Вакцинні композиції, які включають сапонінвмісні ад’юванти

Реферат: Винахід належить до вакцинної композиції, яка містить емульсію олія-у-воді (О/В), що ін'єктується, яка включає: водний розчин, який включає щонайменше один імуноген, вибраний з інактивованого 2 цирковірусу свиней (PCV2), вірусу ящура (FMDV) і бактерій; водний розчин, що містить сапонін в кількості від близько 0,7 мг/дозу до близько 1,3 мг/дозу; водний розчин, який включає гідроксид алюмінію в кількості від близько 0,065 % мас./об. до близько 0,42 % мас./об.; мінеральну олію; неіонну ліпофільну поверхнево-активну речовину; неіонну гідрофільну поверхнево-активну речовину, яка має високе значення гідрофільно-ліпофільного балансу (ГЛБ) від 13 до 40, вибране з етоксилованих моноефірів жирної кислоти і сорбітану, етоксиловані жирні кислоти і їх комбінації; неіонну гідрофільну поверхнево-активну речовину, яка має низьке значення гідрофільно-ліпофільного балансу (ГЛБ) від 9 до 13, вибрана з етоксилованих моноефірів жирної кислоти і сорбітану, діефіри етоксиловані жирної кислоти і сорбітану, моноефіри етоксиловані жирної кислоти і сорбітану, етоксиловані жирні кислоти, етоксилована касторова олія і їх комбінації; і де кінцеве ГЛБ емульсії складає від близько 9 до близько 12. UA 107940 C2 (12) UA 107940 C2 Винахід також належить до застосування заваленої композиції для отримання лікувального засобу для індукції імунологічної відповіді у тварини. UA 107940 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої відноситься винахід Даний винахід відноситься до емульсій олія-в-воді, їх застосування як ад’ювантів, і до фармацевтичних, імунологічних або вакцинних композицій, які містять дані емульсії. Включення шляхом посиланням Даною заявкою заявляється пріоритет попередньої патентної заявки США № 61/241171 від 10 вересня 2009 року, і додатково дається посилання на наступні патентні заявки: патентна заявка США № 12/027776 від 7 лютого 2008 року, патентна заявка США № 10/899181 від 26 липня 2004 року, тепер є виданим патентом США 7371395, і попередня патентна заявка США № 60/490345 від 24 липня 2003 року. Вищезазначені заявки і всі документи, процитовані в них або в ході їх розгляду («документи, процитовані в заявці») і всі документи або посилання в документах, процитованих в заявці, і всі документи, процитовані або згадувані в даному документі («документи, процитовані в даному документі»), і всі документи, процитовані або згадані в документах, процитованих в даному документі, разом з якими-небудь інструкціями виробника, описами, технічними описами виробу і технологічними картами для будь-яких продуктів, згаданих в даному документі, або в будь-якому документі, включеному шляхом посилання до даного документу, даним включені до даного документу шляхом посилання, і можуть бути використані при практичному здійсненні винаходу. Попередній рівень техніки Застосування ад’ювантів у вакцинах добре відоме. Ад'ювант є сполукою, яка при об'єднанні з вакцинним антигеном підвищує імунну відповідь на вакцинний антиген у порівнянні з відповіддю, індукованою вакцинним антигеном окремо. Серед стратегій, які стимулюють імуногенність антигену, є ті, в яких надають вакцинним антигенам дисперсну форму, ті, в яких вакцинні антигени полімеризують або емульгують, є способи інкапсуляції вакцинних антигенів, є шляхи поліпшення відповіді власних цитокінів господаря, і є способи, які направляють вакцинні антигени до антиген-презентуючих клітин (Nossal, 1999, In: Fundamental Immunology. Paul (Ed.), Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Ра.; Vogel and Powell, 1995, In: Vaccine Design. The Subunit and Adjuvant Approach. Powell and Newman (Eds.), Plenum Press, NY, N.Y. р. 141). Оскільки ад’юванти грають істотну роль у поліпшенні імуногенності вакцинних антигенів, то застосування ад’ювантів у складі вакцин власне є повсюдним (Nossal, 1999, вище; Vogel and Powell, 1995, вище; див. також заявку PCT WO 97/18837, розкриття якої включене до даного документу шляхом посилання). Відповідні ад’юванти, добре відомі в даній галузі, розрізняються за своєю природою. Вони можуть, наприклад, складатися з нерозчинних у воді неорганічних солей, ліпосом, міцел або емульсій, як наприклад, ад’ювант Фрейнда. Інші ад’юванти можна знайти в публікації Vogel and Powell, 1995, згаданій вище. Хоча не існує єдиного механізму дії ад’ювантів, істотною характеристикою є їх здатність значно підвищувати імунну відповідь на вакцинний антиген у порівнянні з відповіддю, індукованою вакцинним антигеном окремо (Nossal, 1999, вище; Vogel and Powell, 1995, вище). У зв'язку з цим, деякі ад’юванти є ефективнішими у відношенні посилення гуморальної імунної відповіді; інші ад’юванти ефективніші для збільшення клітинно-опосередкованої імунної відповіді (Vogel and Powell, 1995, вище); і ще інша група ад’ювантів збільшує обидва типи імунної відповіді проти вакцинних антигенів, гуморальний і клітинно-опосередкований (Vogel and Powell, 1995, вище). Як правило, емульсії, які використовуються у вакцинній композиції, включають суміш олії, водного розчину і поверхнево-активних речовин. Деякі емульсії включають ліпофільну поверхнево-активну речовину, таку як «SPAN 80®» і гідрофільну поверхнево-активну речовину, таку як «TWEEN 80®». Проте можуть спостерігатися проблеми стабільності з емульсіями, які використовуються як вакцинні ад’юванти, зокрема, під час зберігання і транспортування. Це особливо вірно, коли ці композиції містять концентровані імуногени, особливо неочищені концентровані імуногени. Як правило, це відбувається з ад’ювантами, які використовуються в інактивованих (убитих) вакцинах. Дана проблема є ще більш значущою для мультивалентних вакцинних композицій, оскільки імуногени сильніше сконцентровані в тому ж об'ємі розчинника. Інша проблема, яка стосується ад’юванта, пов'язана з ризиком побічних ефектів, таких як токсичність або локальне запалення в місці ін'єкції. Наприклад, після ін'єкції може виникнути локальна запальна відповідь і/або гранульома. З метою обмеження таких побічних реакцій, кількість поверхнево-активних речовин та інших компонентів в емульсії може бути зменшена; проте це зменшення в результаті може привести до зниження стабільності вакцинної композиції. Таким чином, існує необхідність отримання нових ад’ювантів і вакцинних композицій, які містять такі ад’юванти, з підвищеною безпекою і стабільністю. Сутність винаходу У першому втіленні, у даному винаході пропонується нова емульсія олія-в-воді (О/В) з 1 UA 107940 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 підвищеною стабільністю у присутності бактерійних або вірусних суспензій, особливо концентрованих і не очищених або слабо очищених. Інше втілення даного винаходу забезпечує стабільну, безпечну і таку, що легко вводиться, зокрема таку, що ін'єктується, О/В емульсію як носій для доставки фармацевтичної композиції, яка включає, щонайменше, один активний інгредієнт, який, конкретніше, може бути імуногеном. Ще одне втілення даного винаходу забезпечує стабільну, безпечну і таку, що ін'єктується емульсію О/В, яка діє як ад’ювант для підвищення імунної відповіді, що індукується імуногеном. Конкретно, в даному винаході пропонується новий ад’ювант, який при використанні у вакцинній композиції, яка містить імуноген, підвищує клітинну імунну відповідь вакцинованого на імуноген, гуморальну імунну відповідь або, краще, підвищує обидві імунні відповіді. Ще в одному втіленні даного винаходу пропонується стабільна, безпечна і імуногенна композиція або вакцина, яка включає О/В емульсію. У наступному втіленні даного винаходу пропонується спосіб отримання вакцинної композиції з використанням ад’юванта за даним винаходом; отримана вакцинна композиція; і способи її застосування. Ще в одному втіленні даного винаходу пропонується набір реагентів, що включає один або декілька флаконів. У одному втіленні, набір реагентів включає один флакон, ад’ювант, що містить, за даним винаходом і імуноген або інший фармацевтичний продукт. Ще в одному втіленні, набір реагентів включає імуноген або інший фармацевтичний продукт в першому флаконі, і ад’ювант, отриманий відповідно до даного винаходу, в другому флаконі, при цьому ад’ювант розроблений так, щоб перед застосуванням його необхідно було змішувати з імуногеном або іншим вакцинним продуктом. У одному втіленні, в даному винаході пропонується емульсія, що ін'єктується, олія-в-воді (О/В), яка включає: (1) водний розчин, який включає імуноген; (2) водний розчин, який включає гідрофільну іонну поверхнево-активну речовину, таку як сапонін (3) необов'язковий водний розчин, який включає гідроксид алюмінію; (4) мінеральну олію; (5) неіонну ліпофільну поверхнево-активну речовину; (6) неіонну гідрофільну поверхнево-активну речовину з низьким значенням ГЛБ, яка включає етоксильовані диефіри сорбіту і жирних кислот (як правило, які мають значення від 11 до 13). У іншому втіленні, в даному винаході пропонується емульсія, що ін'єктується, олія-в-воді (О/В), яка включає: (1) водний розчин, який включає імуноген; (2) водний розчин, який включає гідрофільну іонну поверхнево-активну речовину, таку як сапонін (3) мінеральну олію; (4) неіонну ліпофільну поверхнево-активну речовину; (5) неіонну гідрофільну поверхнево-активну речовину з низьким значенням ГЛБ, яка включає етоксильовані диефіри сорбіту і жирних кислот (як правило, що мають значення від 11 до 13). У іншому втіленні, в даному винаході пропонується емульсія, що ін'єктується, олія-в-воді (О/В), яка включає: (1) водний розчин, який включає імуноген; (2) водний розчин, який включає гідрофільну іонну поверхнево-активну речовину, таку як сапонін (3) необов'язковий водний розчин, який включає гідроксид алюмінію; (4) неіонну гідрофільну поверхнево-активну речовину з високим значенням гідрофільноліпофільного балансу (ГЛБ) більшим ніж 13 і меншим ніж 40, конкретно, з ГЛБ > 13,5, і бажано з ГЛБ>14; (5) мінеральну олію; (6) неіонну ліпофільну поверхнево-активну речовину; (7) неіонну гідрофільну поверхнево-активну речовину з низьким значенням ГЛБ (значення ГЛБ від близько 9 до близько 13). У іншому втіленні, в даному винаході пропонується емульсія, що ін'єктується, олія-в-воді (О/В), яка включає: (1) водний розчин, який включає імуноген; (2) водний розчин, який включає гідрофільну іонну поверхнево-активну речовину, таку як сапонін (3) неіонну гідрофільну поверхнево-активну речовину з високим значенням гідрофільно 2 UA 107940 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ліпофільного балансу (ГЛБ) більшим ніж 13 і меншим ніж 40, конкретно, з ГЛБ ≥ 13,5, і переважно з ГЛБ ≥ 14; (4) мінеральну олію; (5) неіонну ліпофільну поверхнево - активну речовину; (6) неіонну гідрофільну поверхнево - активну речовину з низьким значенням ГЛБ (значення ГЛБ від близько 9 до близько 13). Ще в одному втіленні, в даному винаході пропонується вакцинна композиція, що включає нову емульсію, яка містить, щонайменше, один імуноген, придатний для виклику імунологічної відповіді у вакцинованого. У винаході додатково пропонуються такі композиції, де емульсія діє як ад’ювант для посилення імунної відповіді, яка індукується імуногеном, конкретно, для посилення клітинної відповіді, гуморальної відповіді або, краще, обох відповідей. У іншому втіленні даного винаходу пропонується спосіб отримання вакцинної композиції, де імуноген змішують з ад’ювантом відповідно до даного винаходу, особливо, імуноген у сухій формі, який може бути отриманий шляхом ліофілізації або шляхом склування, або імуноген у водному розчині, особливо, де вказана суха форма або вказаний водний розчин додатково включають іонну поверхнево-активну речовину, наприклад, сапонін і необов'язково додатково включають гідроксид алюмінію. Імуноген може бути вибраний з групи, що складається з інактивованих патогенів, ослаблених патогенів, субодиниць антигенів, очищених антигенів, неочищених антигенів або антигенів, отриманих рекомбінантно з використанням бактерійних клітин, дріжджових, рослинних, клітин комах або тваринних клітин, експресуючих вектори, які включають плазміди тощо. Антигени можуть бути очищені за допомогою способів, які є добре відомими в даній галузі, і які включають зокрема ультрафільтрацію, ультрацентрифугування, ексклюзійну гель-фільтрацію, іон-обмінну хроматографію і очищення з ПЕГ. Патоген може мати бактерійне, вірусне походження, його джерелом можуть бути найпростіші або гриби, або до складу імуногену може входити антитоксин. У іншому втіленні в даному винаході пропонується спосіб індукції імунної відповіді у вакцинованого проти патогену, причому спосіб включає введення вакцинованому вакцинної композиції запропонованої даним винаходом. У іншому втіленні, в даному винаході пропонуються набори реагентів, які включають один флакон, який містить очищені імуногени і емульсію за даним винаходом. У одному втіленні, імуногени, які містяться в одному флаконі, включають очищені антигени вірусу ящура. У іншому втіленні, в даному винаході пропонуються набори реагентів, які включають, щонайменше, два флакони, де перший флакон містить імуноген, особливо імуноген в сухій формі або в розчині або у водному середовищі, особливо де вказана суха форма або вказаний водний розчин додатково включають іонну поверхнево-активну речовину, переважно сапонін, і необов'язково додатково включають гідроксид алюмінію, а другий флакон містить ад’ювант або емульсію відповідно до даного винаходу. Застосування наборів реагентів, які включають, щонайменше, два флакони, є особливо ефективним у випадках, де комбінація дискретних компонентів (тобто змішування в одному флаконі вмісту, щонайменше, двох флаконів) приводитиме в результаті до отримання складу вакцини із зменшеною стабільністю. Слід зазначити, що в даному розкритті і особливо у формулі винаходу терміни, такі як «містить», «який містить» і подібні до них, можуть мати значення, яке надається терміну в патентному законі США, наприклад, вони можуть означати «включає», «включений», «такий, що включає» тощо; і що терміни, такі як що «складається переважно» і «який переважно складається» мають значення, визначені для них патентним законом США, наприклад, вони дозволяють елементам не явним чином згадуватися, але виключати елементи, які виявлені в попередньому рівні техніки або які впливають на основну або нову характеристику винаходу. Ці та інші втілення описані в наступному докладному описі або є очевидними з нього і охоплені ним. Короткий опис креслень Повне і достатнє розкриття даного винаходу, яке включає кращий спосіб його здійснення, конкретніше викладене для фахівців в даній галузі в решті частини опису винаходу, включаючи додані посилання на креслення, де: На Фіг. 1 представлені графіки визначення температури обернення фаз, ТОФ (англ. Phase Inversion Temperature, PIT) (визначеної за допомогою провідності) для вакцинних композицій дослідів 1 і 2 в дні 7, 22, 121, і 330 (однорічне дослідження стабільності). Визначення ТОФ є однією мірою стабільності вакцинного складу. На Фіг. 2 представлені графіки визначення ТОФ для вакцинних композицій дослідів 3 і 4 в різні дні після отримання (однорічне дослідження стабільності); На Фіг. 3 представлені графіки визначення ТОФ для вакцинних композицій дослідів 5 і 6 в 3 UA 107940 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 різні дні після отримання (однорічне дослідження стабільності); На Фіг. 4 представлені графіки визначення ТОФ для вакцинних композицій дослідів 7 і 8 в різні дні після отримання (однорічне дослідження стабільності); На Фіг. 5 представлений графік визначення ТОФ для вакцинних композицій випробування 9 в різні дні після отримання (однорічне дослідження стабільності); На Фіг. 6 представлені графіки визначення ТОФ для вакцинних композицій (дослідів 1-9), отриманих відповідно до даного винаходу, і які зберігалися протягом 36 місяців; На Фіг. 7 представлений графік, який демонструє залежність у часі змін ректальної температури свиней, підданих обробці відповідно матеріалами і методами, розкритими в прикладі 6; На Фіг. 8 представлений графік, який виявляє максимальну зміну температури, яка спостерігалась для свиней, підданих обробці відповідно матеріалами і методами, розкритими в прикладі 6; На Фіг. 9 представлений графік, який демонструє ефективність вакцини (PD50) щодо корисного навантаження (мкг) для свиней, підданих обробці відповідно матеріалами і методами, які були розкриті в прикладі 7. Докладний опис винаходу Інші завдання, особливості і аспекти даного винаходу будуть розкриті або стануть очевидними з наступного докладного опису винаходу. Фахівцеві в даній галузі слід розуміти, що дане обговорення є тільки описом типових втілень і не призначене для обмеження ширших аспектів даного винаходу, які будуть втілені в зразкового виконання. Фактично, фахівцеві в даній галузі буде очевидним, що в даному винаході можуть бути проведені різні модифікації і варіації, не відходячи при цьому від обсягів домагань і сутності винаходу. Наприклад, ознаки, проілюстровані або описані як частина одного втілення, можуть використовуватися в іншому втіленні з отриманням ще одного втілення. Мають на увазі, що даний винахід охоплює такі модифікації і варіації, які потрапляють в рамки прикладеної формули винаходу і її еквівалентів. Зміст публікацій, опублікованих патентів і патентів, які цитуються в даній заявці, цим самим включено шляхом посилання у повному об'ємі. Для зручності тут зібрані певні терміни, які вживаються в описі винаходу, в прикладах і в прикладеній Формулі винаходу. При використанні в даному документі, термін «тварина» включає всіх хребетних, також, включаючи людину. Він також включає окрему тварину на всіх стадіях розвитку, включаючи стадії ембріона і плоду. Конкретно, термін «хребетна тварина» включає зокрема людей, представників родини собачих (наприклад, собаки), котячих (наприклад, кішки); непарнокопитних (наприклад, коні), жуйних парнокопитних (наприклад, корови, велика рогата худоба), свиней (наприклад, свині), а також птахів. При використанні в даному документі, термін «корова» або «велика рогата худоба» використовується, як правило, для позначення тварини з походженням з родини жуйних парнокопитних будь-якого віку. Взаємозамінні терміни включають «бик», «теля», «віл», «буйвол», «телиця», «корова» тощо. Взаємозамінні терміни включають «порося», «свиноматка» тощо. Термін «птахи» при використанні в даному документі відноситься до будь-яких видів або підвидів таксономічної групи птахів, таких як зокрема, курка (племінні птахи, бройлери і несучки), індичка, качка, гусак, перепілка, фазан, папуга, зяблик, яструб, ворона і безкілеві, включаючи таких, як страус, ему і казуар. Термін «свиня» або «порося» позначає тварину, яка відноситься до роду свиней, тоді як «свиноматка» позначає самку свині репродуктивного віку і здатністю до відтворення. При використанні в даному документі, термін «вірулентний» позначає ізолят, який зберігає свою здатність інфікувати тварину-господаря. При використанні в даному документі, термін «інактивована вакцина» позначає вакцинну композицію, яка містить інфекційний організм або патоген, який більше не здатний до реплікації або росту. Патоген може мати бактерійне, вірусне походження, може походити з найпростіших або може мати грибкове походження. Інактивація може здійснюватися за допомогою різноманітних способів, що включають заморожування-розморожування, хімічну обробку (наприклад, обробку формаліном), обробку ультразвуком, опромінювання, нагрівання або інший придатний спосіб, достатній для запобігання реплікації або росту організму, із збереженням при цьому його імуногенності. При використанні в даному документі, термін «імуногенність» позначає здатність продукувати імунну відповідь у тварини-господаря проти антигену або антигенів. Імунна відповідь утворює основу захисного імунітету, що викликається вакциною проти специфічного інфекційного організму. При використанні в даному документі, термін «імунна відповідь» позначає відповідь, яка 4 UA 107940 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 викликається у тварини. Імунна відповідь може позначати клітинний імунітет (англ. cellular immunity, CMI); гуморальний імунітет або може включати і те і інше. Даний винахід також припускає відповідь, обмежену частиною імунної системи. Наприклад, вакцинна композиція запропонована даним винаходом може специфічно індукувати посилену відповідь гаммаінтерферону. При використанні в даному документі, термін «антиген» або «імуноген» позначає речовину, яка індукує специфічну імунну відповідь у тварини-господаря. Антиген може включати цілісний організм, неживий, ослаблений або живий; субодиницю або частину організму; рекомбінантний вектор, який містить вставку з імуногенними властивостями; частину або фрагмент ДНК, здатну індукувати імунну відповідь при презентуванні тварині-господареві; білок, поліпептид, пептид, епітоп, гаптен або будь-яку їх комбінацію. У іншому випадку, імуноген або антиген можуть містити токсин або антитоксин. При використанні в цьому документі, термін «мультивалентна» позначає вакцину, яка містить більше ніж один антиген або із одного виду (тобто різні ізоляти серотипів вірусу ящура), із різних видів (тобто ізоляти як з Pasteurella hemolytica, так і з Pasteurella multocida), або вакцину, яка містить комбінацію антигенів з різних родів (наприклад, вакцина, яка включає антигени з Pasteurella multocida, Salmonella, Escherichia coli, Haemophilus somnus і Clostridium). При використанні в даному документі, термін «ад’ювант» позначає речовину, що додається до вакцини для посилення імуногенності вакцини. Механізм того, як функціонує антиген, до кінця не зрозумілий. Вважається, що деякі ад’юванти підсилюють імунну відповідь шляхом повільного вивільнення антигену, тоді як інші ад’юванти самі по собі є сильно імуногенними і вважається, що вони функціонують синергійно. Відомі вакцинні ад’юванти включають зокрема олійні і водні емульсії (наприклад, повний ад’ювант Фрейнда і неповний ад’ювант Фрейнда), Corynebacterium parvum, бацилу Кальмета-Герена, гідроксид алюмінію, глюкан, декстран сульфат, оксид заліза, альгінат натрію, бакто-ад’ювант, певні синтетичні полімери, такі як поліамінокислоти і співполімери амінокислот, сапонін, «REGRESSIN» (Vetrepharm, Athens, Ga.), «AVRIDINE» (N,N-діоктадецил-N',N'-біс(2-гідроксиетил) -пропандиамін), парафінова олія, мураміл-дипептид і тому подібні. При використанні в даному документі, термін «емульсія» позначає комбінацію, щонайменше, двох речовин, де перша речовина диспергує в другій речовині, в якій перша речовина не є розчинною. Один приклад емульсії запропонованої даним винаходом є олійною фазою, яка диспергована у водній фазі. При використанні в даному документі, термін «неповна емульсія» позначає композицію, до якої повинен бути доданий, щонайменше, один додатковий компонент для отримання «повної емульсії». При використанні в даному документі, термін «повна емульсія» може розглядатися як еквівалент «готової до застосування» імунологічної композиції запропонованої даним винаходом. Прикладом повної емульсії є імунологічна композиція відповідно до даного винаходу, яка готова до введення тварині відповідно до способів запропонованих даним винаходом. При використанні в цьому документі, терміни «фармацевтично прийнятний носій» і «фармацевтично прийнятний засіб перенесення» є взаємозамінними і позначають рідкий засіб перенесення для вмісту вакцинних антигенів, які можуть ін'єктуватися організму-господареві без побічних ефектів. Придатні фармацевтично прийнятні носії, відомі в даній галузі, включають зокрема стерильну воду, сольовий розчин, глюкозу, декстрозу або буферні розчини. Носії можуть включати допоміжні агенти, розчинники, що включають зокрема, стабілізатори (тобто, цукри і амінокислоти), консерванти, зволожувачі, емульгатори, рН-буферні агенти, добавки посилення в'язкості, барвники тощо. При використанні в даному документі, термін «вакцинна композиція» включає, щонайменше, один антиген або імуноген у фармацевтично прийнятному носієві, який використовується для індукції імунної відповіді у організма-господаря. Вакцинні композиції можуть бути введені в дозуваннях і методами, добре відомими фахівцям в галузі медицини або ветеринарії, зважаючи на такі чинники, як вік, стать, маса, вид і стан тварини-реципієнта, а також шлях введення. Шлях введення може бути черезшкірним введенням через слизисту оболонку (наприклад, пероральне, назальне, ректальне, вагінальне), або може бути веденням через парентеральний шлях (внутрішньошкірне, внутрішньом'язове, підшкірне, внутрішньовенне або внутрішньоочеревинне введення). Вакцинні композиції можуть вводитися окремо або можуть вводитися разом або послідовно з іншими обробками або терапіями. Форми введення можуть включати суспензії, сиропи або еліксири, і препарати для парентерального, підшкірного, внутрішньошкірного, внутрішньом'язового або внутрішньовенного введення (наприклад, введення за допомогою ін'єкцій), такі як стерильні суспензії або емульсії. Вакцинні композиції 5 UA 107940 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можуть вводитися у вигляді спрею або можуть змішуватися з їжею і/або водою, або можуть доставлятися у вигляді попередньої суміші з використанням придатного носія, розчинника або наповнювача, такого як стерильна вода, фізіологічний сольовий розчин, глюкоза тощо. Композиції можуть містити допоміжні речовини, такі як зволожувачі або емульгатори, агенти, які коректують рН, буферні агенти, ад’юванти, добавки, підсилюючі гелеутворення або в'язкість, консерванти, ароматизатори, барвники і тому подібне, залежно від необхідних шляхів введення і приготування. Стандартні фармацевтичні тексти, такі як «Remington's Pharmaceutical Sciences», 1990, можуть бути використані для консультації при приготуванні придатних препаратів, без проведення зайвих експериментів. При використанні в даному документі термін «очищений» не вимагає абсолютної чистоти; швидше він застосовується як відносний термін. Таким чином, наприклад, очищений імуногенний препарат, такий як білок або інактивований вірус, є препаратом, в якому імуноген знаходиться в більш збагаченому стані, ніж імуноген в його природному середовищі. Імуногенний препарат в даному документі часто позначається як «очищений», якщо імуноген складає, щонайменше, 60%, щонайменше, 70%, щонайменше, 80%, щонайменше, 90%, щонайменше, 95%, або, щонайменше, 98% від загального вмісту імуногену в препараті. «Сирий препарат», який відповідає найнижчому ступеню очищення, може містити настільки мало, як менше ніж 60%, менше ніж 20%, менше ніж 10%, менше ніж 5%, або менше ніж 1% імуногенних компонентів. Мають на увазі, що при використанні в даному документі, термін «високоочищений» припускає «вищий ступінь чистоти» у порівнянні з терміном «середньоочищенний». Цей «вищий ступінь чистоти» може включати, але жодним чином не обмежувати, зменшений процентний вміст домішок в імунологічному препараті, який є «високоочищеним» в порівнянні з імунологічним препаратом, який є «середньоочищеним». Як обговорюється в даному документі, «високоочищені» імунологічні препарати міститимуть від найнижчого до не детектовано низького процентного вмісту домішок, які можуть викликати: зниження цільової імунної відповіді, посилення нецільової імунної відповіді (наприклад, реакцію гіперчутливості), або зменшення стабільності складу. Аналогічно, імунологічний препарат, який є «середньоочищенним», містить відносно низький процентний вміст домішок в порівнянні з імунологічним препаратом, який є «мінімально очищеним», який також містить понижений процентний вміст домішок в порівнянні з препаратом, позначеним як «сирий препарат». Домішки в імунологічному препараті можуть включати, але жодним чином не обмежуються цим, речовини, які вносять негативний внесок до імунологічної композиції запропонованої даним винаходом. Одним з декількох прикладів домішок, які вносять негативний внесок, є домішка, яка знижує здатність імунологічної композиції запропонованої даним винаходом викликати імунну відповідь тварин. За допомогою різних методів можна досягти різних рівнів чистоти (наприклад, «високої чистоти», «середньої чистоти» тощо). Наприклад, комбінація хроматографії і гель-фільтрації може приводити в результаті до отримання «високоочищених» або «середньоочищених» імунологічних препаратів. Відмінності джерела/типу імуногенів, а також невеликі варіації в процедурах очищення можуть значно вплинути на кінцевий ступінь чистоти імуногена. Як правило, при використанні в даному документі, імунологічні препарати, які містять домішки від найнижчого відсотка до найвищого, будуть описані як 1) «високоочищені», 2) «середньоочищені», 3) «мінімально очищені», 4) «сирий препарат», відповідно. «Високоочищений» препарат матиме найнижчий рівень всіх типів домішок. «Середньоочищений» препарат буде, відповідно, мати відносно низький рівень більшості типів домішок, але може мати одну домішку, якої буде більше, у порівнянні з її рівнем, який можна спостерігати в «високоочищеному» препараті. У іншому випадку, «мінімально очищений препарат» матиме відносно низький рівень деяких типів домішок, але може мати більше ніж один тип домішок, яких буде більше, у порівнянні з їх рівнем в «середньоочищеному» препараті. Як і слід було чекати, «сирий препарат» має найбільш високий рівень всіх типів домішок у порівнянні з іншими типами препаратів, які обговорюються в даному документі. У даному винаході пропонується нова емульсія олія-в-воді (О/В), яка включає: (1) водний розчин, який включає вакцинний антиген або імуноген, здатний індукувати імунну відповідь у господаря; (2) водний розчин, який включає іонну поверхнево активну речовину; (3) неіонну гідрофільну поверхнево активну речовину; (4) мінеральну олію; У одному втіленні, нова емульсія олія-в-воді (О/В) включає: (1) водний розчин, який включає вакцинний антиген або імуноген, здатний індукувати імунну 6 UA 107940 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відповідь у господаря; (2) водний розчин, який включає іонну поверхнево активну речовину, таку як сапонін; (3) неіонну гідрофільну поверхнево активну речовину із значенням гідрофільно-ліпофільного балансу (ГЛБ) більшим ніж 13 і меншим ніж 40 (ГЛБ ≥ 13, конкретно, з ГЛБ ≥ 13,5, і бажано з ГЛБ ≥ 14); (4) мінеральну олію; (5) неіонну ліпофільну поверхнево активна речовина; (6) неіонну гідрофільну поверхнево активну речовину з низьким значенням ГЛБ (значення ГЛБ від 9 до 13). У іншому втіленні, в даному винаході пропонується нова емульсія олія-в-воді (О/В), яка включає: (1) водний розчин, який включає вакцинний антиген або імуноген, здатний індукувати імунну відповідь у господаря; (2) водний розчин, який включає іонну поверхнево активну речовину, таку як сапонін (3) необов'язковий водний розчин, який включає гідроксид алюмінію; (4) неіонну гідрофільну поверхнево активну речовину із значенням гідрофільно-ліпофільного балансу (ГЛБ) більшим ніж 13 і меншим ніж 40 (ГЛБ ≥ 13, конкретно, з ГЛБ ≥ 13,5, і, бажано, з ГЛБ ≥ 14); (5) мінеральну олію; (6) неіонну ліпофільну поверхнево активну речовину; і (7) неіонну гідрофільну поверхнево-активну речовину з низьким значенням ГЛБ (значення ГЛБ від 9 до 13). Деякі емульсії, отримані відповідно до даного винаходу, засновані на комбінації, щонайменше, чотирьох (4) поверхнево-активних речовин, при цьому можливе використання одного або декількох поверхнево-активних речовин, які належать до кожної групи. Три (3) з цих груп включають неіонні поверхнево-активні речовини і одна (1) з цих груп включає іонні поверхнево-активні речовини, наприклад, сапоніни. У одному з таких втілень, концентрація іонної поверхнево-активної речовини (2) в емульсії (у даному описі це означає кінцеву емульсію, яка включає всі інгредієнти, якщо інше не вказане) складає від близько 0,01% до близько 10%>. У одному з втілень, концентрація неіонної поверхнево-активної речовини (7) в емульсії (у даному описі це означає кінцеву емульсію, яка включає всі інгредієнти, якщо інше не вказане) складає від 1% до 8%, конкретно, від 1,5% до 6%, бажано, від 2% до 5%, краще, від 2,5% до 4%, виражених у вигляді процентного відношення маси до об'єму емульсії (мас./об.). Ця група поверхнево-активних речовин включає неіонні гідрофільні поверхнево-активні речовини, які мають низьке значенняГЛБ (значення ГЛБ від 9 до 13). Дана група включає зокрема етоксильований моноефір сорбіту і жирної кислоти (конкретно, 5 етоксигруп) (наприклад, етоксильований сорбітан моноолеат, такий як «TWEEN 81®», диефіри етоксильованої жирної кислоти і сорбітану, етоксильовані триефіри сорбіту і жирної кислоти (конкретно, 20 етоксигруп) (наприклад, етоксильований сорбітан триолеат, такий як «TWEEN 85®»), етоксильований сорбітан тристеарат, такий як «TWEEN 65®», етоксильовані жирні спирти (конкретно, 5-10 етоксигруп) (наприклад, «BRIJ 76®», «BRIJ 56®», «BRIJ 96®»), етоксильовані жирні кислоти (конкретно, 5-10 етоксигруп) (наприклад, «Simulsol 2599®», «MYRJ 45®»), етоксильовану рицинову олію (конкретно, 25-35 етоксигруп) (наприклад, «ARLATONE 650®», «ARLATONE G®»), та їх комбінації. Кращими є етоксильовані диефіри сорбіту і жирної кислоти і етоксильовані триефіри сорбіту і жирної кислоти, а також комбінації цих двох видів. Жирну кислоту бажано вибирають з групи, яка складається з олеату, пальмітату, стеарату, ізостеарату, лауринату та їх комбінації. Кращі етоксильовані триефіри сорбіту і жирної кислоти включають етоксильований сорбітан триолеат, такий як «TWEEN 85®»), або етоксильований сорбітан тристеарат, такий як «TWEEN 65®». У одному з деяких втілень концентрація неіонної гідрофільної поверхнево-активної речовини (4) як правило складає від 0,1% до 1,5%, конкретно від 0,2% до 1,4%, бажано, від 0,3% до 1,3%, краще, від 0,4% до 1,2%, і виражена у вигляді процентного відношення маси до об'єму емульсії (мас./об.). Ця друга група поверхнево-активних речовин включає неіонні гідрофільні поверхневоактивні речовини, які мають значення гідрофільно-ліпофільного балансу (ГЛБ) (ГЛБ ≥ 13, конкретно ГЛБ ≥ 13,5, і бажано, ГЛБ ≥ 14). Дана група включає етоксильовані моноефіри сорбіту і жирної кислоти (конкретно, 20 етоксигруп) (наприклад, етоксильований сорбітанмонолауринат, такий як «TWEEN 20®», етоксильований сорбітанмонопальмітат, такий як «TWEEN 40®», етоксильований сорбітанмоностеарат, такий як «TWEEN 60®», етоксильований 7 UA 107940 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сорбітанмоноолеат, такий як «TWEEN 80®», етоксильовані жирні спирти (конкретно, 15-30 етоксигруп) (наприклад, «BRIJ 78®», «BRIJ 98®», «BRIJ 721®»), етоксильовані жирні кислоти (конкретно, 15-30 етоксигруп) (наприклад, «MYRJ 49®», «MYRJ 51®», «MYRJ 52®», «MYRJ 53®»), неіонні блок-співполімери (наприклад, співполімер поліоксиетилену/поліоксипропілену (РОЕ-РОР), такий як «LUTROL F127®», «LUTROL F68®»), та їх комбінації. Для неіонних блок-співполімерів процентний вміст може бути нижчим і зокрема складати від 0,1% до 0,5%, конкретніше, від 0,2% до 0,4% (відношення маси до об'єму емульсії (мас./об.)). Кращі поверхнево-активні речовини (4) включають етоксильовані моноефіри сорбіту і жирної кислоти, такі як описані вище. У одному з деяких втілень концентрація неіонної ліпофільної поверхнево-активної речовини (6) складає від 0,1% до 2,5%, конкретно від 0,2% до 2%, бажано, від 0,2% до 1,5%, краще, від 0,2% до 1,2%, і виражена в процентному відношенні маси до об'єму емульсії (мас./об.). Дана група поверхнево-активних речовин включає ефіри сорбіту і жирної кислоти (наприклад, сорбітанмонолауринат, типу «SPAN 20®», сорбітанмонопальмітат, такий як «SPAN 40®», сорбітанмоностеарат, такий як «SPAN 60®», сорбітантристеарат, такий як «SPAN 65®», сорбітанмоноолеат, типу «SPAN 80®», сорбітантриолеат, типу «SPAN 85®», сорбітанмоноізостеарат, такий як «ARLACEL 987®», сорбітанізостеарат, такий як «CRILL 6®»), ефіри маніту і жирної кислоти наприклад, «MONTANIDE 80®», маніт моноолеат (такий як «ARLACEL A®»), маніт диолеат, маніт тріолеат, маніт тетраолеат), етоксильовані ефіри жирної кислоти і маніту (2, 3 або 4 етоксигрупи) (наприклад, «MONTANIDE 888®», «MONTANIDE 103®», етоксильований маніт моноолеат, етоксильований маніт диолеат, етоксильований маніт тріолеат, етоксильований маніт тетраолеат), та їх комбінації. Жирну кислоту бажано вибирають з групи, яка складається з олеату, пальмітату, стеарату, ізостеарату, лауринату та їх комбінації. Кращі поверхнево-активні речовини (6) включають ефіри сорбіту і жирної кислоти, зокрема, описані вище або їх комбінації. Поверхнево-активні речовини за винаходом можуть містити жирні кислоти тваринного або рослинного походження. Зміна одного походження на інше (наприклад, тваринний «TWEEN 80®» на рослинний «TWEEN 80®») може здійснюватися з незначною регуляцією складу емульсії. Емульсія запропонована винаходом може мати загальну концентрацію поверхнево-активних речовин, виражену відношенням маси до об'єму емульсії, яке складає від 1,2% до 10%, конкретно від 2% до 8%, бажано від 3% до 7%, краще, від 4% до 6%. Як правило, емульсія запропонована винаходом може мати температуру обернення фаз (ТОФ), яка є ≥ 33 °C, конкретно, коливається від 33 °C до 65 °C, конкретніше, від 36 °C до 60 °C, бажано, від 37 °C до 55 °C, і краще, від 38 °C до 50 °C. ТОФ є температурою, за якої емульсія вода-в-олії змінюється на емульсію олія-в-воді або дефазується (руйнується емульсія і розділення 2 фаз). Значення ТОФ може бути визначене різними способами, як наприклад, за допомогою візуального проявлення (наприклад, див. приклад 2) або за допомогою провідності. Емульсію поміщають за температури нижчої ТОФ емульсії, наприклад, біля 25 °C у водяну баню. Температуру поступово збільшують. Спостерігають зміну візуального аспекту емульсії в порівнянні з контрольною емульсією, а саме зміну текучості, в'язкості, розділення на дві фази, зміну поверхневого аспекту завдяки міграції олійної фази на поверхню. Температура, за якої спостерігають зміну візуального аспекту, є значенням ТОФ емульсії. У іншому випадку, ТОФ визначають за допомогою швидкого переходу від значення провідності близько 5-8 мілісіменс/сантиметр (мС/см) (емульсія олія-в-воді) до значення близько 0 мС/см (емульсія вода-в-олії), визначеного за допомогою зонда, поміщеного в емульсію біля її поверхні. Температура, за якої спостерігають обернення, є значенням ТОФ емульсії. Фахівець в даній галузі здатний без додаткових експериментів визначити комбінації поверхнево-активних речовин і олії, включаючи їх придатні концентрації, з метою отримання емульсій запропонованих винаходом і. конкретно, емульсій, які мають значення ТОФ в інтервалах, визначених вище. Як правило, емульсії запропоновані винаходом можуть містити концентрацію олії, виражену відношенням об'єму до об'єму емульсії, від 3% до 55% олії, конкретно, від 5% до 50% олії, бажано, від 10% до 40% олії і, краще, від 20% до 40% олії. За визначенням, інтервали значень в даному описі завжди включають обмеження інтервалу, якщо не вказане інше. Олія, яка при цьому використовується може бути мінеральною олією, включаючи, зокрема, парафінову олію, таку як ізопарафінову олію і/або нафтенову олію, сквалан, пристан, поліізобутенову олію, гідрогенізовану поліізобутенову олію, полідеценову олію, поліізопренову олію, поліізопропенову олію тощо. Одна з кращих мінеральних олій, яка використовується в 8 UA 107940 C2 5 10 15 20 25 30 35 даному винаході, може включати олію, яка має лінійний або розгалужений вуглецевий ланцюг, який містить атоми вуглецю в кількості більшій ніж 15, бажано від 15 до 32, вільний від ароматичних з'єднань. Такі олії можуть, наприклад, бути оліями, які продаються під марками «MARCOL 52®» або «MARCOL 82®» (виробництво Esso, Франція) або «DRAKEOL 6VR®» або «DRAKEOL 5®» «DRAKEOL 7®» (виробництво Penreco, США), «CLEAROL®» (виробництво Sonneborn, США), «Paraffin Oil Codex AAB2®» (виробництво Aiglon, Франція), «BLANDOL» (виробництво Sonneborn, США), «ONDINA 915» (виробництво Shell, Великобританія). Олія також може бути сумішшю олій, яка включає, щонайменше, два олії, вибраних з поміж олій, описаних в даному документі, та їх суміші в будь-якій пропорції. Суміш олій також може включати, щонайменше, одну олію, вибрану з поміж олій, описаних вище, і, щонайменше, одну рослинну олію, і ця рослинна олія складає від близько 0,1% до близько 33% олійної фази, бажано, від близько 10% до близько 25% об./об. Цими рослинними оліями є ненасичені олії, багаті олеїновою кислотою, здатними до біологічної деградації і, бажано, рідкими за температури зберігання (біля +4 °C) або, щонайменше, з можливістю отримання емульсій, які є рідкими за даної температури. Наприклад, рослинна олія може бути арахісовою олією, горіховою олією, соняшниковою олією, сафлоровою олією, соєвою олією, онагровою олією тощо. У одному з деяких втілень, гідрофільні поверхнево-активні речовини (4) і (7) бажано включають поверхнево-активні речовини, які містять в молекулах однаковий гідрофільний компонент. Наприклад, застосування включає етоксильовані ефіри сорбіту і жирної кислоти для кожної з гідрофільних поверхнево-активних речовин (4) і (7). Наприклад, якщо як неіонну гідрофільну поверхнево-активну речовину вибирають «TWEEN 85®», яка має низьке значення ГЛБ, то неіонна гідрофільна поверхнево-активна речовина, яка має високе значення ГЛБ, бажано міститиме гідрофільний компонент, який складається з етоксильованого сорбітану, такого як «TWEEN 80®». Як правило, даним винаходом передбачено застосування водного розчину, який включає придатний для застосування у ветеринарії або фармацевтично прийнятний носій, наповнювач або розчинник, який включають зокрема, стерильну воду, фізіологічний розчин, глюкозу, буфер тощо. Носій, наповнювач або розчинник також можуть включати поліоли, глюциди або буферні агенти для стабілізації pH. Носій, наповнювач або розчинник можуть, наприклад, також включати амінокислоти, пептиди, антиоксиданти, бактерицидні або бактеріостатичні сполуки. Водний розчин додають до олії і поверхнево-активних речовин в такій кількості, щоб отримати 100% об'єму емульсії запропонованої винаходом. Гідрофільно-ліпофільний баланс (ГЛБ) емульсії дає можливість оцінки гідрофільного або ліпофільного чинника поверхнево-активної речовини. ГЛБ амфіфільної молекули, як правило, розраховують таким чином: ГЛБ = 40 45 50 55 (20 × масу гідрофільної частини) маса амфіфільної частини ГЛБ може мати значення в інтервалі від 0 (для найбільш ліпофільної молекули) до 20 (для найбільш гідрофільної молекули). Відповідно до хімічного складу поверхнево-активної речовини (важливо, наприклад, додавання етоксигруп або алкеноксидів), ця оцінка може змінюватися і інтервал значень ГЛБ може збільшуватися (наприклад, «LUTROL F68®» має ГЛБ 29). При використанні суміші поверхнево-активних речовин, ГЛБ суміші є сумою ГЛБ кожної поверхневоактивної речовини, збалансованою за допомогою їх масового співвідношення: ГЛБ = (ГЛБ поверхнево-активної речовини X × масу поверхнево-активної речовини X) + (ГЛБ поверхнево-активної речовини Y × масу поверхнево-активної речовини Y)/(маса поверхневоактивної речовини X + маса поверхнево-активної речовини Y) У одному втіленні емульсії, отриманої відповідно до даного винаходу, кінцеве значення ГЛБ емульсії складає від близько 9 до близько 12, бажано, від близько 9,5 до близько 11,5 і, краще, від близько 10 до близько 11,5. Даним винаходом передбачена емульсія, яка включає парафінову олію (конкретно, в концентрації від близько 10% до близько 40% і, бажано, від близько 20% до близько 40%), вираженою у вигляді відношення об'єму до об'єму емульсії (об./об.)); моноефіри сорбіту і жирної кислоти (як неіонної ліпофільної поверхнево-активної речовини), етоксильований триефір сорбіту і жирної кислоти (як неіонної гідрофільної поверхнево-активної речовини, яка має низьке значення ГЛБ); і етоксильований моноефір сорбіту і жирної кислоти (як неіонної гідрофільної поверхнево-активної речовини з високим значенням ГЛБ). Зокрема, моноефір сорбіту і жирної кислоти є сорбітанмоноолеатом (конкретно, в концентрації від 0,2% до 1,5%, бажано, від 0,2% 9 UA 107940 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 до 1,2%, вираженої у вигляді відношення маси до об'єму емульсії (мас./об.)), етоксильований триефір сорбіту і жирної кислоти є етоксильованим сорбітантриолеатом (конкретно, в концентрації від 2% до 5%, бажано, від 2,5% до 4% мас./об.)) і етоксильований моноефір сорбіту і жирної кислоти є етоксильованим сорбітанмоноолеат (конкретно, в концентрації від 0,3% до 1,3%, бажано, від 0,4% до 1,2% мас./об.). Наприклад, емульсія включає парафінову олію в концентрації близькій до 29,3% відношення об'єму до об'єму емульсії, сорбітанмоноолеат в концентрації 0,6% відношення маси до об'єму емульсії, етоксильований сорбітантриолеат в концентрації 3,4% відношення маси до об'єму емульсії, і етоксильований сорбітанмоноолеат в концентрації 0,75% відношення маси до об'єму емульсії. У другому втіленні відповідно до даного винаходу, емульсія включає парафінову олію (конкретно, в концентрації від 10% до 40%, бажано, від 20% до 40% об./об.), моноефіри сорбіту і жирної кислоти (як неіонної ліпофільної поверхнево-активної речовини), етоксильований триефір сорбіту і жирної кислоти (як неіонної гідрофільної поверхнево-активної речовини, яка має низьке значення ГЛБ) і неіонний блок-співполімер (як неіонної гідрофільної поверхневоактивної речовини, яка має високе значення ГЛБ). Зокрема, моноефір сорбіту і жирної кислоти є сорбітанмоноолеатом (конкретно, в концентрації від 0,2% до 1,5%, бажано, від 0,2% до 1,2%, мас./об.), етоксильований триефір сорбіту і жирної кислоти є етоксильованим сорбітантриолеатом (конкретно, в концентрації від 2% до 5%, бажано, від 2,5% до 4% мас./об.)), а неіонний блок-співполімер є полімером поліоксиетилен/поліоксипропілен РОЕ-РОР) (конкретно в концентрації від 0,1% до 0,5%, бажано, від 0,2% до 0,4% мас./об.). Наприклад, емульсія включає парафінову олію в концентрації близько 29,3% об./об., сорбітанмоноолеат в концентрації 0,6% мас./об., етоксильований сорбітантриолеат в концентрації 3,4% мас./об., і етоксильований сорбітанмоноолеат в концентрації 0,25% мас./об. У конкретному втіленні, у винаході пропонується емульсія для ін'єкцій олія-в-воді (О/В), яка включає: (1) водний розчин, який включає активний інгредієнт, такий як лікарський засіб або імуноген, бажано, імуноген; (2) водний розчин, який містить сапонін (3) мінеральну олію; (4) неіонну ліпофільну поверхнево активну речовину; (5) неіонну гідрофільну поверхнево активну речовину з низьким значенням ГЛБ, яке включає етоксильований диефір сорбіту і жирної кислоти (яке може приймати значення від 11 до 13). У іншому конкретному втіленні, у винаході пропонується емульсія для ін'єкцій олія-в-воді (О/В), яка включає: (1) водний розчин, який включає активний інгредієнт, такий як лікарський засіб або імуноген, бажано, імуноген; (2) водний розчин, який включає сапонін (3) водний розчин, який включає гідроксид алюмінію; (4) мінеральну олію; (5) неіонну ліпофільну поверхнево-активну речовина; (6) неіонну гідрофільну поверхнево-активну речовину з низьким значенням ГЛБ, яка включає етоксильований диефір сорбіту і жирної кислоти (яка може приймати значення від 11 до 13). Емульсія згідно даному втіленню включає етоксильовані ефіри сорбіту і жирної кислоти, які можуть містити до 20 етоксигруп. Жирні кислоти можуть бути тваринного або рослинного походження і можуть бути вибрані з групи, яка складається з олеату, пальмітату, стеарату, ізостеарату, лауринату та їх комбінації. У одному втіленні, етоксильована жирна кислота бажано є олеатом. Інші інгредієнти, а також основні властивості емульсії, такі як ТОФ, можуть мати однакові характеристики на відміну від інших, описаних вище. Бажано, якщо поверхнево-активна речовина (6) включає етоксильований диефір сорбіту і жирної кислоти, такий як етоксильований сорбітандиолеат, етоксильований сорбітандистеарат і етоксильований сорбітандиізостеарат, етоксильований сорбітандипальмітат, етоксильований сорбітандилауринат та їх комбінації. Необов'язково до емульсії можуть бути додані інші сполуки як ко-ад’юванти, які включають зокрема, алюмінієвий галун; CpG-олігонуклеотиди (ODN), конкретно, ODN 2006, 2007, 2059, або 2135 (Pontarollo R.A. et al. Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 43-59; Wernette CM. et_al., Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 223-236; Mutwiri G. et al.. Vet. Immunol. Immunopath, 2003, 91: 89103); поліА-поліУ («Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach», edited by Michael F. Powell and Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, 6: 03); диметилдиоктадециламоній бромід (DDA) («Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach», edited by Michael F. Powell and Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, volume 6: 157), N,N-диоктадецил-N',N'-біс(2 10 UA 107940 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гідроксиетил)пропандиамін (такий як AVRIDINE®) (там же, р. 148), карбомер, хітозан (див. наприклад, Пат. США № 5980912). У даному винаході також пропонується спосіб отримання вакцинної композиції або імунологічної композиції, який передбачає, щонайменше, одну антигенну або імуногенну композицію і ад’ювант або емульсії, отримані відповідно до даного винаходу. Антигенна або імуногенна композиція може бути включена в процесі утворення емульсії або, в альтернативному втіленні, антигенна або імуногенна композиція, яка бажано додатково включає сапонін і яка необов'язково додатково включає гідроксид алюмінію, може бути додана до емульсії пізніше, наприклад, безпосередньо перед застосуванням. Повна кількість використовуваного водного розчину може бути присутньою з початку отримання емульсії. Або це може бути тільки частина водного розчину, який використовується для утворення емульсії, а кількість водного розчину, яка залишилася, додають після включення імуногена. Імуноген або антиген можуть бути представлені в сухому вигляді або можуть бути присутніми в деяких інших придатних формах, наприклад в твердій, яку потім змішують з емульсією, або, в іншому випадку, антиген може бути представлений в розчині, конкретно, у водному розчині, і цей розчин змішують з емульсією. Поверхнево-активні речовини додають або до олії, або до водного розчину відповідно до їх розчинності. Наприклад, неіонні ліпофільні поверхнево-активні речовини додають до олії за винаходом, тоді як неіонні гідрофільні поверхнево-активні речовини, які мають високе значення ГЛБ, додають до водного розчину. Емульгування можуть проводити відповідно до придатних методів, відомих фахівцеві в даній галузі. Наприклад, в одному втіленні даного винаходу, емульсію можна отримувати за температури нижчої ТОФ емульсії, конкретно, за кімнатної температури, наприклад, при біля 25 °C. Водну фазу і олійну фазу змішують разом механічним перемішуванням, наприклад, за допомогою турбіни, обладнаної ротором-статором, здатним створювати високе зусилля зрушення. Бажано, перемішування починають з низькою швидкістю обертання і поволі збільшують разом з поступовим додаванням, як правило, водного розчину до олії. Бажано, водний розчин поступово додають до олії. Відношення олії/водного розчину може бути відрегульоване для отримання емульсії вода-в-олії (В/О), наприклад, в концентрації від близько 40% до близько 55% олії (об./об.). Коли перемішування припиняють, емульсія поступово змінюється на емульсію О/В (обернення фаз). Після обернення і у разі потреби, емульсію розводять шляхом додавання водного розчину з отриманням цільової концентрації олії в кінцевій емульсії. Емульсію можна зберігати за температури біля 5 °C. У іншому втіленні, емульсію можна отримувати за температури вищої, ніж ТОФ емульсії. На першій стадії, водну фазу і олійну фазу змішують разом за температури вищої, ніж ТОФ емульсії. Бажано, водний розчин поступово додають до олії. Відношення олії/водного розчину може бути відрегульоване для отримання емульсії вода-в-олії (В/О), наприклад, в концентрації від близько 40% до близько 55% олії (об./об.). Емульгування може бути здійснене за допомогою перемішування з використанням невеликого зусилля зрушення або за його відсутності, наприклад, за допомогою статичного міксера або за допомогою гребного гвинта або за допомогою турбіни з дуже низькою швидкістю обертання. Отримана емульсія є емульсією водав-олії (В/О). У другій стадії, емульсію поступово охолоджують до температури нижчої від ТОФ. Під час цієї стадії, емульсія змінюється на емульсію О/В (обернення фаз). Після обернення і у разі потреби, емульсію розводять шляхом додавання водного розчину з отриманням цільової концентрації олії в кінцевій емульсії. Емульсію можна зберігати за температури біля 5 °C. Розмір краплин емульсії може становити від близько 100 нм до близько 500 нм. Емульсію можна застосовувати, наприклад, як ад’ювант для включення до складу вакцинної композиції або фармацевтичної композиції. Емульсію також можна застосовувати як розчинник для розчинення сухого продукту, особливо сухого продукту, який містить наприклад, ослаблені мікроорганізми або живі рекомбінантні вектори. У конкретному втіленні первинну емульсію отримують з використанням лише частини водного розчину. Ця первинна емульсія може бути розведена шляхом додавання суспензії активного інгредієнта, такого як лікарський засіб або імуноген, бажано, імуноген, з отриманням кінцевої композиції. У іншому випадку, первинну емульсію можна розводити з використанням водного розчину і застосовувати для розчинення висушеного продукту, такого як сухий продукт. Імуноген або антиген, придатний для використання в даному винаході, може бути вибраний з групи, яка складається з інактивованих патогенів, ослаблених патогенів, імуногенних субодиниць (наприклад, білків, поліпептидів, пептидів, епітопів, гаптену), або рекомбінантних експресуючих векторів, які включають плазміди, які містять імуногенні вставки. У одному втіленні даного винаходу, імуногеном є інактивований або неживий мікроорганізм. У іншому 11 UA 107940 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 втіленні винаходу вакцинна композиція включає імуноген, вибраний з групи пташиних патогенів, які включають зокрема Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, вірус інфекційного бронхіту (IBV), вірус ньюкаслської хвороби (NDV), синдром зниження несучості (EDS), або вірус інфекційного бурситу IBDV), пташиний вірус грипу тощо, а також з їх комбінації. У іншому випадку вакцинна композиція включає імуноген, вибраний з поміж котячих патогенів, таких як зокрема котячий вірус герпесу (FHV), котячий каліцивірус (FCV), котячий вірус лейкозу (FELV), котячий вірус імунодефіциту (FIV), вірус сказу тощо, та з їх комбінацій. Ще в одному втіленні, вакцинна композиція запропонована даним винаходом включає імуноген, вибраний з поміж собачих патогенів, які включають, зокрема вірус сказу, вірус герпесу собак (CHV), парвовірус собак (CPV), коронавірус собак, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorragiae, Leptospira grippotyphosa, Borrelia burgdorferi, Bordetella bronchiseptica тощо, та їх комбінації. Ще в одному втіленні винаходу, композиція включає імуноген, вибраний з поміж патогенів коней, таких як вірус герпесу коней (типу 1 або типу 4), вірус грипу коней, правця, вірус Західного Нілу тощо або їх комбінації. Ще в одному втіленні винаходу, композиція включає імуноген, вибраний з поміж патогенів парнокопитних, таких як вірус ящура (FMDV), вірус сказу, бичачий ротавірус, бичачий вірус парагрипу типу 3 (bPIV-3), бичачий коронавірус, бичачий вірус діареї (BVDV), бичачий респіраторно-синцитіальний вірус (BRSV), бичачий вірус інфекційного ринотрахеїту (IBR), Escherichia coli, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica тощо та їх комбінації. Ще в одному втіленні даного винаходу, імуноген вибирають зі поміж патогенів свиней, таких як зокрема вірус свинячого грипу (SIV), свинячий цирковірус типу 2 (PCV-2), свинячий вірус репродуктивно-респіраторного синдрому (PRRS), вірус псевдосказу (PRV), свинячий парвовірус (PPV), FMDV, Mycoplasma hyopneumoniae, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli тощо та їх комбінацій. У іншому втіленні винаходу пропонуються вакцинні композиції, які включають, щонайменше, один імуноген і емульсію у фармацевтично прийнятному носієві. Імуногени, які включають віруси, бактерії, гриби і так далі, можуть бути отримані за допомогою методів культивування in vitro з використанням придатного культурального середовища або ліній клітин-господарів і з використанням придатних способів, добре відомих фахівцеві в даній галузі. Наприклад, PRRS можна культивувати у придатній клітинній лінії, такій як клітинна лінія MA-104 (див. серед інших Пат. США № 5587164; 5866401; 5840563; 6251404). Аналогічно, PCV-2 можна культивувати з використанням клітинної лінії PK-15 (див. Пат. США № 6391314); SIV можна культивувати на яйцях (Пат. США № 6048537); і Mycoplasma hyopneumoniae можна культивувати у придатному культуральному середовищі (Пат. США № 5968525;US 5338543; Ross R. F. et al. Am. J. Vet. Res., 1984, 45: 1899-1905). З метою отримання інактивованої імунологічної або вакцинної композиції, патоген бажано інактивують після культивування і необов'язково піддають очищенню засобами хімічної обробки з використанням, наприклад, формаліну або формальдегіду, бета-пропіолактону, етиленіміну, бінарного етиленіміну (BEI), і/або за допомогою фізичної обробки (наприклад, теплової або ультразвукової). Способи інактивації добре відомі фахівцям в даній галузі. Наприклад, вірус FMD може бути інактивований за допомогою етиленіміну (Cunliffe, HR, Applied Microbiology, 1973, р. 747-750) або за допомогою високого тиску (Ishimaru et al, Vaccine 22 (2004) 2334-2339), вірус PRRS може бути інактивований за допомогою бета-пропіолактону (Plana-Duran et al. Vet. Microbiol, 1997, 55: 361-370) або за допомогою BEI-обробки (Пат. США № 5587164); інактивація вірусу PCV-2 може здійснюватися з використанням обробки етилениміном або за допомогою обробки бета-пропіолактоном (Пат. США № 6391314); свинячий вірус грипу може бути інактивований з використанням детергенту типу Тритона або за допомогою обробки формальдегідом (Пат. США № 6048537); бактерії Mycoplasma hyopneumoniae можуть бути інактивовані за допомогою обробки формальдегідом (Ross R. F. вище), за допомогою етилениміну або за допомогою BEI-обработки (див. WO 91/18627). Інактивований патоген може бути сконцентрований за допомогою придатних методів концентрації, конкретно, за допомогою ультрафільтрації, і/або може бути очищений за допомогою придатних способів очищення, конкретно, з використанням методів хроматографії, які включають зокрема гель-фільтрацію, ультрацентрифугування в градієнті сахарози або селективне осадження, конкретно, у присутності поліетиленгліколю (ПЕГ). Імуноген, який застосовується у вакцинних композиціях запропонованих даним винаходом, також включає експресуючі вектори. Такі вектори включають зокрема in vivo рекомбінантні експресуючі вектори, такі як полінуклеотидний вектор або плазміда (EP-A2-1001025; Chaudhuri P, Res. Vet. Sci. 2001, 70: 255-6), вірусні вектори, такі як зокрема аденовірусні вектори, вектори 12 UA 107940 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 на основі вірусів віспи, таких як вірус віспи птахів (Пат. США № 5174993; 5505941; і 5766599), або вектори на основі поксвірусу кенарів (Пат. США № 5756103) або бактерійні вектори (Escherichia coli або види Salmonella). Даний винахід також охоплює склад мультивалентних імунологічних композицій або комбінацію вакцинних композицій. Наприклад, антигени, які застосовуються в комбінації з бичачим бактерином, отриманому відповідно до даного винаходу, включають зокрема Mycoplasma bovis, Pasteurella sp., особливо, P. multocida і P. haemolytica, Haemophilus sp., особливо H. somnus, Clostridium sp., Salmonella, Corynebacterium, Streptococcus, Staphylococcus, Moraxella, E. coli і так далі. У даному винаході додатково пропонуються способи індукції імунної відповіді у організмагосподаря, наприклад, у тварини, причому способи включають введення організму-господареві імунологічної композиції або вакцинної композиції запропонованої винаходом. Спричинені таким чином імунні відповіді зокрема є антитільною і/або клітинною імунною відповіддю, а конкретніше, відповіддю гамма-інтерферону. Конкретно, в даному винаході пропонуються способи імунізації проти інфекції або профілактики або зменшення симптомів, викликаних інфікуванням тварини патогенним організмом (наприклад, інфікуванням вірусом, бактерією, грибами або найпростішими паразитами). Спосіб запропонований даним винаходом застосовується для хребетних тварин, включаючи зокрема, людей, родину собачих (наприклад, собак), котячих (наприклад, кішок); непарнокопитних (наприклад, коней), родину парнокопитних (наприклад, велика рогата худоба) і свиней (наприклад, свиней), а також для птахів, включаючи зокрема, курей, індичок,гусей, перепілок, фазанів, папуг, зябликів, яструбів, ворон і безкілевих (страусів, ему і казуарів тощо). У конкретному аспекті винаходу, ці способи передбачають вакцинацію вагітних самок перед пологами шляхом введення вакцинної композиції, отриманої за винаходом. Ці способи додатково включають індукцію захисних антитіл, викликану протоколом вакцинації, і перенесення цих захисних антитіл від вакцинованих вагітних самок до їх потомства. Перенесення таких материнських антитіл згодом захищає потомство від захворювання. Дозування вакцинної композиції, отриманої відповідно до даного винаходу, залежатиме від виду, породи, віку, розміру, історії вакцинації і стану здоров'я тварини, яка піддається вакцинації. Інші чинники типу концентрації антигену, додаткових компонентів вакцин, і шляху введення (тобто, підшкірного, внутрішньошкірного, перорального, внутрішньом'язового або внутрішньовенного введення) також сприятимуть ефективному дозуванню. Дозування вакцини для введення легко визначається на основі концентрації антигену вакцини, шляху введення, віку і стану тварини, яка піддається вакцинації. Кожна партія антигенів може бути індивідуально відкалібрована. У іншому випадку, систематичні випробування імуногенності різних дозувань, а також дослідження LD50 і інші процедури скринінгу можна застосовувати для визначення ефективного дозування вакцинної композиції пропонованої даним винаходом без проведення зайвих експериментів. З представлених нижче прикладів легко зрозуміти, яким повинне бути приблизне дозування і який приблизно об'єм відповідатиме вакцинній композиції, описаній в цьому документі. Критичний чинник полягає в тому, що дозування забезпечує, щонайменше, частковий захисний ефект проти природної інфекції, що стає очевидним з причини зниження смертності і захворюваності в результаті цієї природної інфекції. Аналогічно, придатний об'єм легко оцінюється фахівцем в даній галузі. Наприклад, для птахів об'єм дози може складати від близько 0,1 мл до близько 0,5 мл і бажано від близько 0,3 мл до близько 0,5 мл. Для тваринних родин котячих, собачих і парнокопитних об'єм дози може складати від близько 0,2 мл до близько 3 мл, бажано, від близько 0,3 мл до близько 2 мл і ще краще, від близько 0,5 мл до близько 1 мл. Для тваринних родин парнокопитних і свиней об'єм дози може складати від близько 0,2 мл до близько 5 мл, бажано, від близько 0,3 мл до близько 3 мл і більше, бажано, від близько 0,5 мл до близько 2 мл. Повторні вакцинації можуть здійснюватися бажано з інтервалом періодичності для посилення початкової імунної відповіді, або коли закінчився тривалий період часу після останньої дози. У одному втіленні даного винаходу, вакцинну композицію вводять у вигляді парентеральної ін'єкції (тобто, підшкірно, внутрішньошкірно або внутрішньом'язово). Композиція може вводитися у вигляді одноразової дози або, в альтернативних втіленнях, може вводитися у вигляді повторюваних доз, від близько двох до близько п'яти, які вводять з інтервалом від близько двох до близько шести тижнів, бажано, від близько двох до близько п'яти тижнів. Проте фахівцеві в даній галузі зрозуміло, що кількість доз і часові інтервали між вакцинаціями залежать від ряду чинників, які включають зокрема вік тварини, що вакцинується, стан тварини, спосіб імунізації, кількість антигену, доступного у одній дозі тощо. Для початкової вакцинації, період, як правило, буде тривалішим, ніж тиждень і переважно складатиме від близько двох до 13 UA 107940 C2 5 10 15 20 25 30 близько п'яти тижнів. Для раніше вакцинованих тварин, повторна вакцинація перед вагітністю або під час її може здійснюватися з інтервалом близько року. Даним винаходом також передбачено введення вакцинної композиції з використанням безголкового ін'єктора, такого як «Pigjet®», «Avijet®», «Dermojet®» або «Biojector®» (Bioject, орегон, США). Фахівець в даній галузі здатний підібрати специфікації інжектора відповідно до чинників, таких як вид тварини, яка піддається вакцинації; вік і маса тварини і тому подібне, без проведення зайвих експериментів. У одному втіленні даного винаходу спосіб передбачає одноразове введення складу вакцинної композиції з емульсією за винаходом. Наприклад, в одному втіленні, вакцинна композиція є композицією інактивованого вірусу FMD, тоді як в альтернативному втіленні пропонується вакцина, яка включає композицію інактивованого вірусу PCV2. Інші імунологічні композиції або вакцини, придатні для застосування в режимі з одноразовою дозою включають зокрема інактивовані бактерії Mycoplasma hyopneumoniae, PRRS і SIV. Винахід додатково відноситься до способів лікування організму-господаря, наприклад, тварини, причому спосіб передбачає введення організму-господареві фармацевтичної композиції запропонованої винаходом, яка включає, щонайменше, один імуноген, вибраний з групи, яка складається з білків або пептидів, інактивованого або ослабленого вірусу, антитіл, алергенів, CPG ODN, факторів росту, цитокінів або антибіотиків і, конкретно, CPG ODN або цитокінов. Ці фармацевтичні композиції можна застосовувати для поліпшення показників росту у тварини, такої як курка, свиня, корова або велика рогата худоба. Даний винахід додатково відноситься до набору реагентів, який включає один флакон, який містить інгредієнт, такий як очищений імуноген, об'єднаний з емульсією, отриманою відповідно до даного винаходу. Набір реагентів може альтернативно включати перший флакон, який містить інгредієнт, такий як імуногенна або фармацевтична композиція, об'єднана з сапоніном і гідроксидом алюмінію, і другий флакон, який містить емульсію, отриману відповідно до даного винаходу. Імуноген може бути представлений в сухій формі, у висушеній формі або у вигляді водного розчину, описаного в даному документі. Далі винахід буде описаний за допомогою представлених нижче конкретних прикладів. Приклад 1 Спосіб отримання емульсії Емульсію отримують методом інверсії. На першій стадії, водну фазу і олійну фазу змішують разом при +40 °C. На другій стадії, емульсію поступово охолоджують до температури нижче ТОФ при +5 °C з метою отримання емульсії О/В. Після обернення фаз, кінцеву емульсію (тобто вакцинний склад) змішують і потім зберігають при +5 °C (підсумок даний в таблиці 1). 35 Таблиця 1 Неповна емульсія – олійна фаза (120 мл): - Сорбітан моноолеат (SPAN 80®) - Сорбітан триолеат (20 OE) (TWEEN 85®) - Парафінова олія (MARCOL 82®) Неповна емульсія-водна фаза #1 (120 мл): - 20% (мас./об.) розчину сорбітанмоноолеату (20 OE) (TWEEN 80®) Динатрійфосфатний і монокалійортофосфатний 0,02M ізотонічний буфер (pH 7,8) Неповна емульсія = олійна + водна #1 Відношення Неповна емульсія / Кінцева емульсія (тобто вакцинна композиція) Додати водну фазу #2 (120 мл): - [Динатрійфосфатний і монокалійортофосфатний 0,02 M ізотонічний буфер (pH 7,8), сапонін, гідроксид алюмінію, антигени, M102]* Неповна емульсія (ол.+водн. 1) + водн. 2 = Кінцева емульсія (тобто Вакцинна композиція) Діапазони концентрації/кількості 14 Відсоток для кожної Загальний фази відсоток (об./об.) 33 1,8% мас./об. 10,2% мас./об. 88% об./об. 33 11,25% мас./об. 85,75% об./об. 66 2/3 33 100 UA 107940 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Гідроксид алюмінію - від близько 0% до близько 1% (мас./об.), у відношенні до об'єму вакцинної композиції Сапонін - від близько 0,1 міліграма до близько 2 міліграма на 1мл вакцинної композиції Антигени - від близько 0,1 пг до близько 200 пг на 1мл вакцинної композиції M102 і Фосфат на об'єм Сорбітанмоноолеат (SPAN 80®) і Сорбітантриолеат (20 OE) (TWEEN 85®), вводили в олійну фазу. Сорбітанмоноолеат (20 OE) (TWEEN 80®) не здатний змішуватися з парафіновою масою. 20% (мас./об.) розчин TWEEN 80® отримували в тому ж буфері, що і вакцину, наприклад, в динатрійфосфатному і монокалійортофосфатному 0,02M ізотонічному буфері (pH 7,8). Коли перемішування припиняли, то емульсія перетворювалася на емульсію олія-в-воді. Емульсію поміщували в холодну камеру при 5 °C протягом, щонайменше, 4 годин. На цій стадії емульсія була первинною емульсією, яка містить 50% олійної фази. Друга стадія: водну фазу #2 отримували з використанням 120 мл динатрійфосфатного і монокалійортофосфатного 0,02M ізотонічного буфера pH 7,8 з імуногенами (інактивований FMDV, імуноген Mycoplasma hyopneumoniae, або імуноген PCV-2, описані нижче), сапоніном і гідроксидом алюмінію. Первинну емульсію, отриману в першій стадії, охолоджували до біля 5 °C, розводили шляхом додавання половини об'єму водної фази #2 за тієї ж температури і змішували шляхом перемішування з використанням магнітної мішалки протягом 1 хвилини. Кінцева концентрація поверхнево-активної речовини в емульсії TSAP склала 4,75% (мас./об.). В основному, компоненти вакцинних композицій, розкритих в даному документі, додавали в наступному порядку: 1) середовище 102 при 5 °C, 2) сапонін, 3) гідроксид алюмінію, 4) антигени, і 5) неповна емульсія (тобто комбінація олійної фази разом з водною фазою #1). Отримані за цим документом TSAP-вакцини стабільні аж до 36 місяців при 5 °C. Використовуючи такий спосіб отримання можна отримати інші емульсії, які описані в профетичних прикладах нижче: Емульсія TSAP-2 Емульсія TSAP-2 є емульсією О/В, яка містить 33% олійної фази. Олійна фаза (120мл) містить «MARCOL 82®» 88% об./об., «SPAN 80®» 1,8% мас./об. і «TWEEN 85®» 10,2% мас./об. Водна фаза #1 (120 мл) стримає динатрійфосфатний і монокалійортофосфатний 0,02M ізотонічний буфер (pH 7,8) 97,75% об./об., і «LUTROL F127®» 0,75% мас./об. Водна фаза #2 (120 мл) складається з динатрійфосфатного і монокалійортофосфатного 0,02M ізотонічного буфера (pH 7,8), сапоніну, гідроксиду алюмінію і необов'язково містить імуногени. Кінцева концентрація поверхнево-активної речовини в емульсії TSAP-2 склала 4,25% мас./об. Емульсія TSAP-3 Емульсія TSAP-3 є емульсією О/В, яка містить 50% олійної фази. Олійна фаза (160мл) містить «MARCOL 82®» 92% об./об., «SPAN 85®» 1,8% мас./об. і «BRIJ 96®» 6,2% мас./об. Водна фаза #1 (160 мл) стримає динатрійфосфатний і монокалійортофосфатний 0,02M ізотонічний буфер (pH 7,8) 98,5% об./об., і «LUTROL F127®» 0,5% мас./об., сапонін, гідроксид алюмінію і необов'язково містить імуногени. Кінцева концентрація поверхнево-активної речовини в емульсії TSAP-3 становить 4,25% мас./об. Емульсія TSAP-4 Емульсія TSAP-4 є емульсією О/В, яка містить 10% олійної фази. Олійна фаза (120 мл) містить «MARCOL 82®» 60% об./об., «SPAN 40®» 17,2% мас./об. і «ARLATONE 650®» 22,8% мас./об. Водна фаза #1 (120 мл) стримає динатрійфосфатний і монокалійортофосфатний 0,02M 2,5% ізотонічний буфер (pH 7,8) 97,5% об./об., і TWEEN 20® мас./об. Водну фазу #2 отримували з використанням динатрійфосфатного і монокалійортофосфатного 0,02M ізотонічного буфера pH 7,8, сапоніну, гідроксиду алюмінію і необов'язково містить імуногени. 100 мл первинної емульсії розводили за допомогою 400 мл водної фази #2 з отриманням емульсії TSAP-3. Кінцева концентрація поверхнево-активної речовини в емульсії TSAP-4 склала 4,25% мас./об. Приклад 2 Визначення температури обернення фаз (ТОФ) емульсії 10 мл емульсії TSAP поміщали в скляну пробірку на водяну баню за температури біля 25 °C. Емульсія TSAP була білою гомогенною емульсією. Температуру у водяній бані поступово збільшували. Зміни в стані емульсії спостерігали візуально (емульсія розділялася на дві фази завдяки міграції жовто-коричневої олійної фази до поверхні). Дана зміна є характерною ознакою руйнування емульсії. Температура, за якої спостерігають дану зміну, є значенням ТОФ емульсії. Для емульсії TSAP, ТОФ коливається в інтервалі біля 36 °C-46 °C. На Фігурах 1-5 представлені графіки визначення ТОФ для вакцинних композицій, отриманих за даним винаходом (однорічне дослідження стабільності). На Фіг. 6 представлені графіки визначення ТОФ для вакцинних композицій, отриманих за даним винаходом, які зберігали протягом 36 місяців (3-річне 15 UA 107940 C2 5 10 15 дослідження стабільності). Приклад 3 Дослідження #1: Стабільність вакцинних композицій, отриманих згідно прикладу 1 У даній таблиці представлена стабільність (тобто час в місяцях, протягом якого композиції залишаються у вигляді емульсій олія-в-воді) вакцинних композицій, отриманих за способом, описаним в прикладі 1. Композиції складаються з вказаних інгредієнтів-складників (див. композиції 1-13), і антигени, які використовувались для кожної з цих композицій, включають ізоляти інактивованого вірусу FMD, які, як передбачається, є середньо або високоочищеними. Як вказано в таблиці 2, присутність гідроксиду алюмінію забезпечує підвищену стабільність вакцини, особливо при використанні найбільш високої концентрації антигену (порівняєте підвищену стабільність композицій 9, 11, і 13 з відносно зниженою стабільністю через 12 місяців композицій 3, 5 і 7). В середньому присутність гідроксиду алюмінію в складах з вищим вмістом антигену (тобто композиції 9, 11, і 13) підвищує стабільність емульсії олія/вода протягом від близько 3-6 місяців (тобто стабільність емульсії олія/вода, яка спостерігається для композицій 3, 5, і 7) до близько дванадцяти (12) місяців (тобто стабільність емульсії олія/вода, яка спостерігається для композицій 9, 11), або навіть до близько двадцяти чотирьох (24) місяців (т.e.стабільність емульсії олія/вода, спостережувана для складу 13). Таблиця 2 Випробування Антиген (мкг/доза) Сапонін (мг/доза) Al(OH)3 (% кінцевої) Кількість доз T0 Mos T3 Mos T6 Mos T9 Mos T12 Mos T24 Mos 20 25 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 0 15 60 15 60 15 60 15 60 15 60 15 60 0 0 0 0,5 0,5 1 1 0 0 0,5 0,5 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 ,3 ,3 ,3 ,3 .3 75 О/В О/В О/В О/В О/В О/В 75 О/В О/В О/В О/В О/В О/В 75 О/В О/В В/О В/О В/О В/О 75 О/В О/В О/В О/В О/В О/В 75 О/В О/В В/О В/О В/О В/О 75 О/В О/В О/В О/В О/В О/В 75 О/В О/В О/В В/О В/О В/О 75 О/В О/В О/В О/В О/В О/В 75 О/В О/В О/В О/В О/В В/О 75 О/В О/В О/В О/В О/В О/В 75 О/В О/В О/В О/В О/В В/О 75 О/В О/В О/В О/В О/В О/В 75 О/В О/В О/В О/В О/В О/В Приклад 4 Дослідження #2: Стабільність вакцинних композицій, отриманих згідно прикладу 1 Вакцинні композиції отримували, як описано в прикладі 1 і відповідно до кількості компонентів, вказаній в таблиці 3. Як описано раніше, порядок додавання компонентів був наступним: 1) середовище 102, 2) сапонін, 3) гідроксид алюмінію, 4)очищені антигени, і 5) неповна емульсія (посилання на приклад 1, де неповну емульсію визначають у вигляді олійної фази разом з водною фазою #1). Очищеними антигенами були антигени FMDV, 01 Campos, A24 Cruzeiro, і C3 Indaial. Загальний об'єм доводили за допомогою Середовища 102 (M102, склад вказаний нижче). Таблиця 3 Номер випробування -> Неповна емульсія (мл) Водна фаза (мл) сапонін 4MIL1R159B (мг) O1(мл) [близько 1500 мкг] A24 (мл) [близько 1500 мкг] C3 (мл) [близько 1500 мкг] Гідроксид алюмінію 1,5% (мл) Середовище 102 Загальний об'єм (мл) Загальний об'єм (дози) 1 400 200 2 400 200 3 400 200 4 400 200 5 400 200 6 400 200 7 400 200 8 400 200 9 400 200 10 400 200 0 0 250 9570 0 250 9570 0 250 9570 0 0 0 18,8 16,7 15 18,8 16,7 15 18,8 16,7 15 18,8 16,7 15 18,8 16,7 15 18,8 16,7 15 18,8 16,7 15 18,8 16,7 15 18,8 16,7 15 0 0 0 0 25 25 25 150 150 150 600 300 600 300 600 300 600 300 600 300 600 300 600 300 QSP 200 мл 600 600 600 300 300 300 16 UA 107940 C2 Таблиця 4 Назва компоненту MgCl2 KCl CaCl2 CHCl3 Аланін Глюкоза Бікарбонат натрію Пептон Гідролізат лактальбуміну На 1 л M102 95 190 238 5 мл 276 г 1880 2180 3000 г 4000 г Стоковий розчин 170 мМ 400 мМ 260 мМ чистий 4500 мМ 2540 мМ Стабільність вакцини визначали згідно таблиці 5. Таблиця 5 Тест Критерії прийнятності Мода < 0,18 мкм ; SPAN = 36 °C (ТОФ) *Для вакцин без гелю окислу алюмінію **Контролі, поставлені в кінці дослідження стабільності. Для кожної вакцинної композиції температуру обернення фаз (ТОФ) визначали, як описано в прикладі 2. Кількість антигену, що додається, вказана за допомогою «гемаглютинінових одиниць» (UH) на дозу вакцини. У таблиці 6 наведено підсумок про ТОФ і виявлено, що ТОФ, як правило, залишається стабільною до 36 місяців. На Фігурі 6 представлені графіки визначення ТОФ за допомогою провідності для вакцинних композицій дослідів 1-10 (підсумок даних). Підвищення ТОФ, яке спостерігали при використанні композицій, які містять ад’ювант сапонін (тобто випробування 3, 4, 6, 7, 9, і 10), власне є поліпшенням стабільності в порівнянні з композиціями, які не містять ад’ювант сапонін (тобто випробування 2, 5, і 8). 15 Таблиця 6 Випробування Дні Антиген Сапонін (мг/доза) Гель оксиду алюмінію (%) ТОФ 1 7 22 121 330 1100 2 7 22 121 330 1100 + 3 7 23 121 330 1100 + 4 8 23 122 340 1100 + 5 7 24 121 340 1100 + 6 9 24 121 340 1100 + 7 9 29 127 340 1100 + 8 9 38 123 340 1100 + 9 14 38 133 340 1100 + 10 14 41 133 340 1100 + 0 0 0,8 2,5 0 0,8 2,5 0 0,8 2,5 0 0 0 0 0,065 0,065 0,065 0,39 0,39 0,39 39 32,5(*) 35 36,5 38,5 36 36,5 36,5 37 39,0 39 39 36,7(*) 39 40,5 39,5 40 39,5 39 40 36 36,5 37 37 39 39 39 39 39 40,5 39,5 39,5 40 39 40 37,5 37,5 32(*) 38 41 40 39,5 40 40 41,5 40 40,5 40,5 39,5 40,5 Розподіл розміру частинок (таблиця 7) емульсій, де розмір знаходиться в інтервалі, представленому в критерії дослідження, для періоду часу близько 36 місяців. 17 UA 107940 C2 Таблиця 7 Зразки Дата виготовлення Дата аналізу Ag (+/-) Сапонін (мг/доза) Гель оксиду алюмінію (% кінцевої) Мода (мкм) SPAN 04/07/05 05/07/05 0 0 0,158 0,644 27/09/05 27/09/05 27/09/05 27/09/05 27/09/05 27/09/05 27/09/05 27/09/05 27/09/05 27/09/05 04/12/09 04/12/09 04/12/09 04/12/09 04/12/09 04/12/09 04/12/09 05/12/09 05/12/09 05/12/09 + + + + + + + + + 0 0 0,8 2,5 0 0,8 2,5 0 0,8 2,5 0 0 0 0 0,065 0,065 0,065 0,39 0,39 0,39 0,146 0,145 0,148 0,154 0,144 0,144 0,144 0,146 0,145 0,145 0,650 0,661 0,633 0,582 0,670 0,672 0,672 0,790 0,789 0,787 Неповна емульсія Випробування 1 Випробування 2 Випробування 3 Випробування 4 Випробування 5 Випробування 6 Випробування 7 Випробування 8 Випробування 9 Випробування 10 5 10 15 Приклад 5 Серологічні результати після введення багаторазових доз вакцини проти вірусу ящура (FMD) з ад’ювантом у вигляді емульсії TSAP. Дослідження на великій рогатій худобі. Матеріали і методи: відбирали 90 представників великої рогатої худоби, віком від 12 до 14 місяців, не вакцинованих раніше і які не мали антитіл до FMD (Foot-and-Mouth Disease), їх розділили випадковим чином на 10 груп по 9 тварин для вакцинації. Тварин вакцинували за допомогою вказаних вакцинних композицій (9807-9814) у 1 день. Кожну з композицій, перерахованих в таблицях 8, 9, 10, і 11, отримували відповідно прикладу 1, і композиції включали всі компоненти, приведені в прикладі 1, з кількостями сапоніну і гідроксиду алюмінію, що варіюються відповідно до наступних концентрацій: кількість сапоніну складала або 0, 0,7, 1,3, або 2,7 міліграм/дозу, а кількість гідроксиду алюмінію «Algel» складала або 0% або 0,37%. Вісім (8) груп вакцинували внутрішньом'язовим введенням (група IM) і дві (2) групи вакцинували підшкірним введенням (група SC). Кожну тварину групи IM ревакцинували за допомогою відповідної вакцини на 56 день внутрішньом'язовим введенням і на 84 день підшкірним введенням. Кожну тварину групи SC ревакцинували за допомогою відповідної вакцини в дні 56 і 84 підшкірним введенням. У таблиці 8 зведені дані щодо стабільності вакцинних композицій. Таблиця 8 6 °C Номер композиції 9807 9808 9809 9810 9811 9812 9813 9814 1 Тиждень OK OK OK OK OK OK OK OK 2 Тижні OK OK OK OK OK OK OK OK Навколишнє середовище 30 Днів OK OK OK OK OK OK OK OK 1 Тиждень OK OK OK OK OK OK OK OK 2 Тижні OK OK OK OK OK OK OK OK 30 Днів OK OK OK OK OK OK OK OK 20 25 Після першої вакцинації внутрішньом'язовим введенням не було ніяких пошкоджень. Були деякі вогнища пошкодження після другої вакцинації внутрішньом'язовим введенням, але всі ці вогнища пошкоджень зникали через 28 днів після другої вакцинації внутрішньом'язовим введенням. У таблиці 9 зведені дані щодо безпечності вакцинних композицій, вказані за допомогою вимірювань маси тіла тварини, проведених в певні дні. 18 UA 107940 C2 Таблиця 9 Ідентифікатор Експерименту EXP 9807 EXP 9808 EXP 9809 EXP 9810 EXP 9811 G1 EXP 9811 G2 EXP 9812 G1 EXP 9812 G2 EXP 9813 EXP 9814 5 10 15 20 25 Статистика Серед. мас. (кг) Ст. відхил. Серед. мас. (кг) Ст. відхил. Серед. мас. (кг) Ст. відхил. Серед. мас. (кг) Ст. відхил. Серед. мас. (кг) Ст. відхил. Серед. мас. (кг) Ст. відхил. Серед. мас. (кг) Ст. відхил. Серед. мас. (кг) Ст. відхил. Серед. мас. (кг) Ст. відхил. Серед. мас. (кг) Ст. відхил. 17. XI. 08 294 33 293 34 293 33 293 33 295 34 293 31 294 29 292 30 293 30 293 30 8. XII. 08 303 30 304 36 304 33 305 32 307 31 304 32 307 33 304 32 304 27 304 31 Дата вимірювання маси тіла 15. 12. 15. 9. 12. XII. I. I. II. II. 08 09 09 09 09 305 331 330 354 352 31 35 33 34 34 305 331 328 352 355 35 35 41 39 42 304 327 325 351 345 32 29 33 29 37 307 330 330 350 348 30 39 36 37 34 307 328 329 352 346 31 31 34 36 35 305 328 329 346 342 34 34 37 41 39 307 329 331 352 350 34 35 35 37 36 304 330 329 352 349 32 34 37 35 32 304 332 331 357 354 27 28 30 33 30 305 327 325 348 343 29 31 30 32 35 16. II. 09 355 32 354 41 348 35 351 34 352 40 345 41 354 35 355 37 360 30 346 31 9. II. 09 372 37 370 42 365 37 374 40 369 39 364 43 371 32 369 33 378 35 365 29 Результати: У таблиці 10 підсумовані серологічні дані, зібрані під час експериментальних дослідів. 01 Campos, A24 Cruzeiro, і C3 Indaial є трьома незалежними серотипами вірусу FMD, і присутність антитіл 01, A24, і C3 є позитивним індикатором того, що вакцинний склад викликає імунну відповідь у вакцинованих. «G1» указує на те, що вакцинну композицію вводили внутрішньом'язово, а «G2» указує на те, що вакцинний композицію вводили підшкірно. Для даного винаходу, особливо для антигенів вірусу FMD має місце строга пряма кореляція між титром антитіл (тобто між сироватковим рівнем 01 Campos, A24 Cruzeiro, і C3 Indaial) і числом еквівалентного захисту популяції (англ. Equivalent Population Protection, EPP). Простіше кажучи, коли титри антитіл високі, то вакциновані тварини відповідно добре захищені від вірусної інфекції. Несподівано виявили, що присутність гідроксиду алюмінію пов'язана із значними відмінностями імунної відповіді, яка залежить від шляху введення. В присутності гідроксиду алюмінію, як в композиціях 9812G1 і 9812G2, спостерігається значне посилення імунної відповіді у вакцинованого, яка визначається за допомогою титрів антитіл, при введенні вакцинної композиції підшкірно. Не спостерігається аналогічної значної відмінності в ефективності, пов'язаної з шляхом введення, для відповідних вакцинних композицій, які не містять гідроксиду алюмінію, а саме 9811G1 і 9811G2. Причина даного посилення імунної відповіді унаслідок присутності гідроксиду алюмінію разом з використанням підшкірного шляху введення, в даний час невідома, але ефективне втілення даного винаходу включає зокрема варіацію шляху введення вакцини залежно від даних поточної і майбутньої ефективності (наприклад, титру антитіл). В порівнянні з контрольними вакцинними композиціями без ад’юванта у вигляді сапоніну (тобто 9807 і 9808), вакцинні композиції з ад’ювантом сапоніном викликають у досліджуваних тварин швидшу імунну відповідь на всі три антигени вірусу FMD, виявлені за вищим титром антитіл для композицій з ад’ювантом сапоніном в день 21. Всі разом ці дані указують на те, що даний винахід забезпечує кращу стабільність і дає можливість швидшої імунної відповіді в порівнянні з композиціями без ад’юванта у вигляді сапоніну. 30 19 UA 107940 C2 Таблиця 10 Сапонін Al(OH)3 Композимг/доза (%) ція, ID 0 0 0,7 0,7 1,3 1,3 1,3 1,3 2,7 2,7 5 10 15 0 0,37 0 0,37 0 0 0,37 0,37 0 0,37 9807 9808 9809 9810 9811 G1 9811 G2 9812 G1 9812 G2 9813 9814 O1 CAMPOS A24 CRUZEIRO D21 D56 D21 D56 TIT EPP TIT EPP TIT EPP TIT EPP 1,47 37,7 2,07 80,4 1,56 29,4 2,01 71,6 1,64 51,3 1,59 45,6 1,9 55,1 1,66 30,5 1,66 49,4 1,91 64,9 1,97 61,5 1,9 52,8 1,91 71,3 1,82 64,5 2,02 65,7 1,81 46,9 1,97 74,6 2,18 82,6 2,03 67,8 2,01 70,1 1,92 73,4 2,06 84 2,05 68,2 2,11 74 1,81 62,5 1,98 67,3 2,08 73,4 1,88 49,2 2,58 98,9 2,42 97 2,5 94,5 2,29 90 2 79,5 2,31 93,5 2,22 87,5 2,23 88,6 2,14 88,2 2,03 80,2 2,34 95,1 1,96 57,4 C3 INDAIAL D21 D56 TIT EPP TIT EPP 1,97 69,5 2,41 92,3 2,08 77,3 2,14 85,8 2,05 77,4 2,37 87,7 2,27 88,7 2,28 88 2,32 88,6 2,46 92,2 2,33 92,2 2,55 95,3 2,29 88,5 2,27 87,4 2,59 96,7 2,76 98,8 2,43 93,4 2,69 96,5 2,6 96,4 2,39 92,5 Середнє D21 D56 TIT TIT 1,67 2,2 1,88 1,8 1,89 2,1 2,07 2 2,11 2,2 2,1 2,2 2,06 2 2,56 2,5 2,22 2,4 2,36 2,1 G1 - вакцинну композицію вводили внутрішньом'язово G2 - вакцинну композицію вводили підшкірно. Приклад 6 Серологічні результати після введення двох доз вакцини проти вірусу ящура (FMD) з ад’ювантом у вигляді емульсії TSAP - дослідження на свинях. Матеріали і методи: відбирали 57 свиней, не вакцинованих раніше і які на мали антитіл до FMD, і розділяли їх випадковим чином на 9 груп по 6 тварин для вакцинації і 1 групу з трьох тварин не для вакцинації (невакциновані тварини). Тварин вакцинували вказаними вакцинними композиціями (А-І) в 1 день. Кожну з композицій, перерахованих в таблиці 11, отримували згідно прикладу 1, і композиції включали всі компоненти, приведені в прикладі 1, з сапоніном і гідроксидом алюмінію в кількостях, які варіюються відповідно до наступних концентрацій: кількість сапоніну складала або 0, 0,7, 1,3, або 2,7 міліграм/дозу, а кількість гідроксиду алюмінію «Algel» складала або 0% або 0,37%. Безпеку вакцинного складу оцінювали шляхом вимірювання декількох параметрів, включаючи ректальну температуру і візуальні ознаки реакції тварин на вакцинацію. Таблиця 11 Вакцинна A композиція Ag (мкг/доза) 0 Сапонін (міліграм/ 0 доза) Algel 0 (% кінцевої) Неповна емульсія 333 Водна фаза 2 (166 мл) Очищений FMDV 0 (мл) Сапонін (мл) 0 Algel 3% (мл) 0 M102 при 5 °C 166 Всього Загальний об'єм 500 (мл) Всього (доз) 250 20 B C D E F G H I 10 10 10 10 10 10 10 10 0 0 0,7 0,7 1,3 1,3 2,7 2,7 0 0,37 0 0,37 0 0,37 0 0,37 333 333 333 333 333 333 333 333 11,1 11,1 11,1 11,1 11,1 11,1 11,1 11,1 0 0 154,9 0 61,7 93,2 2,48 0 152,4 2,48 61,7 90,8 4,96 0 149,9 4,96 61,7 88,2 9,92 0 145 9,92 67,7 83,3 500 500 500 500 500 500 500 500 250 250 250 250 250 250 250 250 Результати: Всі вакцинні композиції, які містили антиген (композиції B-I, описані в таблиці 11), індукували у тестованих тварин антитільну відповідь, яка була значно сильнішою, ніж відповідь, яка індукується контролем без антигену (композиція I, описана в таблиці 11). Композиції, які містили сапонін, індукували відносно сильнішу антитільну відповідь в порівнянні з композиціями, які не містили сапоніну. У таблиці 12 підсумовані дані щодо титрів антитіл і 20 UA 107940 C2 перераховані кількості антигену, сапоніну і гідроксиду алюмінію для кожної композиції. Конкретно, дані щодо титрів антитіл виявляють, що присутність у вакцинних композиціях сапоніну в кількостях від близько 0,7 міліграм/дозу до близько 2,7 міліграм/дозу підсилює антитільну відповідь щодо вакцинних композицій, які не містять сапоніну. 5 Таблиця 12 Група тварин Вакциннакомпозиція Антиген Сапонін Algel (мкг/доза) (мг/доза) G1 10 0 0 C 10 0 0,37 D 10 0,7 0 E 10 0,7 0,37 G6 F 10 1,3 0 G7 G 10 1,3 0,37 G8 H 10 2,7 0 G9 I 10 2,7 0,37 G10 30 B G5 25 0 G4 20 0 G3 15 0 G2 10 A Не вакциновані Дані про середній титр антитіл Статистика D21 D44 Середнє 0,75 0,67 Ст. відхил. 0,26 0,26 Середнє 1,45 3,17 Ст. відхил. 0,50 0,48 Середнє 1,40 2,92 Ст. відхил. 0,18 0,31 Середнє 1,60 3,12 Ст. відхил. 0,31 0,42 Середнє 1,87 3,20 Ст. відхил. 0,69 0,45 Середнє 1,40 3,41 Ст. відхил. 0,37 0,27 Середнє 1,80 3,37 Ст. відхил. 0,22 0,43 Середнє 1,72 3,47 Ст. відхил. 0,66 0,30 Середнє 1,47 2,97 Ст. відхил. 0,18 0,57 Середнє 0,67 0,67 Ст. відхил. 0,17 0,09 Приклад 7 Визначення захисної дози 50% (PD50) на основі трьох експериментальних FMD-вакцин для свиней Короткий опис. Метою дослідження було тестування ефективності у відношенні до вірулентного стимулу FMD у свиней на основі 3 експериментальних вакцинних композицій FMD запропонованих даним винаходом. Чотири вакцини (А, В, C, і D) отримували відповідно без Антигену (A), і з дозами інактивованого очищеного антигену FMD 01, які варіюються, Manisa (вакцини В, C і D) з включеним до складу ад’ювантом відповідно до даного винаходу. Вакцини були представлені у вигляді 30 мл флаконів, заповнених до 25 мл, з дозами по 2 мл. Стимулюючим штамом був FMD 01 Manisa, 449402 4D:911, 20-07-1994 (який був початково виділений у вигляді 01 Manisa Turkey 1/78), і титр у вторинних клітинах нирки свині склав 7,67 log10 TCID50/мл. Розчинником для стимулюючого штаму було середовище Hanks MEM, яке містить 2% фетальну бичачу сироватку (FBS) і стандартні антибіотики. Процедура. У даному дослідженні використовували свиней без FMDV і не вакцинованих раніше проти FMD. Кожну з 47 свиней у віці 10 тижнів (плюс або мінус 1 тиждень) піддавали акліматизації протягом, щонайменше, 24 годин перед експериментальними процедурами. Свиней розміщували по 2-3 тварини на приміщення і годували стандартним гранульованим кормом і поїли водою без обмежень. У 1 день (D1) свиней (незалежно від статі) розділяли на 15 груп по три тварини і ще одну групу з двох тварин. Кожну групу поміщали в одне конкретне приміщення, і в кожному приміщенні тварини були індивідуально розділені за допомогою дерев'яних щитів (1,5 м) для захисту від зіткнень до завершення дослідження. У момент часу D0, тварин вакцинували внутрішньом'язово за вухом з лівого боку індивідуальним шприцом, відповідно до таблиць 13 і 14. Перед вакцинацією флакони з вакциною м'яко перевертали близько 10 разів для гарантії отримання гомогенної суспензії. 21 UA 107940 C2 Таблиця 13 Вакцинна композиція Вакцина (Кінцева емульсія) Ag (мкг/доза) Сапонін (міліграм/доза) Algel (% кінцевою) Неповна емульсія (мл) Водна фаза 2 166 мл FMD O-Manisa партія# OMAd-04-613 (мл) Чистий Сапонін 08-0314-P (мл) Гель оксиду алюмінію 3% (мл) Середовище 102 Всього Загальний об'єм(мл) # всього (доз) A B C D 0 0 0 333 0,4 0 0,42 333 2 0 0,42 333 10 0,7 0,42 333 0 0,66 3,29 16,46 0 2,482,48 2,48 0 166 61,4 102,5 61,4 99,8 61,4 86,7 500 250 500 250 500 250 500 250 Таблиця 14 Сумарні дані вакцинації Група B1 B2 B3 B4 B5 C1 C2 C3 C4 C5 D1 D2 D3 D4 D5 A (контроль) 5 10 15 Вакцина B B B B B C C C C C D D D D D A Доза Доза 1/2 дози 1/4 дози 1/8 дози 1/16 дози Доза 1/2 дози 1/4 дози 1/8 дози 1/16 дози Доза 1/2 дози 1/4 дози 1/8 дози 1/16 дози 1 Об'єм ін'єктованої вакцини (мл) 2,0 1 0,5 0,25 0,13 2,0 1 0,5 0,25 0,13 2,0 1 0,5 0,25 0,13 2 # Свиней 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 Перевірочне зараження. У момент часу D28, вірус FMD типу О розводили з отриманням 100000 TCID50 на 1 мл (концентрований вірус розводили в 2,67 log10 або в 468 разів). Того ж дня всіх тварин анестезували шляхом введення стреснілу (STRESSNIL) (1 мл/20 кг) і кетаміну (2 мл/20 кг) внутрішньом'язовим введенням і заражали 10000 TCID50 вірусу в об'ємі до 0,1 мл внутрішньошкірним введенням в потовщення п'яти зовнішнього копитця лівої задньої ноги. Загальний стан тварин контролювали щодня з моменту D0 до D28. Відзначали будь-які клінічні спостереження і обробки. Після перевірочного зараження за тваринами спостерігали щодня протягом 7 днів (D29-D35). Спостереження здійснювали в такому ж порядку, починаючи з приміщень з тваринами, вакцинованими найбільшими дозами, і далі спостерігаючи за тваринами, вакцинованими найнижчими дозами, і закінчуючи контролями (група A). Загальний стан контролювали щодня, звертаючи особливу увагу на ознаки FMD на рилі і ногах. Відбір крові проводили у кожної тварини перед вакцинацією (у момент D1 або D0), D14, і D28 перед перевірочним зараженням і в кінці дослідження. Зразки інактивували нагріванням (56 °C протягом 30 хвилин) і визначали титр антитіл до FMDV типу О у всіх сироватках за допомогою тесту VN (MERIAL R&D, Lelystad). У момент D36 (кінець періоду спостереження), тварин убивали (4-6 мл на 50 кг IV T61) і 22 UA 107940 C2 5 ретельно перевіряли на предмет ознак FMDV. Будь-які вогнища пошкоджень, які спостерігались в групах, вакцинованих повною дозою вакцини (групи B1, C1 або D1), збирали і заморожували при -70 °C для подальшого типування вірусу. Присутність вогнищ пошкоджень на рилі, в роті і/або ногах (за винятком основного копитця інокульованої ноги) розглядали як прояв FMD. Тест вважали достовірним, оскільки він задовольняв критеріям, згідно яким дві контрольні свині повинні демонструвати клінічні ознаки FMD. PD50 кожної вакцини розраховували за допомогою методу Спірмен-Карбер (Spearman Karber). Результати. Ефективність залежно від корисного навантаження представлена на Фіг. 9, і дані відповідних досліджень підсумовані в числовому вигляді в таблицях 15 і 16 нижче. 10 Таблиця 15 # захищених свиней на тестовану вакцину Об'єм (мл) 2,000 1,000 0,500 0,250 0,125 B 3/3 2/3 1/3 1/3 0/3 C 2/2 3/3 1/3 1/3 0/3 D 3/3 3/3 3/3 2/3 1/3 Таблиця 16 Розрахунок ефективності вакцини за допомогою логістичної регресії Вакцина B C D Корисне навантаження (мкг) 0,4 2 10 PD50 3,594 4,5821 11,7 IC951,6046 1,7021 9,533 IC95+ 2,896 2,6979 51,55 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 15 20 25 30 35 40 1. Вакцинна композиція, яка містить емульсію олія-у-воді (О/В), що ін'єктується, яка включає (i) водний розчин, який включає щонайменше один імуноген, вибраний з інактивованого 2 цирковірусу свиней (PCV2), вірусу ящура (FMDV) і бактерій; (ii) водний розчин, що містить сапонін в кількості від близько 0,7 мг/дозу до близько 1,3 мг/дозу; (iii) водний розчин, який включає гідроксид алюмінію в кількості від близько 0,065 % мас./об. до близько 0,42 % мас./об. (iv) мінеральну олію; (v) неіонну ліпофільну поверхнево-активну речовину; (vi) неіонну гідрофільну поверхнево-активну речовину, яка має високе значення гідрофільноліпофільного балансу (ГЛБ) від 13 до 40, вибране з етоксилованих моноефірів жирної кислоти і сорбітану, етоксиловані жирні кислоти і їх комбінації; і (vii) неіонну гідрофільну поверхнево-активну речовину, яка має низьке значення гідрофільноліпофільного балансу (ГЛБ) від 9 до 13, вибрана з етоксилованих моноефірів жирної кислоти і сорбітану, діефіри етоксиловані жирної кислоти і сорбітану, моноефіри етоксиловані жирної кислоти і сорбітану, етоксиловані жирні кислоти, етоксилована касторова олія і їх комбінації; і де кінцеве ГЛБ емульсії складає від близько 9 до близько 12. 2. Композиція по п. 1, яка відрізняється тим, що концентрація гідроксиду алюмінію складає від близько 0,37 % (мас./об.) до близько 0,42 % (мас./об.); і де композиція залишається (О/В) емульсією впродовж щонайменше близько 24 місяців. 3. Композиція за п. 1 або 2, яка відрізняється тим, що неіонна гідрофільна поверхнево-активна речовина з високим ГЛБ присутня в концентрації 0,1-1,5 %, вираженій у вигляді відношення маси до об'єму емульсії (мас./об.), і де процентний вміст поверхнево-активної речовини складає від близько 4 % до близько 8 % мас./об'єм. 4. Композиція за п. 1 або 2, яка відрізняється тим, що неіонна гідрофільна поверхнево-активна речовина з низьким ГЛБ присутня в концентрації 1-8 %, вираженій у вигляді відношення маси до об'єму емульсії (мас./об.). 23 UA 107940 C2 5 10 15 20 25 5. Композиція за п. 1 або 2, яка відрізняється тим, що неіонна ліпофільна поверхнево-активна речовина присутня в концентрації 0,1-2,5%, вираженій у вигляді відношення маси до об'єму емульсії (мас./об.). 6. Композиція за п. 1 або 2, яка відрізняється тим, що мінеральна олія присутня у концентрації 20 %-40 % (об./об.), і де емульсія має температуру обернення фаз (ТОФ) від близько 36 °C до близько 46 °C. 7. Композиція за п. 1 або 2, яка відрізняється тим, що неіонну гідрофільну поверхнево-активну речовину з низьким ГЛБ вибирають із групи, яка складається з етоксилованих триефірів сорбіту і жирних кислот, і де вказаний етоксилований ефір жирної кислоти вибирають з групи, яка складається з олеату, пальмітату, стеарату, ізостеарату, лауринату та їх комбінації. 8. Композиція за п. 1 або 2, яка відрізняється тим, що неіонну ліпофільну поверхнево-активну речовину вибирають з групи, яка складається з ефірів сорбіту і жирної кислоти, і де ефір жирної кислоти вибирають з групи, яка складається з олеату, пальмітату, стеарату, ізостеарату, лауринату та їх комбінації. 9. Композиція за п. 1 або 2, яка відрізняється тим, що неіонну гідрофільну поверхнево-активну речовину з високим ГЛБ вибирають з групи, яка складається з етоксилованих моноефірів сорбіту і жирної кислоти, і де етоксильований моноефір сорбіту вибирають з групи, яка складається з етоксилованого сорбітанмонолауринату, етоксилованого сорбітанмонопальмітату, етоксилованого сорбітанмоностеарату, етоксилованого сорбітанмоноолеату та їх комбінації. 10. Композиція за п. 1 або 2, яка відрізняється тим, що мінеральну олію вибирають з групи, яка складається з парафінової олії, сквалану, пристану, поліізобутенової олії, гідрогенізованої поліізобутенової олії, полідеценової олії, поліізопренової олії, поліізопропенової олії та їх комбінації. 11. Композиція за п. 1 або 2, яка відрізняється тим, що імуногеном є інактивований вірус ящура (FMD), інактивований свинячий цирковірус типу 2 (PCV-2) або інактивована бактерія Mycoplasma hyopneumoniae. 12. Застосування композиції за п. 1 або 2 для отримання лікувального засобу для індукції імунологічної відповіді у тварини. 24 UA 107940 C2 25 UA 107940 C2 26 UA 107940 C2 27 UA 107940 C2 28