4 OVA EL-4 Конт. BKG + + + DMEM [мкл] 100 BKG [n] 6 1x10 6 1x10 6 1x10 BKG [мкл] 19,3 19,3 19,3 Клітини [n] 6 10x0 6 1x10 6 1x10 6 1x10 6 1x10 6 1x10 Клітини [мкл] 80,7 100,0 80,7 100 80,7 100,0 n= 3 3 3 3 3 3 2 20 Тримання тварин: 32-умови, IVC-клітки, 2 клітки; періодичність заміни 3-4 дні. FACS аналіз: FACS проводили для визначення кількості SIINPEKEL-специфічних Τ клітин в сліпому методі. Після сортування клітинні компоненти плазми заморожують і зберігають для наступного аналізу при -80 °С. Паралельні In vitro-експерименти: Культура клітин що генерує клітини для вакцинації і введення пухлини Клітини in vitro-контролю, що використовуються без тваринних експериментів Клітини культур клітин, що використовуються як контролі в FACS експериментах, що продукують тетраметри Вектрологія Вектор (SINвектор) позначали рекомбінант для IL-2, IFNгама і OVA. Цей вектор використовували для створення лінії клітин пухлини мишей, що відповідає LNCaP-IL-2-IFNгама клітинам. Результати: Перші результати імунологічного контролю зображені на Фіг. 1 вказують на те, що є тенденція до вищих кількостей Т-клітин здатних розпізнавати OVA-пептид в групі мишей, що мають BKG як ад'ювант, ніж в групі тварин, які не мали ад'ювант. Це підтверджує, що BKG є ад'ювантом для пухлинної вакцинації, яка підсилює імунологічну відповідь на вакцину. Приклад 2: Оптимізація режиму обробки для пухлинної вакцинації використовуючи BKG Далі приведений протокол оптимізації режиму введення терапевтичної концепції приведеної в прикладі 1 для того щоб спеціаліст в цій галузі оптимізував основний режим лікування описаний тут. Матеріали і способи приводяться у поєднанні з прикладом 1, вище, якщо не вказано інше. Режим 1: b Використовуючи стабільно тричі-трансфіковану J558 (Н2K ) лінію клітин, що експресує IL-2, b EFNгама і овалбумін, три різні дози цих клітин ін'єктували мишам (С57 BL/6 (Н2K )), а саме: 6 6 6 5x10 -клітин, 10x10 -клітин і 15x10 -клітин. Для кожної дози, група мишей містила п'ять тварин і їх схема ін'єкцій була наступною: первинна імунізація з трьома повтореннями кожні 30 днів; де 6 ін'єкції були з або без BKG (1x10 CFU). Проводили імунологічні дослідження тварин в будьякому випадку вони показували овалбумін-специфічну імунну відповідь і, зокрема, підвищення імунної відповіді опосередкованої BKG. Режим 2 Цей дослід складається з ряду Попередніх експериментів ("Попередні експерименти 1-7") і чотирьох основних експериментів ("Експерименти 1-4"). Попередній експеримент 1: Встановлення дози пухлинної вакцини з і без BKG як ад'юванту. b Загалом 14 груп мишей кожна з яких включає п'ять мишей (С57 BL/6 (Н2K )) імунізували пухлинною вакциною в дозах, що збільшуються, (кожна 2 з 14 груп одержувала ту ж саму дозу 13 UA 101140 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пухлинної вакцини). Пухлинна вакцина включає опромінений овальбумін, що експресується b 6 алогенними J558 пухлинними клітинами (Н2K )), які ін'єктували п.ш.. BKG в дозі 1x10 CFU ін’єктували разом з пухлинними клітинами семи групам. Через один тиждень, також як і 5, 9 і 13 тижнів, відбирали 0,5 мл крові у кожної тварин і визначали овальбумін-специфічну імунну реакцію за допомогою ELISA, мічення внутрішньоклітинного цитокіну або мічення тетрамеру. Загалом використовували сім різних дозувань клітин пухлинної вакцини з або без BKG. 6 6 6 6 6 6 6 Відповідними дозами є 0,1x10 , 0,5x10 , 1,0x10 , 5,0x10 , 10,0x10 , 50,0x10 , 100x10 , де у відповідних клінічних дослідженнях на людині використовують дозування з переважним 6 6 інтервалом від 10x10 до 300x10 клітин. Миші з 2 контрольних груп не одержували пухлинну вакцину. Одна контрольна група одержувала ін'єкцію BKG. Попередній експеримент 2: Встановлення дози в тесті з B16OVA меланомою) b В цьому дослідженні, чотири групи мишей (С57 ВL/6(Н2K )) одержували дози досліджуваної пухлини (B16OVA меланома п.ш.). Ріст пухлини контролювали до об'єму пухлини більше 2 см. Після досягнення цього об'єму пухлини, мишей умертвляли, відбирали кров і тканину пухлини і зберігали для in vitro аналізу. Якщо ріст пухлини не відбувався, мишей умертвляли через 12 тижнів. Знову, кожан група містила п'ять мишей, і використовували чотири різні дозування 6 6 6 6 клітин тестованої пухлини, а саме: 1,0x10 клітин, 5,0x10 , 10,0x10 і 50,0x10 клітин. Попередній експеримент 3: Визначення дози ад'юванту Виходячи з дози визначеної в Попередньому експерименті 1, дозу BKG змінювали, де доза ад'юванту змінювали з коефіцієнтом 10, 100 і 1000 і 0,1, 0,01 і 0,001 порівняно з дозою, яка використовується в Попередньому експерименті 1. Через один тиждень, також як і 5, 9 і 13 тижнів, відбирали 0,5 мл крові у кожної тварин і визначали овальбумін-специфічну імунну реакцію за допомогою ELISA, мічення внутрішньоклітинного цитокіну або мічення тетрамеру. Попередній експеримент 4: Дослідження шляху введення Дозу клітин пухлинної вакцини, що визначали в Попередньому експерименті 1 і дозу BKG, що визначали в Попередньому експерименті 3, змінювали в залежності від шляху введення. Шляхами введення були внутрішньовенний, внутрішньошкірний, внутрішньоочеревенний і іпсилатеральний п.ш.. Для кожного шляху введення доза BKG є або однократною, 0,1 кратною або 0,01 кратної дози, як визначено в Попередньому експерименті 3. Способи введення досліджені тут є подібними до потенційно клінічно використовуваних стосовно людей і відрізняються відносно частини імунної системи, яка першою контактує з ад'ювантом. Через один тиждень, також як і 5, 9 і 13 тижнів, відбирали 0,5 мл крові у кожної тварин і визначали овальбумін-специфічну імунну реакцію за допомогою ELISA, мічення внутрішньоклітинного цитокіну або мічення тетрамеру. Попередній експеримент 5: Дослідження схеми імунізації Використовуючи дозування клітин пухлинної вакцини як визначено в Попередньому експерименті 1 і дози BKG визначені в Попередньому експерименті 3 досліджували наступні схеми імунізації: 1. Схема імунізації 1: одичне спільне ін'єктування пухлинної вакцини і ад'ювантів (контрольні групи) 2. Схема імунізації 2: ця схема відповідає профілактичній імунізації деяких захворювань подібних кіру, де має місце потрійна основна імунізація і повторна імунізація, де основну імунізацію проводять на початку, два тижні і чотири тижні і повторну імунізацію проводять через ще шість тижнів. 3. Схема імунізації 3: цій схемі відповідає схема, яка є оберненою до первинної терапевтичної вакцинації, що проводиться разом з постійним введенням вакцин з певним інтервалом вакцинацій. Більш специфічно, можуть бути описані три наступні підсхеми. Схема імунізації 3а: вакцинація кожні 3 тижні (завершальний відбір крові і евтаназія через 12 тижнів); Схема імунізації 3b: вакцинація кожні 6 тижнів (завершальний відбір крові і евтаназія через 25 тижнів); Схема імунізації 3с: вакцинація кожні 12 тижнів (завершальний відбір крові і евтаназія через 43 тижні). Всі три схеми імунізації повторювали, де доза ад'юванту BKG є або дозою визначеною в Попередньому експерименті 3, або її 10-кратною або 0,1-кратною дозою. Попередній експеримент 6: Визначення дози пухлинної вакцини (TRAMP) з і без BKG Загалом 12 груп TRAMP мишей (Jackson Laboratory Lines Nos. 003135) вакцинували 0,1кратною, 1-кратною і 10-кратною дозою клітин пухлинної вакцини TRAMP-C1 визначеної в 6 літературі (5x10 клітин). Клітини пухлинної вакцини використовували або без будь-якого генетичного модифікування (wtTRAMP), або як IL-2/TFNгама трансфіковані клітини. Мишей 14 UA 101140 C2 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6 7 імунізували п.ш. використовуючи 5x10 , 5x10 і 5x10 TRAMP клітини. Шість груп одержували 6 1x10 CFU BKG як активний ад'ювант разом з клітинами пухлинами. Через один тиждень після імунізації і потім через кожні шість тижнів відбирали 0,5 мл крові і визначали TRAMP-C1специфічну імунну реакцію за допомогою ELISA, мічення внутрішньоклітинного цитокіну або мічення тетрамеру. Кожні дванадцять тижнів проводили СТ (комп'ютерна томографія) для контролювання розвитку захворювання. TRAMP мишей, які мали справжній рак простати умертвляли у віці 32-35 тижнів для того щоб уникнути зайвих страждань звірів. Для того щоб визначити завдяки якій з вакцин спостерігаються зміни у розвитку захворювання, мишей слід спостерігати до 40-ого тижня. Попередній експеримент 7: Дослідження дози ад'юванту Дозу клітин пухлинної вакцини визначену в Попередньому експерименті 6 змінювали відносно дози BKG (0,1-кратна, 1-кратна і 10-кратна доза BKG визначена в Попередньому експерименті 6). Аналогічно до Попереднього експерименту 6 досліджували wtTRAMP-C1 також як і генетично модифіковані IL-2/IFNгама-TRAMP-C1 клітини. Через один тиждень після імунізації і потім кожні шість тижнів, у тварин відбирали 0,5 мл крові і визначали TRAMP-C1специфічну імунну реакцію за допомогою ELISA, мічення внутрішньоклітинного цитокіну або мічення тетрамеру. Кожні дванадцять тижнів проводили СТ для контролювання розвитку захворювання. Завершальний відбір крові і евтаназію проводили на 40 тижні. Експеримент 1: Профілактична вакцинація пухлини використовуючи систему овальбуміну b C57BL/6 мишей (Н2K ) імунізували використовуючи вакцину клітин пухлини, тобто b опромінені алогенні J558 клітини пухлини (Н2K ), що експресують овальбумін, з дозою як визначено в Попередньому експерименті 1. Деякі тварини одержували активний ад'ювант BKG (доза визначена в Попередньому експерименті 3) разом з вакциною пухлини. Через один тиждень у тварин відбирали 0,5 мл крові і визначали овальбумінспецифічну імунну відповідь за допомогою ELISA, мічення внутрішньоклітинного цитокіну або мічення тетрамеру. Через ще чотири тижні визначали реактивність імунної системи проти живих клітин пухлини за допомогою п.ш. ін'єкції овальбуміну, що експресується В16 клітинами пухлини і регулярного контролювання росту пухлини використовуючи дозу клітин пухлини, що відповідає одній з визначених в Попередньому експерименті 2. Крім того, дію BKG на підсилення пухлино-специфічної імунної реакції порівнюють з диким типом BCG бактерії. Як спосіб введення використовують найкращий спосіб як визначено в Попередньому експерименті 4 в комбінації з двома оптимальними схемами імунізації визначеними в Попередньому експерименті 5, що включають найкращу схему первинної повторної імунізації і найкращу схему постійного введення. Експеримент 2: Терапевтична пухлинна вакцинація використовуючи систему овальбуміну На відміну від профілактичної пухлинної імунізації як описано в експерименті 1, ріст пухлини b ініційований в C57BL/6 мишах (Н2K ) за допомогою п.ш. ін'єкції неопромінених клітин пухлини, що тестуються, використовуючи дозу як визначено в Попередньому експерименті 2. Тестували пухлину, що має діаметр 0,5 см використовуючи схеми вакцинації описані в Експерименті 1. Тести зупиняли коли розмір пухлини досягав діаметру 2 см. Однак, тварин контролювали максимум один рік. Для того щоб відобразити наявні імунологічні процеси, у мишей кожні чотири тижні відбирали зразки крові по 0,5 мл для того щоб визначити імунну відповідь як визначено в експерименті 1. Експеримент 3: Профілактична пухлинна вакцинація (TRAMP) TRAMP мишей проявляють першу внутрішньоепітеліальною неоплазією на шостому сьомому тижні і виражену клінічну картину карциномою простати, що починається на 15-ому тижні. Така карцинома простати локально обмежується на початку, але починаючи з 24 тижня у приблизно 10 % тварин розвиваються метастази і складне захворювання можна очікувати починаючи з 32-35 тижня. Профілактичну пухлинну вакцинацію починають з 5-ого тижня. Використовують одиничну ін'єкцію вакцини клітин пухлини без ад'юванту і з ад'ювантами. Як вакцину клітин пухлини використовують летально опромінені TRAMP-C1 клітини, які є лінією клітин карциноми простати, що є похідною від TRAMP мишей. Використовуваними клітинами пухлини вакцини є або генетично модифіковані (wtTRAMP) або IL-2/IFNгама-трансфіковані клітини. Додатково тестували дві найкращі схеми імунізації (схема первинної імунізації і довготривала схема) як визначено в Попередніх експериментах. Як контроль розвитку PC, тварин слід піддавати СТ кожні дванадцять тижнів. Можна вирізнити наступні групи: HV3.1 без вакцинації (контрольна група) HV3.2 тільки пухлинна вакцина (wtTRAMP-C1 клітини) п. ш. HV3.3 BKG вакцина (wtTRAMP-C1 клітини + BKG) п. ш. HV3.4 BCG вакцина (wtTRAMP-C1 клітини + BCG) п. ш. 15 UA 101140 C2 тільки пухлинна вакцина (wtTRAMP) як первинна імунізація як визначено в Попередньому експерименті 5 HV3.6 BKG вакцина (wtTRAMP) як первинна імунізація як визначено в Попередньому експерименті 5 HV3.7 BCG вакцина (wtTRAMP) як первинна імунізація як визначено в Попередньому експерименті 5 HV3.8 тільки пухлинна вакцина (wtTRAMP) як довготривала імунізація як визначено в Попередному експерименті 5 HV3.9 BKG вакцина (wtTRAMP) як довготривала імунізація як визначено в Попередньому експерименті 5 HV3.10 BCG вакцина (wtTRAMP) як довготривала імунізація як визначено в Попередньому експерименті 5 HV3.11 тільки пухлинна вакцина (IL2/IFNгама-TRAMP-C1 клітини) п. ш. HV3.12 BKG вакцина (IL2/IFNгама-TRAMP-C1 клітини + BKG) п. ш. HV3.13 BCG вакцина (IL2/IFNгама-TRAMP-C1 клітини + BCG) п. ш. HV3.14 тільки пухлинна вакцина (TL2/IFNгама-TRAMP) як первинна імунізація як визначено в Попередньому експерименті 5 HV3.15 BKG вакцина (IL2/lFNгама-TRAMP) як первинна імунізація як визначено в Попередньому експерименті 5 HV3.16 BCG вакцина (IL2/IFNгама-TRAMP) як первинна імунізація як визначено в Попередньому експерименті 5 HV3.17 тільки пухлинна вакцина (IL2/IFNгама-TRAMP) як довготривала імунізація як визначено в Попередньому експерименті 5 HV3.18 BKG вакцина (BL2/IFNгама-TRAMP) як довготривала імунізація як визначено в Попередньому експерименті 5 HV3.19 BCG вакцина (IL2/IFNгама-TRAMP) як довготривала імунізація як визначено в Попередньому експерименті 5 Схема імунізації груп HV3.2 - HV3.4 і HV3.11 - HV3.13 зображена на Фіг. 2 з чисельними позначеннями 1: народження мишей; тижнів - 5 2: вакцинація; час 0 (миші у віці 5 тижнів) 3: відбір зразка крові через один тиждень 4: відбір зразка крові через сім тижнів 5: відбір зразка крові і СТ через 13 тижнів 6: відбір зразка крові через 19 тижнів 7: відбір зразка крові і СТ через 25 тижнів 8: відбір зразка крові через 31 тиждень 9: відбір зразка крові і СТ через 37 тижнів 10: відбір зразка крові через 40 тижнів і евтаназія мишей Схема імунізації груп HV3.5 - HV3.7 і HV3.14 - HV3.16 зображена на Фіг. 3 з чисельними позначеннями 1: народження мишей; тижнів - 2 2: вакцинація; час 0 (первинна І) 3: відбір зразка крові через один тиждень 4: вакцинація через два тижні (первинна II) 5: вакцинація через чотири тижні (первинна III) (у віці 6 тижнів) 6: відбір зразка крові через п'ять тижнів 7: вакцинація через десять тижнів (ревакцинація) (у віці 12 тижнів) 8: відбір зразка крові і СТ через один тиждень після ревакцинації 9: відбір зразка крові через сім тижнів після ревакцинації 10: відбір зразка крові і СТ через 13 тижнів після ревакцинації 11: відбір зразка крові 19 через тижнів після ревакцинації 12: відбір зразка крові і СТ через 25 тижнів після ревакцинації 13: відбір зразка крові через 28 тижнів після ревакцинації (у віці 40 тижнів) і евтаназія мишей Схема імунізації груп HV3.8 - HV3.10 і HV3.17 - HV3.19 зображена на Фіг. 4 з чисельними позначеннями 1: народження мишей; тижнів -2 2: перша вакцинація; час 0 3: відбір зразка крові через один тиждень HV3.5 5 10 15 20 25 30 16 UA 101140 C2 5 10 15 20 25 4: друга вакцинація через шість тижнів (інтервал вакцинацій як визначено в Попередньому експерименті 5) 5: відбір зразка крові через один тиждень 6: третя вакцинація через дванадцять* тижнів 7: відбір зразка крові і СТ через один тиждень 8: четверта вакцинація через 18* тижнів 9: відбір зразка крові через один тиждень 10: п'ята вакцинація через 24* тижнів 11: відбір зразка крові і СТ через один тиждень 12: шоста вакцинація через 30* тижнів 13: відбір зразка крові через один тиждень 14: відбір зразка крові через шість тижнів 15: відбір зразка крові через 40 тижнів і евтаназія мишей * інтервал вакцинацій залежить від результатів Попереднього експерименту 5 Експеримент 4: Терапевтична пухлинна вакцинація (TRAMP) У всіх TRAMP мишей починає рости пухлина простати з 15 тижнів, яка повністю розвивається до 32 тижня і викликає клінічні проблеми у тварин. Тому, тварин імунізують на 24 тижні. Експеримент зупиняють коли реалізується один із стоп-критеріїв. Максимум, тварин досліджують протягом 40 тижнів. Для того щоб контролювати імунологічні процеси у мишей кожні шість тижнів відбирають 0,5 мл крові і досліджують імунну відповідь як описано у зв'язку з експериментом 1 і використовують таку методику візуалізації як СТ, кожні дванадцять тижнів. Використовують ті ж самі клітини пухлин як описано у зв'язку з експериментом 3. Тестували наступні групи. HV4.1 без вакцинації (контрольна група) HV4.2 тільки пухлинна вакцина (wtTRAMP-C1 клітини) п. ш. HV4.3 BKG вакцина (wtTRAMP-C1 клітини + BKG) п. ш. HV4.4 BCG вакцина (wtTRAMP-C1 клітини + BCG) п. ш. HV4.5 тільки пухлинна вакцина (wtTRAMP) як первинна імунізація як визначено в Попередньому експерименті 5 HV4.6 BKG вакцина (wtTRAMP) як первинна імунізація як визначено в Попередньому експерименті 5 HV4.7 BCG вакцина (wtTRAMP) як первинна імунізація як визначено в Попередньому експерименті 5 HV4.8 тільки пухлинна вакцина (wtTRAMP) як довготривала імунізація як визначено в Попередньому експерименті 5 HV4.9 BKG вакцина (wtTRAMP) як довготривала імунізація як визначено в Попередньому експерименті 5 HV4.10 BCG вакцина (wtTRAMP) як довготривала імунізація як визначено в Попередньому експерименті 5 HV4.11 тільки пухлинна вакцина (IL2/IFNгама-TRAMP-C1 клітини) п. ш. HV4.12 BKG вакцина (IL2/IFNгама-TRAMP-C1 клітини + BKG) п. ш. HV4.13 BCG вакцина (IL2/IFNгама-TRAMP-C1 клітини + BCG) п. ш. HV4.14 тільки пухлинна вакцина (IL2/IFNгама-TRAMP) як первинна імунізація як визначено в Попередньому експерименті 5 HV4.15 BKG вакцина (IL2/IFNгама-TRAMP) як первинна імунізація як визначено в Попередньому експерименті 5 HV4.16 BCG вакцина (IL2/IFNгама-TRAMP) як первинна імунізація як визначено в Попередньому експерименті 5 HV4.17 тільки пухлинна вакцина (EL2/IFNгама-TRAMP) як довготривала імунізація як визначено в Попередньому експерименті 5 HV4.18 BKG вакцина (IL2/IFNгама-TRAMP) як довготривала імунізація як визначено в Попередньому експерименті 5 HV4.19 BCG вакцина (IL2/IFNгама-TRAMP) як довготривала імунізація як визначено в Попередньому експерименті 5 На Фіг. 5 показана схема імунізації 1 для груп HV4.2 - HV4.4 і HV4.11 - HV4.13 з чисельними позначеннями. 1: народження мишей 2: відбір зразка крові через шість тижнів 3: відбір зразка крові і СТ через дванадцять тижнів 4: відбір зразка крові через 18 тижнів 17 UA 101140 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5: вакцинація через 24 тижнів 6: відбір зразка крові і СТ через 25 тижнів 7: відбір зразка крові через 30 тижнів 8: відбір зразка крові і СТ через 36 тижнів 9: відбір зразка крові через 40 тижнів і евтаназія мишей На Фіг. 6 показана схема імунізації 2 для груп HV4.5 - HV4.7 і HV4.14 - HV4.16 з чисельними позначеннями. 1: народження мишей 2: відбір зразка крові через шість тижнів 3: відбір зразка крові і СТ через дванадцять тижнів 4: відбір зразка крові через 18 тижнів 5: вакцинація через 24 тижнів (первинна І) 6: відбір зразка крові і СТ через 25 тижнів 7: вакцинація через 26 тижнів (первинна II) 8: вакцинація через 28 тижнів (первинна III) 9: відбір зразка крові через 30 тижнів 10: вакцинація (ревакцинація) через 34 тижні 11: відбір зразка крові і СТ через 36 тижнів 12: відбір зразка крові через 40 тижнів і евтаназія мишей На Фіг. 7 показана схема імунізації 3 для груп HV4.8 - HV4.10 і HV4.17 - HV4.19 з чисельними позначеннями. 2: відбір зразка крові через шість тижнів 3: відбір зразка крові і СТ через дванадцять тижнів 4: відбір зразка крові через 18 тижнів 5: вакцинація через 24 тижнів (первинна І) 6: відбір зразка крові і СТ через 25 тижнів 7: вакцинація через 30 тижнів (первинна II) 8: відбір зразка крові через 31 тиждень 9: вакцинація через 36 тижнів (первинна III) 10: відбір зразка крові і СТ через 37 тижнів 11: вакцинація через 42 тижні (первинна IV) 12: відбір зразка крові через 43 тижнів і евтаназія мишей Інтервали вакцинації переважно залежать від результатів Попереднього експерименту 5. Приклад 3: Композиція для лікування рака простати Композиція яка придатна для лікування рака простати містить як першу складову BCG, яка експресує фаголізосомальний вислизаючий пептид з Listeria monocytogenes (НІу) і є додатково ureС-дефіцитною. Така модифікована BCG також згадується тут як rBCG: delta ureC: Hly. Композиція містять як другу складову генетично модифіковані LNCaP клітини. Ці клітини є клітинами карциноми простати, що експресують рекомбінантний інтерлейкін-2 (IL2) і інтерферон-гама (IFN гама). Переважно, такі LNCaP клітини експресують обидва цитокіни в приблизно еквімолярних кількостях. Цей вид LNCaP клітин, наприклад, описується в міжнародній заявці WO 94/18995. Такі рекомбінантні клітини рака простати опромінювали перед використанням гама-променями для того щоб зруйнувати їх здатність до реплікації. Обидві складові суспендували розчині саліну забуференому фосфатом і зберігали для 6 6 введення пацієнтові. Композиція містить 1x10 BCG клітин і 1x10 LNCaP клітин в об'ємі 50 мкл. Композицію ін'єктують в.в. Для того щоб дослідити ефективність проводять ELISPOT аналіз. Такий ELISPOT аналіз, наприклад, описується Mollenkopf HJ., Dietrich G., Fensterle J., Grade L, Diehl K.D., Knapp В., Singh M., O'Hagan D. Т., Ulmer J.B., and Kaufinann S. H. Enhanced protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine by adsorption onto cationic PLG microparticles. Vaccine. 2004 Jul 29;22(21-22):2690-5. В альтернативному режимі лікування, згадана вище композиція вводиться один раз, після чого вводяться тільки LNCaP клітини. Також, загальний принцип представленого винаходу полягає у тому що перша і друга складові можуть вводитись з різною частотою і при цьому через різний час. Проводили клінічне дослідженні гістології і визначали клінічну стадію пухлини, також як і стан пацієнтів, що лікуються. Сурогатний параметр був курсом PSA (простат-специфічний антиген) рівня і ряд пацієнтів мали прийнятний курс PSA рівня. Завдяки особливі комбінації, що вводиться пацієнтові, буде спостерігатись прийнятний курс PSA рівня також як і покращення коефіцієнту виживання, який є вищим порівняно з показником, що спостерігається без ад'юванту, тобто при введенні тільки LNCaP клітин. 18 UA 101140 C2 5 10 Приклад 4: Застосування BKG як ад'юванту для HCMV вакцини Цей приклад описує успішну комбінацію BKG як ад'юванту і щільних тіл HCMV, як тут описано, для того щоб викликати клітинний імунітет проти інфекції - цитомегаловірусу людини. Більш особливо, описується, що клітинний імунітет може бути викликаний в межах короткого проміжку часу. Таке швидке індукування HCMV імунітету є особливо важливим у пацієнтів, що зазнають трансплантації кісткового мозку, яка має місце дійсно часто разом з загрозою життю з боку HCMV інфекції. Для пацієнтів, що зазнають трансплантації, необхідним є швидке генерування клітинного імунітету при відсутності часу для вакцинації протягом тривалого часу у відповідності із стандартною практикою. Використовували наступну схему вакцинації: Антиген: щільні тіла доза: 20 мкг/тварину схема імунізації: D: день 0/7/21 С: день 0/7 В: день 0 Ад'ювант: 6 доза: 1x10 /тварину схема імунізації: день 0 Структура груп: А В1 В2 Кількість тварин 4 6 6 С1 С2 6 6 D1 D2 6 6 Група 15 20 25 30 35 40 Вакцини (на тварину) день 0 Вакцини (на тварину) день 7 20 мкг щільних тіл 20 мкг щільних тіл + 6 1x10 BKG 20 мкг щільних тіл 20 мкг щільних тіл + 6 1x10 BKG 20 мкг щільних тіл 20 мкг щільних тіл + 6 1x10 BKG Вакцини (на тварину) день 21 20 мкг щільних тіл 20 мкг щільних тіл 20 мкг щільних тіл 20 мкг щільних тіл 20 мкг щільних тіл 20 мкг щільних тіл Рецептуру готували кожні 8 і 9 днів, відповідно, після останньої імунізації. Результати показані на Фіг. 8 і 9, де Фіг. 9 є діаграмою, що зображає кількість IFN-гама5 позитивних клітин на 10 CD8+ Τ клітин при стимулюванні HCMV-специфічною сумішшю пептидів (від JPT Peptide Technologies GmbH, Berlin, Germany). Послідовності брали з рр65 протеїну HCMV. Це є сумішшю (Pepmix) 138 пептидів (15 амінокислот, кожний), що має перекривання послідовності 11 амінокислот). Фіг. 8 є діаграмою подібною до діаграми Фіг. 9, де відповідну кількість CD8+ Τ клітин визначали при стимулюванні неспецифічним контрольним пептидом. Як можна бачити із згаданих діаграм, у випадку використання BKG як ад'юванту при 5 початку вакцинації, в кожному випадку, кількість IFN-гама-позитивних CD8 клітин становить 10 CD8. Кількість Т-клітин значно збільшується. Найбільш явне збільшення можна спостерігати у групах В2 і С2. Це означає, що основна вакцинація BKG в комбінації із щільними тілами, де щільні тіла вводяться в 0 день і через 7 днів, вже значно збільшує кількість IFN-гама-позитивних клітин. Це підтверджує неочікуване відкриття, що лежить в основі представленого винаходу, що можна викликати клітинний імунітет проти HCMV, коли об'єднати щільні тіла і BKG. Приклад 5: Композиція для лікування і профілактики малярії Композиція для лікування і профілактики малярії включає як першу складову rBCG: delta ureС: НІу і як другу складову антиген малярії gp190/MSP1. Повинно бути зрозуміло, що антиген може бути присутній як пептид або частина великого пептиду, поліпептиду або навіть протеїну. 6 Композиція містить 50 мкг MSP1 протеїну і приблизно 1x10 rBCG: delta ureС: НІу в 50 мкл PBS буферу. Композиція вводиться п. ш. мишам. Після імунізаційного подразнення і у імунізованих мишей відбирають кров і використовують її в аналітичних методах. Розвиток процесу вакцинації знову контролювали використовуючи технологію ELISPOT (Mollenkopf Η. J., supra) і дослід інгібування інвазії Мерозоіте (Blackman et al. 1990 J.Ecsp. Med. Volume 172 Ρ: 379-382). Ми очікуємо покращення імунного стимулювання і декретування IFNгама через стимулювання використовуючи MSP-1 специфічні пептиди. Ми також очікуємо індукування інгібування інвазії шляхом відбору сироватки у імунізованих мишей. Результати IFN-гама ELISPOT і інгібування Мерозоіте корелюються із захистом. 19 UA 101140 C2 Деталі представленого винаходу описуються в описі, пунктах формули винаходу, переліку послідовностей і/або малюнках можуть або окремо, або в будь-якій комбінації бути матеріалом для реалізації винаходу в різних цього формах. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Комбінація для застосування у способі викликання ТН1 імунної відповіді, де комбінація містить першу складову і окрему другу складову, де першою складовою є бактеріальна клітина, яка включає принаймні одну молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує фаголізосомальний вислизаючий пептид або поліпептид, де бактеріальною клітиною є уреазодефіцитна клітина Mycobacterium; і де другою складовою є біологічно активний агент, що викликає імунну відповідь. 2. Комбінація згідно з пунктом 1, де клітиною є клітина Mycobacterium bovis. 3. Комбінація згідно з будь-яким з пунктів 1, 2, де принаймні одна клітинна субодиниця уреази, що кодується нуклеїновою кислотою бактеріальної клітини, є інактивованою. 4. Комбінація згідно з пунктом 3, де принаймні кодувальна послідовність С субодиниці бактеріальної уреази є інактивованою. 5. Комбінація згідно з будь-яким з пунктів 1-4, де фаголізосомальним вислизаючим доменом є фаголізосомальний вислизаючий домен Listeria. 6. Комбінація згідно з будь-яким з пунктів 1-5, де фаголізосомальний домен кодується молекулою нуклеїнової кислоти, що вибирають з групи, яка містить а) нуклеотидну послідовність, що включає нуклеотид 211-1722, як показано в SEQ ІD NО: 1; б) нуклеотидну послідовність, яка кодує ту ж саму амінокислотну послідовність як і послідовність з а), і в) нуклеотидну послідовність, що гібридизує за жорстких умов з послідовністю з а) або б). 7. Комбінація згідно з будь-яким з пунктів 1-6, де бактеріальна клітина включає принаймні одну молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує пептид або поліпептид, здатний викликати імунну відповідь у ссавця. 8. Комбінація згідно з пунктом 7, де пептид або поліпептид вибирають з аутоантигенів, пухлинних антигенів, вірусних антигенів, паразитних антигенів, бактеріальних антигенів і їх імуногенних фрагментів. 9. Комбінація згідно з пунктом 7 або 8, де пептид або поліпептид є частиною злитого поліпептиду. 10. Комбінація згідно з пунктом 9, де злитий поліпептид включає а) принаймні один домен з поліпептиду, де домен поліпептиду здатний викликати імунну відповідь у ссавця, і б) фаголізосомальний вислизаючий домен. 11. Комбінація згідно з пунктом 10, де поліпептидом є поліпептид, як визначено в пункті 9, або його частина. 12. Комбінація згідно з пунктом 10 або 11, де фаголізосомальним вислизаючим доменом є домен фаголізосомального вислизаючого домену, як визначено в будь-якому з пунктів 1-9. 13. Комбінація згідно з будь-яким з пунктів 1-12, де бактеріальною клітиною є rВСGΔureС:Hly. 14. Комбінація згідно з будь-яким з пунктів 1-13, де біологічно активним агентом є еукаріотична клітина і, більш переважно, генетично модифікована еукаріотична клітина, яка експресує цитокін. 15. Комбінація згідно з пунктом 14, де цитокін вибирають з групи, що включає інтерлейкін-2, інтерлейкін-4, інтерлейкін-12 і інтерферон-гамма. 16. Комбінація згідно з пунктом 15, де клітина співекспресує два або більше цитокінів. 17. Комбінація згідно з пунктом 16, де клітина співекспресує IL-2 і інтерферон-гамма. 18. Комбінація згідно з будь-яким з пунктів 14-17, де клітина є аутологічною відносно суб'єкта, якому клітина і/або композиція вводиться або повинна бути введена. 19. Комбінація згідно з будь-яким з пунктів 14-18, де клітина є алогенною відносно суб'єкта, якому клітина і/або композиція вводиться або повинна бути введена. 20. Комбінація згідно з будь-яким з пунктів 14-19, де клітину вибирають з групи, що включає непрофесійні клітини, що представляють антиген, професійні клітини, що представляють антиген, пухлинні клітини і дендровидні клітини. 21. Комбінація згідно з пунктом 20, де клітиною пухлини є імуногенна клітина і де клітину пухлини, переважно, вибирають з групи, що містить клітини меланоми, клітини раку нирки, клітини пухлини молочної залози, клітини пухлини мозку, клітини пухлини простати, клітини 20 UA 101140 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 немілкоклітинного раку легені, клітини раку товстої кишки і клітини пухлини сквамозних клітин голови і шиї. 22. Комбінація згідно з будь-яким з пунктів 14-21, де клітиною є алогенна клітина і є підібраним HLA класом І. 23. Комбінація згідно з будь-яким з пунктів 14-22, де клітина експресує іншу імуномолекулу, що вибирають з групи, яка включає цитокін, молекулу прилипання, співстимуляторний фактор, пухлино-зв'язаний антиген, пухлино-специфічний антиген і паразитний антиген. 24. Комбінація згідно з пунктом 23, де паразитним антигеном є gp190/MSP1 протеїн Plasmodium, переважно, Plasmodium falciparum, або його фрагмент, здатний викликати імунну відповідь у ссавця. 25. Комбінація згідно з будь-яким з пунктів 1-13, де біологічно активним агентом є gp190/MSP1 протеїн Plasmodium, переважно, Plasmodium falciparum, або його фрагмент здатний викликати імунну відповідь у ссавця. 26. Комбінація згідно з будь-яким з пунктів 1-13, де біологічно активним агентом є цитомегаловірус людини. 27. Комбінація згідно з будь-яким з пунктів 1-13, де біологічно активним агентом є вірусна часточка або її сукупність, переважно, що вивільнюється після інфікування клітин ссавця цитомегаловірусом людини, де часточки (а) є оточеними ліпідною мембраною, в яку вбудовані вірусні глікопротеїни, і (б) не містить ні вірусної ДНК, ні капсид. 28. Комбінація згідно з пунктом 27, де часточки містять злитий протеїн, що включає одну або більше частин Т-клітинного антигену рр65 (UL83) і одну або більше частин одного або більше протеїнів, які не є рр65. 29. Комбінація згідно з пунктом 28, де Т-клітинний антиген рр65 злитий з однією або більшою кількістю частин глікопротеїну цитомегаловірусу людини, де глікопротеїн вибирають з групи, що включає HCMV глікопротеїн gН, HCMV протеїн ІЕ1 (ppUL123) і HCMV глікопротеїн gВ. 30. Комбінація згідно з пунктом 28, де Т-клітинний антиген злитий з однією або більшою кількістю частин протеїну, який є частиною патогену людини іншого, ніж HCMV. 31. Комбінація згідно з пунктом 30, де патоген вибирають з групи, що включає HIV-1, HBV, HCV і грип. 32. Комбінація згідно з будь-яким з пунктів 27-31, де часточка(и) містить(ять) частини принаймні двох глікопротеїнів, які є варіантами окремого глікопротеїну з різних штамів HCMV. 33. Комбінація згідно з пунктом 32, одним або двома варіантами окремого HCMV глікопротеїну є варіант штаму Тоуна HCMV і іншим є варіант штаму Ad169 HCMV. 34. Комбінація згідно з будь-яким з пунктів 27-33, де клітинами ссавця є фібробласти, переважно, фібробласти крайньої плоті. 35. Комбінація згідно з будь-яким з пунктів 27-34, де часточка є щільним тілом. 36. Комбінація згідно з будь-яким з пунктів 1-13, де біологічно активним агентом є щільне тіло, переважно, щільне тіло HCMV або щільне тіло згідно з пунктом 35. 37. Бактеріальна клітина, яка містить щонайменше одну молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує фаголізосомальний вислизаючий пептид або поліпептид, де бактеріальною клітиною є уреазо-дефіцитна клітина Mycobacterium, для застосування у способі викликання ТН1 імунної відповіді. 38. Бактеріальна клітина згідно з пунктом 37, де клітиною є клітина Mycobacterium bovis. 39. Бактеріальна клітина згідно з будь-яким з пунктів 37-38, де принаймні одна клітинна субодиниця уреази, що кодується нуклеїновою кислотою бактеріальної клітини, є інактивованою. 40. Бактеріальна клітина згідно з пунктом 39, де, принаймні, кодувальна послідовність С субодиниці бактеріальної уреази є інактивованою. 41. Бактеріальна клітина згідно з будь-яким з пунктів 37-40, де фаголізосомальним вислизаючим доменом є фаголізосомальний вислизаючий домен Listeria. 42. Бактеріальна клітина згідно з будь-яким з пунктів 37-41, де фаголізосомальний домен кодується молекулою нуклеїнової кислоти, що вибирають з групи, яка містить а) нуклеотидну послідовність, що включає нуклеотид 211-1722, як показано в SEQ ІD NО: 1, б) нуклеотидну послідовність, яка кодує ту ж саму амінокислотну послідовність як і послідовність з а), і в) нуклеотидну послідовність, що гібридизує за жорстких умов з послідовністю з а) або б). 43. Бактеріальна клітина згідно з будь-яким з пунктів 37-42, де бактеріальна клітина включає принаймні одну молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує пептид або поліпептид, здатний викликати імунну відповідь у ссавця. 21 UA 101140 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 44. Бактеріальна клітина згідно з пунктом 43, де пептид або поліпептид вибирають з аутоантигенів, пухлинних антигенів, вірусних антигенів, паразитних антигенів, бактеріальних антигенів і їх імуногенних фрагментів. 45. Бактеріальна клітина згідно з пунктом 43 або 44, де пептид або поліпептид є частиною злитого поліпептиду. 46. Бактеріальна клітина згідно з пунктом 45, де злитий поліпептид включає а) принаймні один домен з поліпептиду, де домен поліпептиду здатний викликати імунну відповідь у ссавця, і б) фаголізосомальний вислизаючий домен. 47. Бактеріальна клітина згідно з пунктом 46, де поліпептидом є поліпептид, як визначено в пункті 44, або його частина. 48. Бактеріальна клітина згідно з пунктом 46 або 47, де фаголізосомальним вислизаючим доменом є домен фаголізосомального вислизаючого домену, як визначено в будь-якому з пунктів 37-45. 49. Бактеріальна клітина згідно з будь-яким з пунктів 37-47, де бактеріальною клітиною є rВСGΔureС:Hly. 50. Композиція, бажано фармацевтична композиція, що включає комбінацію згідно з будь-яким з пунктів 1-36 і, необов'язково, фармацевтично прийнятний носій, для застосування у способі викликання ТН1 імунної відповіді. 51. Застосування комбінації згідно з будь-яким з пунктів 1-36 або бактеріальної клітини за будьяким з пп. 37-48, або композиції згідно з пунктом 50, для виготовлення медикаменту, що викликає ТН1 імунну відповідь. 52. Застосування згідно з пунктом 51, де медикамент призначений для лікування і/або профілактики захворювання, що вибирають з групи, яка містить рак і інфекційні захворювання. 53. Застосування згідно з пунктом 52, де раком є імуногенна пухлина і, більш переважно, вибирають з групи, що містить рак простати, меланому, рак нирки, пухлину молочної залози, пухлини мозку, немілкоклітинний рак легені, рак товстої кишки і сквамозну пухлину голови і шиї. 54. Застосування згідно з пунктом 52, де інфекційним захворюванням є малярія. 55. Застосування згідно з пунктом 54, де біологічно активним агентом є gp190/MSP1 протеїн Plasmodium або його фрагмент, здатний викликати імунну відповідь у ссавця. 56. Застосування згідно з пунктом 52, де інфекційним захворюванням є HCMV інфекція. 57. Застосування згідно з пунктом 56, де біологічно активним агентом є щільне тіло, як визначено в будь-якому з попередніх пунктів. 58. Застосування комбінації за будь-яким з пп. 1-36 або бактеріальної клітини за будь-яким з пп. 37-48 для виготовлення терапевтичної і/або профілактичної вакцини, що викликає ТН1 імунну відповідь. 59. Комбінація за будь-яким з пп. 1-36 або бактеріальна клітина за будь-яким з пп. 37-48, або фармацевтична композиція згідно з пунктом 50, для викликання ТН1 імунної відповіді у способі лікування пацієнта, що страждає на захворювання та потребує такого лікування, що включає введення комбінації за будь-яким з пп. 1-36, або бактеріальної клітини за будь-яким з пп. 37-48, або фармацевтичної композиції згідно з пунктом 50. 60. Комбінація, бактеріальна клітина та фармацевтична композиція за п. 59, де захворювання вибирають з групи, що включає рак та інфекційні захворювання. 61. Спосіб виготовлення фармацевтичної композиції, згідно з пунктом 50, що включає стадії - одержання, як першої складової, бактеріальної клітини, яка включає принаймні одну молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує фаголізосомальний вислизаючий пептид або поліпептид, де клітина є уреазо-дефіцитною клітиною Mycobacterium; - одержання, як другої складової, біологічно активного агента; і - формулювання першої складової і другої складової у фармацевтичну композицію. 62. Спосіб виготовлення фармацевтичної композиції, згідно з пунктом 50, що включає стадії - одержання, як першої складової, бактеріальної клітини, яка включає принаймні одну молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує фаголізосомальний вислизаючий пептид або поліпептид, де бактеріальна клітина є уреазо-дефіцитною і бактеріальною клітиною є клітина Mycobacterium, - одержання, як другої складової, біологічно активного агента, що викликає імунну відповідь; і - формулювання окремо першої складової і другої складової. 22 UA 101140 C2 23 UA 101140 C2 24 UA 101140 C2 25 UA 101140 C2 26 UA 101140 C2 27 UA 101140 C2 28