Рекомбінантна вакцина на основі параміксовірусів птахів і спосіб її приготування та застосування
Номер патенту: 110328
Опубліковано: 25.12.2015
Автори: Прітчард Джойс, Мундт Еґберт, Мебатсьон Тезом, Бюбло Мішель
Формула / Реферат
1. Вакцинна композиція, яка включає (і) рекомбінантний вірусний вектор APMV і (іі) фармацевтично або ветеринарно прийнятний носій, де вірусний вектор APMV є APMV-8 і де вірусний вектор APMV, який включає полінуклеотид, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 1, або полінуклеотид, комплементарний до полінуклеотиду, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 1, де вірусний вектор APMV додатково включає виділений полінуклеотид, який кодує антиген патогену, де патоген є патогеном птахів, кішок, собак, коней, корів, овець, кіз і свиней, а також полінуклеотид вставлений в неістотну ділянку геному APMV.
2. Композиція або вакцина за п. 1, яка відрізняється тим, що в ній неістотна ділянка вибирається з ділянок, перелік яких включає нетрансльовану ділянку, розташовану вище відкритої рамки зчитування NP, міжгенні ділянки між двома відкритими рамками зчитування геному APMV, і нетрансльовану ділянку, розташовану нижче відкритої рамки зчитування L.
3. Спосіб отримання рекомбінантного вірусного вектора APMV, який передбачає введення в геном APMV ізольованого полінуклеотиду в неістотну ділянку геному APMV, і де вірусний вектор APMV є APMV-8, і де вірусний вектор APMV, який включає полінуклеотид, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 1, або полінуклеотид, комплементарний до полінуклеотиду, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 1.
4. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що в ньому неістотна ділянка вибирається з ділянок, перелік яких включає нетрансльовану ділянку, розташовану вище відкритої рамки зчитування NP, міжгенні ділянки між двома відкритими рамками зчитування геному APMV, і нетрансльовану ділянку, розташовану нижче відкритої рамки зчитування L.
5. Спосіб за одним з пп. 3-4, який відрізняється тим, що передбачає стадії:
a) отримання експресійних плазмід, які експресують гени NP, Р і L;
b) отримання транскрипційної плазміди, яка включає ізольований полінуклеотид в неістотній ділянці повнорозмірного геному APMV;
c) трансфекцію експресійних плазмід і транскрипційної плазміди в клітину-хазяїна;
d) виділення/отримання інфекційного вірусу APMV з клітини-хазяїна.
6. Спосіб за будь-яким одним з пп. 3-5, який відрізняється тим, що передбачає стадії:
а) отримання експресійних плазмід, які експресують гени NP, Р і L;
b) отримання транскрипційної плазміди, яка включає ізольований полінуклеотид в неістотній ділянці повнорозмірного геному APMV;
с) отримання експресійної плазміди, яка експресує полімеразу Т7;
d) трансфекцію експресійних плазмід і транскрипційної плазміди в клітину-хазяїна;
e) відновлення/отримання інфекційного вірусу APMV з клітини-хазяїна.
7. Спосіб індукції імунологічної відповіді у тварини на антиген, який передбачає введення тварині композиції або вакцини, яка включає рекомбінантний вірусний вектор APMV, де рекомбінантний вірусний вектор APMV містить і експресує антиген патогену вказаної тварини, і де вірусний вектор APMV є APMV-8, і де вірусний вектор APMV, який включає полінуклеотид, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 1, або полінуклеотид, комплементарний до полінуклеотиду, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 1, де вірусний вектор APMV додатково включає виділений полінуклеотид, який кодує антиген патогену, де патоген є патогеном птахів, кішок, собак, коней, корів, овець, кіз і свиней, а також полінуклеотид вставлений в неістотну ділянку геному APMV.
8. Спосіб за п. 7, який відрізняється тим, що в ньому імунологічна відповідь у тварини на антиген індукується в режимі ″прайм-буст″.
9. Спосіб за п. 7, який відрізняється тим, що в ньому дана тварина є птахом, конем, собакою, кішкою, свинею, великою рогатою худобою, вівцею або людиною.
10. Рекомбінантний вірусний вектор APMV, що призначений для використання у вакцинній композиції за п. 1, який включає полінуклеотид, вибраний з групи, яка включає:
a) полінуклеотид, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 1, або полінуклеотид, комплементарний до полінуклеотиду, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 1;
b) полінуклеотид, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який кодує поліпептид, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 3, полінуклеотид, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 2, або полінуклеотид, комплементарний до полінуклеотиду, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 2;
с) полінуклеотид, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який кодує поліпептид, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 5, полінуклеотид, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 4, або полінуклеотид, комплементарний до полінуклеотиду, що має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 4;
d) полінуклеотид, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який кодує поліпептид, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 7, полінуклеотид, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NО: 6, або полінуклеотид, комплементарний до полінуклеотиду, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 6;
e) полінуклеотид, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який кодує поліпептид, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 9, полінуклеотид, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 8, або полінуклеотид, комплементарний до полінуклеотиду, що має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 8;
f) полінуклеотид, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який кодує поліпептид, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 11, полінуклеотид, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 10, або полінуклеотид, комплементарний до полінуклеотиду, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 10; і
полінуклеотид, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який кодує поліпептид, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 13, полінуклеотид, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який кодує поліпептид, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 14, полінуклеотид, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 12, або полінуклеотид, комплементарний до полінуклеотиду, який має щонайменше 90 % ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID
NО: 12;
і де вірус APMV є APMV-8, і де в вірус APMV додатково включено ізольований полінуклеотид, вставлений в неістотну ділянку геному APMV.
11. Ізольований полінуклеотид, що призначений для використання у рекомбінантному вірусному векторі APMV за п. 10, вибраний з групи, яка включає:
a) полінуклеотид, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 1, або полінуклеотид, комплементарний до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 1;
b) полінуклеотид, який кодує поліпептид, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 3, полінуклеотид, який має, послідовність, вказану в SEQ ID NO: 2, або полінуклеотид, комплементарний до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 2;
c) полінуклеотид, який кодує поліпептид, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 5, полінуклеотид, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 4, або полінуклеотид, комплементарний до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 4;
d) полінуклеотид, який кодує поліпептид, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 7, полінуклеотид, який має послідовності до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 6, або полінуклеотид, комплементарний до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 6;
e) полінуклеотид, який кодує поліпептид, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 9, полінуклеотид, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 8, або полінуклеотид, комплементарний до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 8;
f) полінуклеотид, який кодує поліпептид, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 11, полінуклеотид, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 10, або полінуклеотид, комплементарний до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 10; і
g) полінуклеотид, який кодує поліпептид, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 13, полінуклеотид, який кодує поліпептид, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 14, полінуклеотид, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 12, або полінуклеотид, комплементарний до полінуклеотиду, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO: 12.
Текст
Реферат: Винахід належить до вакцинної композиції, яка включає (і) рекомбінантний вірусний вектор APMV-8, який додатково включає виділений полінуклеотид, який кодує антиген патогену, де патоген є патогеном птахів, кішок, собак, коней, корів, овець, кіз і свиней, і де полінуклеотид вставлений в неістотну ділянку геному APMV-8 і (іі) фармацевтично або ветеринарно прийнятний носій; способу одержання рекомбінантного вірусного вектора; способу індукування імунної відповіді у тварин за рахунок введення зазначеної вакцинної композиції. UA 110328 C2 UA 110328 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки Даний винахід стосується параміксовірусів птахів (avian paramyxoviruses, APMV) і послідовностей APMV. Даний винахід стосується вірусних векторів для вбудовування і експресії чужорідних генів для застосування як безпечних носіїв при імунізації для захисту від багатьох патогенів. Він стосується векторної вакцини в системі «зворотної генетики» для виробництва живих ослаблених вакцин. Він також стосується полінуклеотидів, які можуть застосовуватися для продукування субодиниць в експресійному векторі in vitro або послідовностей для інтеграції у вірусний або плазмідний тип експресійного вектора в системі in vivo. Даний винахід стосується немодифікованого і модифікованого вірусу APMV, способів його отримання і застосування і певних послідовностей ДНК і білків. Конкретніше, даний винахід стосується вірусу APMV, в якому початковий природний геном вірусу був змінений («мутанти APMV» або «рекомбінантний APMV») і способів отримання і застосування таких мутантів APMV або рекомбінантного APMV. Рівень техніки Вакцини на основі вірусних векторів є однією з галузей розробки вакцин, які найшвидше розвиваються. Багато вакцин, які знаходяться на стадії клінічних розробок, для основних глобальних інфекційних захворювань, ВІЛ, туберкульозу і малярії, створено на основі вірусних векторів. Вакцини на основі вірусних векторів для тварин вже представлені на ринку, наприклад, вакцини на основі авіпоксвірусних векторів для домашніх тварин і свійських птахів, векторні вакцини на основі герпесвірусів птахів для свійських птахів і вакцини на основі вірусу коров'ячої віспи для диких тварин. Інші векторні вакцини для домашніх тварин знаходяться на стадії розробки. Перевага вакцин на основі вірусних векторів полягає в тому, що їх можна безпечно застосовувати, оскільки в них використовується векторна основа, яка є сильно ослабленою і не може сама як така викликати захворювання тварини. Недоліком застосованих в даний час вірусних векторів є існування отриманого від матері імунітету або антитіл, що з'явилися в результаті перенесеної інфекції. Ці антитіла нейтралізуватимуть векторний вірус і, отже, зменшуватимуть успішність застосування векторної вакцини. Одним з головних стимулів для розробки векторних вакцин була поява високопатогенного вірусу грипу H5N1, який з'явився спочатку в Азії, а пізніше в Європі та в Африці. Було розроблено декілька векторних вакцинкандидатів, включаючи векторні вакцини на основі поксвірусу птахів (Taylor et al, 1988), вірусу коров'ячої віспи (Chambers et al., 1988), вірусу саркоми Раусу (Hunt et al, 1988), аденовірусів (Tang et al., 2002, Gao et al, 2006), вірусу венесуельського енцефаліту коней (Schultz-Cherry et al, 2000), вірусу хвороби Ньюкасла (US6,719,979, Veits et al., 2006, Swayne et al, 2002, Park et al, 2006), герпесвірусу інфекційного ларинготрахеїту (Veits et al. 2003), герпесвірусу індичок (Darteil et al., 1995) і аденовірусу (Hoelscher et al, 2008, Toro et al, 2007). Ефективність цих векторних вакцин була протестована на незаражених птахах, але до теперішнього часу не було опубліковано повідомлень про ефективність цих векторних вакцин у птахів з уже наявним імунітетом до вірусного вектора і/або до білка, який кодується вставкою. Родина вірусів Paramyxoviridae включає як патогени людини (віруси кору, свинки, парагрипу, респіраторно-синцитіальний вірус), так і тварин (вірус хвороби Ньюкасла і вірус чуми рогатої худоби), які мають значний вплив на здоров'я населення і на глобальну економіку (Lamb et al., 2007). Встановлено, що представники цієї родини мають однокомпонентний негативно направлений (з негативною полярністю) одноланцюговий РНК-геном. Родина Paramyxoviridae складається з двох підродин, а саме Paramyxovirinae і Pneumovirinae. Згідно недавньої ревізії класифікації підродина Paramyxovirinae включає п'ять родів, а саме Morbillivirus, Henipavirus, Rubulavirus, Respirovirus і Avulavirus, тоді як Pneumovirinae включає Pneumovirus і Metapneumovirus (Mayo, 2002). Параміксовіруси птахів (APMV) відносяться до роду Avulavirus і включають дев'ять відмінних за антигенами серотипів, які були визначені за допомогою тестів інгібування гемаглютинації (HI) (Alexander, 1988). Серед цих дев'яти серотипів ізоляти, які належать до підтипу APMV-1, можуть викликати спустошливе захворювання в промисловому птахівництві і класифікуються як велогенний (з високою вірулентністю) вірус хвороби Ньюкасла (Newcastle disease virus, NDV). Помірніші форми NDV позначаються як мезогенні (середньої вірулентності) і лентогенні (з пониженою вірулентністю) ізоляти, де остання форма у свійських птахів є зазвичай безсимптомною. Ізоляти, які відносяться до APMV-2, 3, 6 і 7, також пов'язані із захворюванням свійських птахів. Зокрема, інфекції ізолятами APMV-2 і 3 можуть викликати помірне респіраторне захворювання і проблеми з якістю і кількістю яєць (Bankowski et al., 1981; Redmann et al., 1991; Tumova et al., 1979; Zhang et al., 2007). Відомо, що ізоляти APMV-6 і 7 інфікують індичок, качок і перелітних птахів і можуть викликати респіраторне захворювання, яке може ускладнюватися вторинною інфекцією (Saif et al., 1997; Shortridge et al., 1980). З іншого боку, ізоляти APMV-4, 5, 8 і 9 були виділені з качок, водоплавних птахів та інших диких птахів, 1 UA 110328 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 але ці птахи рідко демонструють клінічні ознаки, характерні для вірусної інфекції (Alexander et al., 1983; Capua et al., 2004; Gough et al., 1984; Maldonado et al., 1995; Shortridge et al., 1980). Були отримані повні послідовності геномів декількох ізолятів NDV, які використовували для виявлення різних детермінант вірулентності NDV (de Leeuw et al., 1999; Krishnamurthy et al., 1998; Zou et al., 2005). У останні два роки було опубліковано декілька послідовностей APMV, які відрізняються від APMV1, такі як GenBank accession number EU338414 для APMV-2, EU403085 для APMV-3, FJ177514 для APMV-4, EU622637 для APMV-6, FJ231524 для APMV-7, FJ215863, FJ215864 і FJ619036 для APMV-8 EU910942 для APMV-9. Окрім інформації про послідовності, про чинники вірулентності відомо не дуже багато. Ізоляти APMV 2-9 головним чином були виділені з перелітних птахів. Цікаво відзначити, що є всього декілька повідомлень про експериментальне зараження курчат такими ізолятами (Saif et al., 1997). Оскільки ці APMV широко циркулюють серед диких птахів і в деяких випадках були виділені з промислових популяцій свійських птахів (Zhang et al., 2007) що іноді викликає захворювання в цих популяціях (Saif et al., 1997; Shihmanter et al., 1998; Shihmanter et al., 1998) необхідно знати їх вірулентність у відношенні до свійських птахів. Більшість з ізолятів APMV викликає відносно слабке захворювання, яке може посилюватися у присутності супутніх бактеріальних або вірусних інфекцій, що може призводити до економічних втрат. Зокрема, APMV-2 був вперше ізольований як вторинний патоген у 1956 році у Південній Каліфорнії з курчат, уражених гострим ларинготрахеїтом (Bankowski et al., 1960). Згодом були виділені численні штами цього серотипу з декількох видів птахів, що означає, що APMV-2 є широко поширеним у всьому світі (Andral et al., 1984; Bradshaw et al., 1979; Fleury et al., 1979; Goodman et al., 1988; Lang et al., 1975; Lipkind et al., 1982; Lipkind et al., 1979; Zhang et al., 2006). Bankowski et. al. повідомили, що природне або штучне експонування індичок, які несуться, з APMV-2 викликає різке зниження відсотку викльовування пташенят і виходу птахів (Bankowski et al., 1981). Вперше APMV-4, було ізольовано, наприклад з убитих мисливцями диких качок на шляхах перельоту на Міссісіпі і в Сполучених Штатах (Webster et al., 1976) і з курей, качок і гусей в Гонконзі в ході програм моніторингу грипу у свійських птахів (Alexander et al., 1979). Не враховуючи ізоляту з кільчастого чирка, ураженого геморагічним ентеритом (Gough et al., 1984) всі інші ізоляти зі свійських птахів були за зовнішніми ознаками непатогенними і, як було встановлено, мають широке поширення серед водоплавних птахів у всьому світі (Stanislawek et al., 2002; Tumova et al., 1989; Yamane et al., 1982). Gough et al. повідомили, що після внутрішньоназальної інокуляції однотижневим качатам і двотижневим курчатам ізоляту з кільчастого чирка не спостерігалося клінічних проявів і були отримані дуже низькі титри HI (1:8 або нижче) (Gough et al., 1984). Подібно до цього, перші ізоляти APMV-6 були також отримані зі свійських птахів в Гонконзі в результаті проведення програми моніторингу грипу і повідомлялося, що у курей вони є непатогенними на підставі низьких титрів HI з експериментально заражених курей (Shortridge et al., 1980). Проте були повідомлення про те, що інфекція APMV-6 у індичок приводить до помірного респіраторного захворювання і проблем з виробництвом яєць (Alexander, 2003). APMV-8 (Goose/Delaware/1053/76) був вперше ізольований в США з убитої мисливцями Канадської казарки (Branta canadensis) (Rosenberger et al., 1974). Серологічні дослідження (з 1990 до 1992 року) пернатої дичини у південній Іспанії показали значне переважання антитіл проти APMV-8 в до 43% протестованих сивороток (Maldonado et al., 1995). Інше серологічне дослідження, спрямоване на з'ясування статусу живих здорових крякв в Новій Зеландії відносно інфікування APMV, виявило присутність антитіл проти APMV-8 в 56% протестованих сивороток (Stanislawek et al., 2002). Warke et al (2008) повідомили, що від 16% до 31% з досліджених сивороток курей можуть містити антитіла проти APMV-8. Але унаслідок наявності високих титрів проти APMV1 існує вірогідність псевдопозитивного тесту HI, оскільки сироватки не реагують високоспецифічно при аналізі HI. За винятком декількох ізолятів з водоплавних птахів, ізоляти APMV-8 були отримані з популяцій при їх дослідженні на вірус пташиного грипу (Stallknecht et al., 1991), і зберігається недолік інформації про широке поширення і патогенність цього вірусу. Розвиток систем «зворотної генетики» (умов зворотної транскрипції) для РНК-геному з негативною полярністю NDV зробив можливим вбудовування послідовностей чужорідних генів в такий геном, таким чином, забезпечуючи можливість створення рекомбінантних векторів NDV для вакцинації і генної терапії (Krishnamurthy et al., 2000; Peeters et al., 1999; RoemerOberdoerfer et al., 1999). Повідомлялося про рекомбінантні вектори NDV, які експресують чужорідні вірусні білки, такі як білок НА підтипу Н1 вірусу грипу А (Nakaya et al., 2001) VP2 білок вірусу інфекційного бурситу (IBDV) (Huang et al., 2004), гемаглютинін підтипу Н5 (Veits et al., 2006; Ge et al., 2007) і підтипу Н7 (Park et al., 2006) вірусу грипу птахів. Проте ефективність більшості з таких вакцин була продемонстрована тільки на вільних від специфічних патогенів 2 UA 110328 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (SPF) птахах. NDV викликає спустошливе захворювання у свійських птахів, що приводить до серйозних економічних втрат у промисловому птахівництві. Таким чином, кури в промисловому птахівництві зазвичай вакцинуються проти NDV у більшості країн світу. Внаслідок цього, курчата від імунізованих батьків в промислових популяціях курей мають високий рівень отриманих від матері антитіл. Звичайні живі вакцини NDV забезпечують захист навіть у присутності цих антитіл. Проте рекомбінантні вакцини (зі вставками чужорідних генів) NDV зазвичай є більш ослабленими у порівнянні з живими вакцинами NDV, і їх ефективність може бути ослабленою у присутності материнських антитіл проти NDV. Таким чином, існує необхідність в платформі векторної вакцини, яка може забезпечити основу для безпечних вакцин для експресії гетерологічних антигенів. В ідеалі рекомбінантна вакцина може індукувати сильну гуморальну імунну відповідь, може застосовуватися для масового введення і є недорогою. Розкриття винаходу Даний винахід стосується вакцини або композиції, яка включає (i) рекомбінантний APMV і (ii) фармацевтично або ветеринарно прийнятний носій. Даний винахід включає способи модифікації геному APMV для отримання рекомбінантного вірусу APMV або вірусного вектора на основі APMV; модифікований APMV, отриманий такими способами; послідовності ДНК і білків; і способи інфікування клітин і тварин-хазяїнів таким рекомбінантним APMV для індукції ампліфікації екзогенної ДНК і білків, які кодуються екзогенною ДНК, включаючи антигенні білки, вказаними клітинами і тваринами-хазяїнами. Один аспект даного винаходу стосується вірусу APMV, послідовностей ДНК і білків, які застосовуються при отриманні модифікованого або рекомбінантного вірусу. Одне втілення даного винаходу стосується геномної і білкової послідовності APMV-2, 4, 6 або 8. Інший аспект даного винаходу стосується модифікованого рекомбінантного вірусу APMV, де вказані віруси мають підвищену безпеку, сильну гуморальну імунну відповідь, і спосіб отримання таких рекомбінантних вірусів. Інший аспект даного винаходу стосується рекомбінантної APMV вірусної вакцини або композиції, яка має підвищений рівень безпеки у порівнянні з відомими APMV або іншими рекомбінантними вакцинами. У іншому аспекті даний винахід пропонує немодифікований і модифікований APMV вірусний вектор для експресії продукту гена в хазяїна. Інший аспект даного винаходу направлений на рекомбінантний вірус APMV, модифікований шляхом вбудовування в нього ДНК з будь-якого джерела в міжгенну ділянку або в несмислову ділянку геному APMV. Синтетично модифіковані рекомбінанти APMV вірусу, які несуть гетерологічні гени, кодують і експресують антиген, застосовуються відповідно до даного винаходу для створення нових композицій або вакцин. Інший аспект даного винаходу стосується APMV вірусного вектора, який утворює зворотну генетичну систему (систему зворотної транскрипції), де вказаний вектор може бути застосований як каркас для рекомбінантних вакцин або композицій в різних тваринах-хазяїнах. У одному аспекті даний винахід стосується фармацевтичної композиції або вакцини для індукції імунологічної відповіді в тварині-хазяїні, інокульованій даною композицією або вакциною, композиції або вакцини, яка включає фармацевтично прийнятний носій і модифікований APMV рекомбінантний вірус або вірусний вектор. У ще одному аспекті даного винаходу рекомбінантний вірус або вірусний вектор APMV включає, в межах несмислової ділянки вірусного геному, гетерологічну ДНК, яка кодує антигенний білок, джерелом походження якого є патоген, де композиція або вакцина при введенні хазяїну є здатною індукувати імунологічну відповідь, специфічну щодо білка, який кодується даним патогеном. Інший аспект даного винаходу стосується способу індукції імунологічної відповіді у тварини на антиген, де спосіб передбачає інокуляцію тварини вакциною або фармацевтичною композицією, яка містить модифікований рекомбінантний вірус або вірусний вектор, який включає і експресує антигенну детермінанту патогену для вказаної тварини, APMV. Ще один аспект даного винаходу стосується способу індукції імунологічної відповіді у тварини на антиген в режимі «прайм-буст». Інший аспект даного винаходу стосується способу експресії продукту гена в клітинній культурі in vitro шляхом введення в клітину модифікованого рекомбінантного вірусу APMV, де ген може бути геном антигенного білка, джерелом походження якого є патоген. Короткий опис фігур Приведене далі «Здійснення винаходу», виконане у вигляді прикладів, яке не направлені на обмеження даного винаходу описаними конкретними втіленнями, і може бути зрозумілим із залученням супроводжуючих фігур, серед яких: Фігура 1 є таблицею, яка показує ізоляцію вірусу з декількох органів курей після 3 UA 110328 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 експериментального інфікування APMV-2, 4, 6 зародків курячих яєць. Фігура 2 є таблицею, яка показує результати гістологічного дослідження деяких органів курей після експериментального інфікування APMV-2, 4, 6. Фігура 3 показує титри HI антитіл у SPF курей (вільних від специфічних патогенів), експериментально інокульованих APMV-2, 4 або 6. Зразки сироватки крові курей, зібрані в дні 2, 4, 7, 14 і 28 після інфікування, піддавали тесту HI для аналізу присутності HI антитіл. Фігура 4 показує титри HI антитіл у SPF курей і качок, експериментально інфікованих APMV6 8. Кури і качки були інфіковані ороназально в дозі 10 EID50 APMV-8. Зразки сироватки крові були узяті в дні 2, 4, 7, 14 і 28 після інфікування і проаналізовані в тесті HI з антигеном APMV-8. Титри HI сивороток крові (у логарифмічній шкалі log2) показані на лівій осі. Фігура 5 показує розвиток титрів антитіл HI у SPF курей в ході схеми вакцинації «праймбуст» з APMV-8. Одноденні курчата SPF були інфіковані в день 1 (первинно) і на 14 день (буст) 6 в дозі 10 EID50 APMV-8. Зразки сироватки крові були узяті в дні 7 і 14 після першого інфікування і в дні 7 і 14 після вторинного інфікування. Сироватку досліджували в тесті HI. Титри HI сивороток (у логарифмічній шкалі log2) показані на лівій осі. Фігура 6 показує дослідження продуктів ЗТ-ПЛР (зворотна транскрипція з подальшою ПЛР) за допомогою електрофорезу в агарозному гелі. Тканини трахеї були узяті в день 2 після інфікування у неінфікованих качок (С1-С5) і інфікованих качок APMV-8 (I1-I5). Тканини гомогенізували і готували РНК для ЗТ-ПЛР. Паралельно ставили контроль з водою (W). Продукти реакції розділяли на 1,5% агарозному гелі. Розмір фрагмента контролювали з використанням градації маркерів в 100 п.о. (New England Biolabs). Розміри фрагментів ДНК показані справа. Фігура 7 є таблицею, яка показує виділення вірусу з курей і качок, експериментально інфікованих APMV-8. Виділення вірусу з тканин курей було проведене на зародках курячих яєць, і визначення вірусною РНК в тканинах качок проводили за допомогою ЗТ-ПЛР. Фігура 8 є таблицею, яка показує результати гістологічного дослідження деяких органів після інфікування курей і пекінських качок APMV-8. Фігура 9 показує розвиток титрів HI антитіл у SPF курей після інфікування різними дозами APMV-8. Одноденні курчата SPF були інфіковані на 1 день різними інфікуючими дозами (ID) APMV-8 або фіктивно інфіковані середовищем для перенесення вірусу (virus transport medium, VTM). Кров брали на 7 і 14 день після інфікування, і отримані зразки сивороток крові аналізували в тесті HI. Титри HI сивороток (у логарифмічній шкалі log2) показані на лівій осі. Середній геометричний титр (geometric mean titer, GMT) зразків сивороток показаний в самому нижньому рядку. Фігура 10 показує розвиток титрів антитіл HI у пекінських качок після інфікування різними дозами APMV-8. Одноденні SPF пекінські качки були інфіковані в день 1 різними інфекційними дозами (ID) APMV-8 або були фіктивно інфіковані середовищем для перенесення вірусу (VTM). Кров брали на 7 і 14 день після інфікування, і отримані зразки сивороток аналізували в тесті HI. Титри сивороток HI (у логарифмічній шкалі log2) показані на лівій осі. Середній геометричний титр (GMT) зразків сивороток показаний в самому нижньому рядку. Фігура 11 є таблицею, яка показує SEQ ID Nos відповідних послідовностей ДНК і білків. Фігура 12 показує повну послідовність геному штаму APMV-8 (APMV-8: SCWDS ID: MA-7, ізольований з крякви) і генетичну карту повнорозмірного геному APMV-8. Фігура 12 показує послідовність ДНК (SEQ ID NO:2), що кодує нуклеопротеїн (NP) APMV-8 і послідовність білка NP (SEQ ID NO:3). Фігура 13 показує послідовність ДНК (SEQ ID NO:4), що кодує фосфопротеїн (P) APMV-8 і послідовність білка P (SEQ ID NO:5). Фігура 14 показує послідовність ДНК (SEQ ID NO:6), яка кодує матрікспротеїн (М) APMV-8 і послідовність білка М (SEQ ID NO:7). Фігура 15 показує послідовність ДНК (SEQ ID NO:8), яка кодує ф'юженпротеїн (F) APMV-8 і послідовність білка F (SEQ ID NO:9). Фігура 16 показує послідовність ДНК (SEQ ID NO:10), яка кодує гемаглютинін/нейрамінідазу (HN) APMV-8 і послідовність білка HN (SEQ ID NO:11). Фігура 17 показує послідовність ДНК (SEQ ID NO:12), яка кодує полімеразу (L) APMV-8 і послідовність білка L (SEQ ID NO:13). Цей білок L(1) APMV-8 транслюється, починаючи з кодону ATG, розташованого в положеннях 8273-8275 в SEQ ID NO:1. Фігура 18 показує послідовність білка (2) APMV-8 полімерази (L) (SEQ ID NO:14). Цей білок L(2) APMV-8 транслюється, починаючи з кодону ATG, розташованого в положеннях 8297-8299 в SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:14 не містить перших 8 амінокислот SEQ ID NO:13. Фігура 19A є схемою системи зворотної генетики для вірусу APMV-8. Фігура 19B показує 4 UA 110328 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 результат реплікації вірусу APMV-8 в клітинах MDCK. Фігура 20 показує результат тесту HI у комерційно придбаних курей-бройлерів через 2 тижні після вакцинації APMV-8. Фігура 21 показує результат тесту HI у комерційно придбаних курей-бройлерів через 4 тижні після вакцинації APMV-8. Фігура 22 показує результати тесту HI після вакцинації in ovo на 18 день (дослідження 1). Фігура 23 показує результати тесту HI після вакцинації in ovo на 19 день (дослідження 2). Фігура 24 показує результати тесту HI після вакцинації in ovo на 18 день (дослідження 3). Фігура 25 показує послідовності 5’-повнорозмірного геному (5’-FLG) і 3’-повнорозмірного геному (3’-FLG), включаючи фланкуючі послідовності. Фігура 26 показує карти плазмід pcNDA-NP, pcNDA-P, pcDNA-L і pcDNA3-T7. Фігура 27 показує карти плазмід pUC18-MG-APMV-8 і pCITE4A-EGFP. Фігура 28 показує карту плазміди pUC57-FL-APMV-8. Фігура 29 показує послідовність мінігеному APMV-8. Фігура 30 показує вирівнювання послідовностей білка NP і ідентичність послідовностей на рівнях ДНК і білка. Фігура 31 показує вирівнювання послідовностей білка Р і ідентичність послідовностей на рівнях ДНК і білка. Фігура 32 показує вирівнювання послідовностей білка М і ідентичність послідовностей на рівнях ДНК і білка. Фігура 33 показує вирівнювання послідовностей білка F і ідентичність послідовностей на рівнях ДНК і білка. Фігура 34 показує вирівнювання послідовностей білка НN і ідентичність послідовностей на рівнях ДНК і білка. Фігура 35 показує вирівнювання послідовностей білка L і ідентичність послідовностей на рівнях ДНК і білка. Здійснення винаходу Слід вказати, що у даному «Здійсненні винаходу», і особливо в «Формулі винаходу», такі терміни як «включає», «включено», «включаючи» і тому подібні повинні мати значення, яке приписується їм Законом про Патенти США; наприклад, вони можуть означати «містить», «включає», «включаючи» і тому подібні; і що терміни, такі як «складаючись власне з» і «складається власне з» мають значення, що приписується їм Законом про Патенти США, наприклад вони дозволяють елементам, які не були в точності перераховані, входити в них, за винятком елементів, які відомі з попереднього рівня техніки, або які впливають на основні або нові характеристики даного винаходу. Якщо не вказано інше, технічні терміни використовуються відповідно до їх звичайного значення. Визначення звичайних термінів в молекулярній біології можна знайти в Benjamin Lewin, Genes V., опублікованій Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, опублікованій Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0632-02182-9); і Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: а Comprehensive Desk Reference, опублікованій VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). Терміни в однині включають і множину, якщо з контексту чітко не виходить інше. Подібно до цього, слово «або» включає «і», якщо контекст чітко не вказує на інше. Слово «або» позначає будь-якого одного члена з певного списку і також включає будь-яку комбінацію з членів такого списку. Слід вказати, що в даному «Здійсненні винаходу» і в доданій «Формулі винаходу» і/або в пунктах, терміни «Параміксовіруси птахів» або «APMV» використовуються як взаємозамінні та позначають і включають APMV-1, APMV-2, APMV-3, APMV-4, APMV-5, APMV-6, APMV-7, APMV8 і APMV-9. Термін «тварина» у тому значенні, у якому він використовується тут, включає всіх ссавців, птахів і риб. Тварина у тому значенні, у якому він використовується тут може бути вибраною з групи, яка складається з коней (наприклад, кінь), псових (наприклад, собаки, вовки, лисиці, койоти, шакали), котячих (наприклад, леви, тигри, домашні кішки, дикі кішки, інші крупні кішки, та інші котячі, включаючи гепарда і рись), парнокопитних (наприклад, велика рогата худоба, вівці, кози, лами, бізони), свиней (наприклад, домашня свиня), птахів (наприклад, кури, качки, гуси, індички, перепілки, фазани, папуги, дрібні птахи (в'юрки), соколи, ворони, африканські страуси, ему і казуар), приматів (наприклад, напівмавпи, лорі, мавпи, гібони, людиноподібні мавпи), людей і риб. Термін «тварина» також включає конкретну тварину на всіх стадіях розвитку, включаючи ембріональні і зародкові стадії. Терміни «поліпептид» і «білок» використовуються тут як взаємозамінні для позначення 5 UA 110328 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 полімеру із сполучених послідовно амінокислотних залишків. Терміни «нуклеїнова кислота», «нуклеотид» і «полінуклеотид» використовуються як взаємозамінні і відносяться до РНК, ДНК, кДНК (комплементарної ДНК) або кРНК (комплементарної РНК) та їхніх похідних, як і тих, які містять модифіковані каркаси. Необхідно розуміти, що даний винахід пропонує полінуклеотиди, включаючи послідовності, комплементарні до тих, що тут описані. Описані в даному винаході «полінуклеотиди» включають як прямо направлений ланцюг (від 5’ до 3’-кінця), так і направлений назад комплементарний ланцюг (від 3’ до 5’-кінця). Полінуклеотиди, відповідно до даного винаходу, можуть бути отримані різними способами (наприклад, хімічним синтезом, клонуванням генів, і так далі) і можуть приймати різні форми (наприклад, лінійні або розгалужені, одноланцюгові або дволанцюгові, або їх гібриди, праймери, зонди тощо). Термін «ДНК геному» або «геном» використовується як взаємозамінні і відноситься до передаваної у спадок генетичної інформації організму-хазяїна. ДНК геному включає ДНК ядра (також позначається як хромосомна ДНК), а також ДНК пластид (наприклад, хлоропластів) та іншої клітинної органели (наприклад, мітохондрій). Терміни ДНК геному або геном, які вживаються в даному винаході, також відносяться до РНК вірусу. РНК може бути позитивним (позитивної полярності) ланцюгом або негативним (негативної полярності) ланцюгом РНК. Термін «ДНК геному», як він вживається в даному винаході, включає ДНК геному, що містить послідовності, які є комплементарними до описаних тут послідовностей. Термін «ДНК геному» також відноситься до інформаційної (матричної) РНК (мРНК), комплементарної ДНК (кДНК) і комплементарної РНК (кРНК). Термін «Геном НК (нуклеїнова кислота)» у тому значенні, у якому він використовується тут, включає РНК, мРНК, кРНК, ДНК і кДНК. Термін «ген» широко використовується для позначення будь-якого сегменту полінуклеотиду, пов'язаного з біологічною функцією. Таким чином, гени або полінуклеотиди включають інтрони і екзони, як в послідовності геному, або тільки кодуючі послідовності, як в кДНК, такі як відкрита рамка зчитування (open reading frame, ORF), починаючи із стартового кодону (метионінового кодону) і закінчуючи сигналом термінації (стоп-кодоном). Гени і полінуклеотиди також можуть включати ділянки, які регулюють їх експресію, наприклад, на рівні ініціації транскрипції, трансляції і термінації транскрипції. Таким чином, в даний термін також включаються промотори і ділянки зв'язування з рибосомою (зазвичай ці регуляторні елементи лежать приблизно між 60 і 250 нуклеотидами, розташованими вище за стартовий кодон кодуючої послідовності або гена; Doree S M et al.; Pandher K et al.; Chung J Y et al.), термінатори транскрипції (зазвичай термінатор розташовується в межах приблизно 50 нуклеотидів нижче стоп-кодону в кодуючій послідовності або гені; Ward C K et al.). Геном або полінуклеотидом також називається фрагмент нуклеїнової кислоти, який експресує мРНК або функціональну РНК, або кодує певний білок, і який включає регуляторні послідовності. Термін «гетерологічна ДНК», у тому значенні, в якому він використовується тут, відноситься до ДНК, яка походить з іншого організму, такого як інший тип клітин або інший вид по відношенню до реципієнта. Даний термін також відноситься до ДНК або її фрагмента з того ж самого геному ДНК хазяїна, коли гетерологічна ДНК вставлена в ділянку геному, який відрізняється від місця її початкової локалізації. Терміни «антиген» або «імуноген», у тому значенні, в якому вони використовується тут, позначають субстанцію, яка індукує специфічну імунну відповідь у тварини-хазяїна. Антиген може включати цілий організм, мертвий, ослаблений або живий; субодиницю або частину організму; рекомбінантний вектор, який містить вставку з імуногенними властивостями; частину або фрагмент ДНК, здатний індукувати імунну відповідь при презентації в тварині-хазяїна; поліпептид, епітоп, гаптен або будь-яку їх комбінацію. Альтернативно до цього, імуноген або антиген можуть включати токсин або антитоксин. Термін «імуногенний білок або пептид», у тому значенні, в якому він використовується тут, включає поліпептиди, які є імунологічно активними в тому сенсі, що при введенні такого білка хазяїну він здатний викликати імунну відповідь гуморального і/або клітинного типу, направлену проти цього білка. Переважно білковий фрагмент має практично таку ж імунологічну активність, як і цілий білок. Таким чином, білковий фрагмент відповідно до даного винаходу включає або складається, щонайменше, з одного епітопа або антигенної детермінанти. «Імуногенний білок або пептид», у тому значенні, в якому він використовується тут, включає повнорозмірну послідовність білка, її аналог або її імуногенні фрагменти. Під «імуногенним фрагментом» розуміють фрагмент білка, який включає один або більше епітопів і, таким чином, викликає імунологічну відповідь, описану вище. Такі фрагменти можуть бути ідентифіковані з використанням будь-якого набору методів епітопного картування, добре відомих в даній галузі техніки. Дивися, наприклад, Epitope Mapping Protocols в Methods in Molecular Biology, Vol. 66 6 UA 110328 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Наприклад, лінійні епітопи можуть бути визначені, наприклад, шляхом конкурентного синтезу великого числа пептидів на твердих основах, пептидів, які відповідають ділянкам білкової молекули, і аналізу реагування цих пептидів з антитілами за умов, коли пептиди ще залишаються пов'язаними з основами. Такі методи відомі в даній галузі техніки і описані, наприклад, у Патенті США № 4 708 871; Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986. Подібно до цього, конформаційні епітопи легко ідентифікуються шляхом визначення просторової конформації амінокислот за допомогою, наприклад, рентгенівської кристалографії і двовимірного ядерного магнітного резонансу. Дивися, наприклад, Epitope Mapping Protocols, supra. Термін «імуногенний білок або пептид» додатково включає делеції, вставки і заміни в послідовності, до тих пір, поки поліпептид функціонує в плані індукції імунологічної відповіді, як тут визначено. Термін «консервативна варіація (заміна)» означає заміну амінокислотного залишку на інший біологічно схожий залишок, або заміну нуклеотиду в послідовності нуклеїнової кислоти, таку, що кодований амінокислотний залишок не зміниться або буде замінений на інший біологічно схожий залишок. В цьому відношенні особливо бажані заміни будуть, як правило, консервативними в природі, тобто, це такі заміни, які мають місце в межах одного родини амінокислот. Наприклад, амінокислоти зазвичай підрозділяються на чотири родини: (1) кислі – аспартат і глутамат; (2) лужні – лізин, аргінін, гістидин; (3) неполярні – аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан; і (4) незаряджені полярні – гліцин, аспарагін, глутамін, цист(е)їн, серин, треонін, тирозин. Фенілаланін, триптофан і тирозин іноді класифікуються як ароматичні амінокислоти. Приклади консервативних варіацій включають заміну одного гідрофобного залишку, такого як ізолейцин, валін, лейцин або метіонін на інший гідрофобний залишок, або заміну одного полярного залишку на інший полярний залишок, наприклад, заміну аргініну на лізин, глутамінової кислоти на аспарагінову кислоту, або глутаміну на аспарагін, і тому подібне; або подібну консервативну заміну однієї амінокислоти на структурно схожу амінокислоту, що не матиме значного впливу на біологічну активність. Білки, які мають значною мірою однакову амінокислотну послідовність як референтні (еталонні) молекули, але які містять мінорні амінокислотні заміни, які не впливають значно на імуногенність білка, потрапляють, таким чином, під визначення референтного поліпептиду. Всі поліпептиди, отримані шляхом таких модифікацій, є включеними в це визначення. Термін «консервативна варіація» також включає використання заміненої амінокислоти на місці незаміненої початкової амінокислоти, за умови, що антитіла, отримані проти поліпептиду із заміною, також є імунореактивними відносно незаміщеного поліпептиду. Термін «клітина-хазяїн» позначає прокаріотичну або еукаріотичну клітину, яка була генетично змінена або здатна бути генетично зміненою шляхом введення екзогенного полінуклеотиду, такого як рекомбінантна плазміда або вектор. При позначенні генетично змінених клітин даний термін відноситься як до початково зміненої клітини, так і до її потомства. Полінуклеотиди, які включають бажану послідовність, можуть бути вставлені у відповідний вектор для клонування або експресійний вектор, і даний вектор у свою чергу може бути введений у відповідну клітину-хазяїна для реплікації і ампліфікації. Полінуклеотиди можуть бути введені в клітину-хазяїна будь-яким способом, відомим в даній галузі техніки. Вектори, які містять полінуклеотиди, що представляють інтерес, можуть бути введені в клітину-хазяїна за допомогою будь-якого набору відповідних методів, включаючи пряме перенесення (поглинання), ендоцитоз, трансфекцію, спаровування (f-mating), електропорацію, трансфекцію за допомогою хлориду кальцію, хлориду рубідію, фосфату кальцію, ДЕАЕ-декстрану або інших сполук; бомбардування мікрокулями; ліпофекцію; та інфікування (коли вектор є інфекційним, наприклад, як у разі ретровірусного вектора). Вибір векторів, які вводяться в клітину, або полінуклеотидів часто залежатиме від властивостей клітини-хазяїна. «Імунологічна відповідь» на композицію або вакцину є розвитком у хазяїна клітинної і/або опосередкованої антитілами імунної відповіді на композицію, яка представляє інтерес, або вакцину. Як правило, «імунологічна відповідь» включає, але цим не обмежується, один або більше з поміж наступних ефектів: продукцію антитіл, В-клітин, клітин Т-хелперів і/або цитотоксичних Т-клітин, націлених специфічно на антиген або антигени, включені в композицію, яка представляє інтерес, або вакцину. Переважно, хазяїн демонструватиме або терапевтичну, або захисну імунологічну відповідь, так що стійкість до нової інфекції буде підвищеною і/або клінічна тяжкість захворювання буде пониженою. Такий захист виявлятиметься або в ослабленні, або у відсутності симптомів, які зазвичай спостерігаються у інфікованого хазяїна, швидшому часі відновлення і/або пониженому титрі вірусу у інфікованого хазяїна. Одне втілення даного винаходу пропонує послідовність ДНК геному і кодуючі білкові послідовності APMV-8. Послідовність комплементарної ДНК (кДНК) геному штаму APMV-8 7 UA 110328 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 даного винаходу має полінуклеотидну послідовність, як показано в SEQ ID NO:1. Послідовність геномом кДНК APMV-8 (SEQ ID NO:1) має 48% ідентичності послідовності до ДНК геному APMV1 (SEQ ID NO:15), 61% ідентичності послідовності до ДНК геному APMV-2 (SEQ ID NO:16), 47,2% ідентичності послідовності до ДНК геному APMV-3 (SEQ ID NO:17), 47,6% ідентичності послідовності до ДНК геному APMV-4 (SEQ ID NO:18), 52% ідентичності послідовності до ДНК геному APMV-6 (SEQ ID NO:19), 53% ідентичності послідовності до ДНК геному APMV-7 (SEQ ID NO:20), 99,1% ідентичності послідовності до ДНК геному APMV-8 (SEQ ID NO:37), 96,5% ідентичності послідовності до ДНК геному APMV-8 (SEQ ID NO:38), 96,4% ідентичності послідовності до ДНК геному APMV-8 (SEQ ID NO:39), 48% ідентичності послідовності до ДНК геному APMV-9 (SEQ ID NO:40). У іншому втіленні, даний винахід пропонує полінуклеотид з послідовністю, показаною в SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8, 10 або 12, і його варіант або фрагмент. Даний винахід додатково включає комплементарний ланцюг до описаного тут полінуклеотиду. У ще одному втіленні даний винахід пропонує поліпептид з послідовністю, показаною в SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 або 14, і його варіант або фрагмент. Більш того, гомологи полінуклеотидів або поліпептидів з APMV, наприклад, з штамів APMV8, APMV-2, APMV-4, APMV-6, є такими, що входять в рамки даного винаходу. Термін «гомологи», у тому значенні, в якому він використовується тут, включає ортологи, аналоги і паралоги. Термін «аналоги» відноситься до двох полінуклеотидів або поліпептидів, які мають однакову або схожу функцію, але які еволюціонували незалежно в неспоріднених організмах. Термін «ортологи» відноситься до двох полінуклеотидів або поліпептидів з різних організмів, які еволюціонували із загального предкового гена в процесі видоутворення. Як правило, ортологи кодують поліпептиди, які мають однакові або схожі функції. Термін «паралоги» відноситься до двох полінуклеотидів або поліпептидів, які зв'язані спорідненістю за рахунок дуплікації в межах геному. Паралоги зазвичай мають різні функції, але ці функції можуть бути спорідненими. Аналоги, ортологи і паралоги поліпептиду дикого типу APMV можуть відрізнятися від поліпептиду дикого типу APMV своїми посттрансляційними модифікаціями, відмінностями в амінокислотній послідовності, або і тим, і іншим. Зокрема, гомологи даного винаходу будуть, як правило, демонструвати, щонайменше, 80-85%, 85-90%, 90-95%, або 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ідентичності послідовності до всієї або до частини послідовностей полінуклеотиду або поліпептиду APMV-8, і виконуватимуть схожу функцію. У іншому аспекті даний винахід пропонує геном кДНК APMV-8 з послідовністю, показаною в SEQ ID NO:1. У ще одному втіленні полінуклеотид є зворотним комплементарним ланцюгом полінуклеотиду з послідовністю, показаною в SEQ ID NO:1. У ще одному втіленні полінуклеотид або зворотний комплементарний ланцюг полінуклеотиду даного винаходу має, щонайменше, 70%, щонайменше, 75%, щонайменше, 80%, щонайменше, 85%, щонайменше, 90%, щонайменше, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% ідентичності послідовності до полінуклеотиду, який має послідовність, показану в SEQ ID NO:1. У одному втіленні, даний винахід пропонує фрагмент полінуклеотиду, який колірує поліпептид AMPV-8, такий як полінуклеотид, який кодує поліпептид, який має послідовність, показану в SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 або 14. У ще одному аспекті даний винахід пропонує полінуклеотид, який кодує поліпептид, що має, щонайменше, 70%, щонайменше, 75%, щонайменше, 80%, щонайменше, 85%, щонайменше, 90%, щонайменше, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% ідентичності послідовності з поліпептидом, який має послідовність, показану в SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 або 14, або консервативний варіант, алельний варіант, гомолог або імуногенний фрагмент, який включає, щонайменше, вісім, або, щонайменше, десять послідовних амінокислот одного з цих поліпептидів, або комбінація цих поліпептидів. У іншому аспекті даний винахід пропонує полінуклеотид, який має нуклеотидну послідовність, показану в SEQ ID NO:1, 2, 4, 6, 8, 10 або 12, або його варіант. У ще одному втіленні полінуклеотид є зворотним комплементарним ланцюгом полінуклеотиду до послідовності, показаної в SEQ ID NO:1. У ще одному аспекті даний винахід пропонує полінуклеотид або зворотний комплементарний ланцюг полінуклеотиду, який має, щонайменше, 70%, щонайменше, 75%, щонайменше, 80%, щонайменше, 85%, щонайменше, 90%, щонайменше, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% ідентичності послідовності до одного з полінуклеотидів, який має послідовність, показану в SEQ ID NO:1, 2, 4, 6, 8, 10 або 12, або його варіант. У іншому аспекті даний винахід пропонує поліпептид, який має, щонайменше, 70%, щонайменше, 75%, щонайменше, 80%, щонайменше, 85%, щонайменше, 90%, щонайменше, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% ідентичності послідовності з поліпептидом, який має послідовність, показану в SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13 або 14. У ще одному аспекті даний винахід пропонує фрагменти і варіанти поліпептидів APMV, ідентифікованих вище (SEQ ID NO: 3, 5, 7, 8 UA 110328 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9, 11, 13 або 14), які можуть бути легко отримані фахівцем в даній галузі техніки з використанням добре відомих методів молекулярної біології. Варіантами є гомологічні поліпептиди, які мають амінокислотну послідовність, щонайменше, з 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% ідентичністю з амінокислотною послідовністю, показаною в SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 або 14. Варіанти включають алельні варіанти. Термін «алельний варіант» відноситься до полінуклеотиду або до поліпептиду, який містить, поліморфізми, які приводять до змін в амінокислотних послідовностях білка, і які присутні в природній популяції (наприклад, виду або варіанту вірусу). Такі природні алельні варіації зазвичай приводять до 1-5% відмінностей в полінуклеотиді або в поліпептиді. Алельні варіанти можуть бути ідентифіковані шляхом секвенування послідовності нуклеїнової кислоти, яка представляє інтерес, у ряду різних видів, що може бути легко проведене з використанням гібридизаційних зондів для ідентифікації одного і того ж генетичного локусу у цих видів. Будь-який і всі такі варіанти нуклеїнових кислот і поліморфізми, які з'являються в результаті цього або варіації амінокислот, які є результатом природної алельної варіації і які не змінюють функціональну активність гена, який представляє інтерес, охоплені рамками даного винаходу. Термін «ідентичність» відносно послідовностей може відноситися, наприклад, до положень з ідентичними нуклеотидами або амінокислотами, розділеними деякою кількістю нуклеотидів або амінокислот в коротшій з цих двох послідовностей, де вирівнювання цих двох послідовностей може бути проведене відповідно до алгоритму Вілбура і Ліпмана (Wilbur and Lipman). Ідентичність послідовностей або схожість послідовностей двох амінокислотних послідовностей, або ідентичність послідовностей між двома нуклеотидними послідовностями може бути визначена за допомогою пакету програм Vector NTI software package (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA). Коли говориться, що послідовності РНК є схожими або мають певний ступінь ідентичності послідовності або гомології з послідовностями ДНК, тимідин (Т) в послідовності ДНК розглядається як відповідний (рівний) урацилу (У) в послідовності РНК. Таким чином, послідовності РНК знаходяться в рамках даного винаходу і можуть бути похідними від послідовностей ДНК з урахуванням того, що тимідин (Т) в послідовності ДНК розглядається як відповідний (рівний) урацилу (У) в послідовностях РНК. У одному аспекті даний винахід стосується фармацевтичної композиції або вакцини для індукції імунологічної відповіді в тварині-хазяїні, якій введена вакцина або композиція, де вакцина або композиція включає фармацевтично прийнятний носій і модифікований рекомбінантний вірус APMV або вірусний вектор. У ще одному аспекті даного винаходу рекомбінантний вірус APMV або вірусний вектор включає, в межах неістотної ділянки вірусного геному, гетерологічну послідовність ДНК, яка кодує антигенний білок, який походить з патогену, де композиція або вакцина при введенні хазяїну є здатною індукувати імунологічну відповідь, специфічну у відношенні до білка, який кодується патогеном. Термін «вектор» відноситься до рекомбінантної ДНК- або РНК-плазміди, бактеріофагу або вірусу, які включають гетерологічний полінуклеотид, який необхідно доставити в клітину-мішень, або in vitro, або in vivo. Гетерологічний полінуклеотид може включати послідовність, яка представляє інтерес, для цілей профілактики або лікування, і може не обов'язково знаходитися у формі експресійної касети. У тому значенні, яке використовується тут, вектор повинен не бути здатний до реплікації в кінцевій клітині-мішені або в суб'єктові. Даний термін включає вектори для клонування і вірусні вектори. Термін «генно-інженерний» або «рекомбінантний» позначає полінуклеотид напівсинтетичного або синтетичного походження, який або не зустрічається в природі, або сполучений з іншим полінуклеотидом в такому порядку, який не знайдений в природі. Термін «неістотна ділянка» відноситься до ділянки вірусного геному, яка не є істотною для реплікації і розмноження вірусу в культурі тканини, і видалення або інактивація якої можуть знижувати вірулентність в різноманітних тваринних системах. Будь-яка неістотна ділянка або її частина можуть бути видалені з геному APMV або в них може бути вставлена чужорідна послідовність, і життєздатність і стабільність рекомбінантного APMV, отриманого в результаті такої делеції або вставок, може використовуватися для визначення того, чи дійсно видалена ділянка або її частина є неістотними. У одному втіленні, неістотною ділянкою геному APMV є будь-яка ділянка геному APMV-2, 4, 6 або 8, яка не кодує полімеразу (L). У ще одному втіленні неістотна ділянка включає відкриту рамку зчитування, яка кодує неістотний білок. У цьому аспекті відкрита рамка зчитування вибирається з групи, яка складається з нуклеопротеїну (NP), фосфопротеїну (P), матрикспротеїну (M), ф'юженпротеїну (F), і гемаглютиніну/нейрамінідази (HN). У одному втіленні, неістотна ділянка локалізована вище за ген NP. У іншому втіленні, неістотна ділянка локалізована нижче за ген L. У ще одному втіленні, неістотною ділянкою є 9 UA 110328 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 некодуюча або міжгенна ділянка. У цьому аспекті некодуюча або міжгенна ділянка може бути ділянкою між генами NP і P, між генами P і M, між генами M і F, або між генами F і HN в геномі APMV-2, 4, 6 або 8. У ще одному втіленні, неістотна ділянка може знаходиться в ділянці положень нуклеотидів 1 - 140, 1526 - 1692, 2910 - 3085, 4195 - 4498, 6130 - 6382, 8116 - 8272, 8116 - 8289 або 15013 - 15342 в послідовності SEQ ID NO:1. У іншому аспекті даний винахід включає химери APMV, в яких одна частина або цілий ген або декілька частин або цілих генів вектора APMV замінені подібними генами з інших вірусів, зокрема вірусів, які відносяться до родини Рaramyxoviridae. У одному втіленні даного винаходу вакцина або фармацевтична композиція включає антиген, обраний з групи патогенів птахів, включаючи, але ними не обмежуючись, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, вірус інфекційного бронхіту (Infectious Bronchitis virus, IBV), вірус хвороби Ньюкасла (NDV), вірус синдрому зниження яйценоскості (несучості) (egg drop syndrome virus, EDS), або вірус інфекційного бурситу (Infectious Bursal Disease virus, IBDV), вірус інфекційного ларинготрахеїту (Infectious Laryngotracheitis virus, ILTV), аденовіруси птахів, вірус хвороби Марека (Marek’s disease virus, MDV), вірус віспи курей, вірус ентериту качок (duck enteritis virus, DEV), парвовіруси качок, вірус пташиного грипу, APMV, такий як APMV-1 і тому подібні та їх комбінації. У іншому втіленні, вакцина або фармацевтична композиція включають антиген, обраний з поміж патогенів котячих, таких як, але ними не обмежуючись, герпесвірус котячих (FHV), каліцивірус котячих (FCV), вірус лейкемії котячих (FELV), вірус імунодефіциту котячих (FIV), парвовірус котячих (FPV), вірус інфекційного перитоніту котячих (FIPV), вірус сказу і тому подібні, та їх комбінації. У ще одному втіленні, вакцина або фармацевтична композиція даного винаходу включає антиген, обраний з поміж патогенів псових, включаючи, але ними не обмежуючись, вірус сказу, герпесвірус псових (CHV), парвовірус псових (CPV), вірус собачої чуми (CDV), вірус парагрипу 2 псових (CPI2), коронавірус псових, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorragiae, Leptospira grippotyphosa, Borrelia burgdorferi, Bordetella bronchiseptica і тому подібні, та їх комбінації. У ще одному втіленні, вакцина або фармацевтична композиція включає антиген, обраний з поміж патогенів коней, таких як герпесвірус коней (тип 1 або тип 4), вірус грипу коней, правця, вірус лихоманки Західного Нілу, артеривірус коней і тому подібні, та їх комбінації. У ще одному втіленні, вакцина або фармацевтична композиція включає антиген, обраний з поміж патогенів парнокопитних, такого як вірус сказу, ротавірус великої рогатої худоби, вірус парагрипу типу 3 великої рогатої худоби (bPIV-3), коронавірус великої рогатої худоби, вірус вірусної діареї великої рогатої худоби (BVDV), вірус ящура (FMDV), вірус чуми великої рогатої худоби (Rinderpest virus, RPV), вірус чуми дрібних жуйних тварин (Peste des Petits Ruminants virus, PPRV), віруси злоякісної катаральної лихоманки великої рогатої худоби, респіраторносинцитіальний вірус великої рогатої худоби (BRSV), вірус інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби (IBR), Escherichia coli, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica і тому подібні, та їх комбінації. У іншому втіленні вакцина або фармацевтична композиція включає антиген, вибираний з поміж патогенів свиней, таких як, але ними не обмежуючись, вірус свинячого грипу (SIV), цирковірус свиней типу 2 (PCV-2), вірус репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (PRRS), вірус несправжнього сказу (PRV), парвовірус свиней (PPV), FMDV, Mycoplasma hyopneumoniae, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli і тому подібні, та їх комбінації. Конструювання рекомбінантного вірусу добре відоме в даній галузі техніки, як описано, наприклад, в Патентах США Nos. 4,769,330, 4,722,848, 4,603, 112, 5,174, 993, і 5,756,103, 6,719,979. Зокрема, рекомбінантний вірус APMV може бути сконструйований в дві стадії. Поперше, ген, який представляє інтерес для вбудовування у вірус, такий як відкрита рамка зчитування антигену з APMV-1 (NDV) або вірусу пташиного грипу або іншого організму, поміщається в плазмідну конструкцію E.coli, у яку вставлена кДНК, гомологічна до ділянки кДНК APMV. Окремо від цього, перед кДНК послідовності гена, який повинен бути вставлений вставляють промоторну ділянку (стартову ділянку гена), а за нею слідує ділянка кінця гена, який є специфічним для вектора APMV. Фрагмент ДНК, який складається із стартової ділянки гена/чужорідного антигену/кінця гена, фланкується фрагментом кДНК, гомологічним до APMV-8 кДНК, що містить унікальні сайти (ділянки) для розщеплювання ферментами рестрикції. Потім отримана плазмідна конструкція ампліфікується шляхом вирощування в бактеріях E.coli і виділяється. Далі рекомбінантна плазміда використовується для розщеплювання ферментом рестрикції для вирізання фрагмента ДНК, який включає стартову ділянку гена/чужорідний антиген/кінець гена, який фланкований кДНК, гомологічною до кДНК APMV-8, і подальшого 10 UA 110328 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лігування цього фрагмента у відповідним чином розщеплену повнорозмірну конструкцію APMV8. Повнорозмірна конструкція, яка містить ген, який представляє інтерес, трансфікується в клітини разом з плазмідами, які містять полінуклеотиди для експресії нуклеопротеїну (NP) APMV, фосфопротеїну (Р) APMV і РНК-полімерази (L) APMV, а також T7 РНК-полімерази. Всі кДНК-конструкції APMV знаходяться під контролем промотору Т7-полімерази. Збереження інфекційності вірусу здійснюється, як описано в Romer-Oberdorfer et al., 1999, і як показано на Фігурі 19А. Експресія Т7 РНК-полімерази в трансфікованих клітинах може бути досягнута різними способами, включаючи трансфекцію плазмідною ДНК, яка містить експресійну касету для Т7 РНК-полімерази, рекомбінантний вірус (такий як вірус курячої віспи або віспи канарейок), експресуючий Т7 РНК-полімеразу, або в клітинах, які експресують Т7 РНК-полімеразу. У іншому аспекті полінуклеотиди для експресії нуклеопротеїну (NP) APMV, фосфопротеїну (Р) APMV і РНК-полімерази (L) APMV і повнорозмірна вірусна кРНК знаходяться під контролем дійсного раннього промотору цитомегаловірусу людини. Збереження вірусу проводиться, як описано в Inoue K, et al., 2003. Успішна експресія вставленої кДНК (чужорідної кДНК або гетерологічної кДНК), яка представляє інтерес, модифікованим інфекційним вірусом вимагає двох умов. По-перше, вставка повинна бути введена в ділянку геному вірусу так, щоб модифікований вірус залишався життєздатним. Другою умовою для експресії вставленої кДНК є присутність регуляторних послідовностей, що забезпечують експресію даного гена у складі вірусного геному (наприклад, початок гена, кінець гена, промотор, енхансер, сигнали поліаденілювання, міжгенні і нетрансльовані ділянки). В цілому, бажано застосовувати сильний промотор, функціональний в еукаріотичних клітинах. У одному втіленні, промотором, який використовується для транскрипції вірусної мРНК вірусною РНК-полімеразою, є «послідовність старту гена». «Послідовністю старту гена» є сайт скріплення для L білка, необхідний для скріплення і транскрипції розташованої нижче вірусної РНК у вірусну мРНК. У одному втіленні, даний винахід пропонує введення терапевтично ефективної кількості вакцини APMV для доставки і експресії антигену, епітопа або імуногену в клітину-мішень. Визначення терапевтично ефективної кількості є рутинним завданням для фахівця середньої кваліфікації в даній галузі техніки. У одному втіленні, композиція вакцини APMV включає експресійний вектор, який містить полінуклеотид, який кодує антиген, епітоп або імуноген, і фармацевтично або ветеринарно прийнятний носій, зв'язуючий матеріал або наповнювач. У іншому втіленні, фармацевтично або ветеринарно прийнятний носій, зв’язуючий матеріал або наповнювач полегшують трансфекцію і/або покращують збереження вектора або білка. Фармацевтично або ветеринарно прийнятні носії, або зв’язуючі матеріали, або наповнювачі добре відомі фахівцеві в даній галузі техніки. Наприклад, фармацевтично або ветеринарно прийнятний носій, або зв’язуючий матеріал, або наповнювач можуть бути 0,9% розчином NaCl (тобто, фізіологічним розчином) або фосфатним буфером. Інші фармацевтично або ветеринарно прийнятні носії, або зв’язуючі матеріали, або наповнювачі, які можуть застосовуватися в способах даного винаходу, включають, але ними не обмежуються, полі-(Lглутамат) або полівінілпіролідон. Фармацевтично або ветеринарно прийнятний носій, або зв’язуючий матеріал, або наповнювач можуть бути будь-якою сполукою або комбінацією сполук, які полегшують введення вектора (або білка, експресованого вектором даного винаходу in vitro), або які полегшують трансфекцію і/або поліпшують збереження вектора (або білка). Дози і об'єми дозувань тут обговорюються в загальному описі і також можуть бути визначені фахівцем в даній галузі техніки, виходячи з прочитання даного «Розкриття винаходу» з урахуванням знань в даній галузі техніки, без якого-небудь спеціального експериментування. У іншому втіленні, фармацевтично або ветеринарно прийнятний носій, наповнювач або зв’язуючий матеріал, можуть бути емульсією води в олії. Приклади придатних емульсій води в олії включають водно-олійні емульсії для вакцинації на олійній основі, які є стабільними і залишаються рідкими при 4 °C, і які містять: від 6 до 50% (за об'ємом) антиген-вмісної водної фази, від 12 до 25% (за об'ємом), від 50 до 94% (за об'ємом) олійної фази, яка складається повністю або частково з неметаболізованої олії (наприклад, мінеральної олії, такої як рідкий парафін), і/або метаболізованої олії (наприклад, рослинної олії, або ефірів жирних кислот, поліолів або спиртів), від 0,2 до 20 (p/v) % сурфактантів, від 3 до 8 (p/v) %, останні представлені повністю або частково, або в суміші або з ефірами полігліцеролу, де вказані ефіри полігліцеролу є полігліцерол(полі) рицинолеатами, або поліоксиетиленрициновими оліями, або ж поліоксиетиленрициновими оліями, що гідруються. Приклади сурфактантів, які можуть застосовуватися в емульсії вода в олії, включають етоксильовані ефіри сорбітану (наприклад, 11 UA 110328 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 поліоксиетилен(20) сорбітан моноолеат (TWEEN 80®), доступний від AppliChem, Inc., Cheshire, CT) і ефіри сорбітану (наприклад, сорбітан моноолеат (SPAN 80®), доступний від Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Крім того, відносно емульсії вода в олії, дивися також Патент США № 6 919 084. У деяких втіленнях водна фаза, яка містить антиген, включає сольовий розчин, який містить один або більше буферних агентів. Прикладом відповідного буферного розчину є фосфатний буферний розчин. У одному втіленні, емульсія води в олії може бути потрійною емульсією вода/олія/вода (W/O/W) (дивися, наприклад, Патент США № 6 358 500). Приклади інших придатних емульсій описані в Патенті США № 7 371 395. Фармацевтичні композиції і вакцини відповідно до даного винаходу можуть включати або складатися в основному з одного або більш ад′ювантів. Відповідними ад′ювантами для застосування при здійсненні даного винаходу є (1) полімери акрилової або метакрилової кислоти, малеїновий ангідрид і полімери похідних алкенілів, (2) імуностимулюючі послідовності (ISS), такі як олігодезоксирибонуклеотидні послідовності, які мають одну або більше неметильованих одиниць (Klinman et al., 1996; WO98/16247) CPG, (3) емульсії олії у воді, такі як емульсія SPT, описана на стор. 147 в «Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach» опублікованій M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, і емульсія MF59, описана на стор. 183 в тій же роботі, (4) катіонні ліпіди, які містять четвертинну сіль амонію, наприклад, DDA, (5) цитокіни, (6) гідрооксид алюмінію або фосфат алюмінію, (7) сапонін або (8) інші ад′юванти, що обговорюються в будь-якому процитованому тут документі, які всі включаються до даного винаходу шляхом посилання, або (9) будь-які їх комбінації або суміші. Емульсія олії у воді (3), яка є особливо придатною для вірусних векторів, може мати своєю основою: легку рідку парафінову олію (тип Європейської фармакопеї), ізопреноідну олію, таку як сквалан, сквалеон, олію, що отримується при олігомеризації алкенів, наприклад, ізобутену або децену, ефіри кислот або спиртів, які мають алкільну групу з нерозгалуженим ланцюгом, такі як рослинні олії, етилолеат, пропіленгліколь, ди(каприлат/капрат), гліцеролтри(каприлат/капрат) і пропіленглікольдиолеат, або ефіри розгалужених жирних спиртів або кислот, особливо ефіри ізостеаринової кислоти. Олія використовується в комбінації з агентами, що емульгують, для утворення емульсії. Агентами, що емульгують, можуть бути неіонні сурфактанти, такі як: ефіри, з одного боку, сорбітану, маніду (наприклад, ангідроманітололеат), гліцеролу, полігліцеролу або пропіленгліколю і, з іншого боку, олеїнової, ізостеаринової, рицинолеїнової або гідроксистеаринової кислот, де вказані ефіри можуть не обов'язково бути етоксильованими, або бути поліоксипропілен-поліоксиетилен блок-співполімерами, такими як Плюроник, наприклад, L121. Серед ад'ювантних полімерів типу (1) перевага віддається полімерам поперечно зшитої акрилової або метакрилової кислоти, особливо зшитим поліалкеніловими ефірами цукрів або поліспиртів. Ці сполуки відомі під назвою карбомер (Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, June 1996). Фахівець в даній галузі техніки може також звернутися до Патенту США № 2 909 462, який пропонує такі акрилові полімери, поперечно зшиті полігідроксильною сполукою, яка має, щонайменше, три гідроксильні групи, бажано не більше, ніж вісім таких груп, де атоми водню, щонайменше, трьох гідроксильних груп замінені ненасиченими аліфатичними радикалами, які мають, щонайменше, два атоми вуглецю. Кращими радикалами є такі, які містять від 2 до 4 атомів вуглецю, наприклад, вініл, аліли та інші етиленовані ненасичені групи. Ненасичені радикали можуть також містити інші замісники, такі як метил. Продукти, які продаються під назвою Carbopol (BF Goodrich, Ohio, USA), є особливо бажаними. Вони є поперечно зшитими алілсахарозою або алілпентаеритритолом. Серед них можна вказати на Carbopol 974P, 934P і 971P. Відносно співполімерів, похідних малеїнового ангідриду/алкенілів, то перевага надається EMA (Monsanto), які є співполімерами етилен/малеїнового ангідриду з прямим ланцюгом або поперечно зшиті, і які, наприклад, зшиті дивініловим ефіром. Можна також послатися на роботу J. Fields et al., 1960. Щодо структури, то полімери акрилової або метакрилової кислоти і ЕМА переважно утворені з базових одиниць, які мають наступну формулу: R1 C R2 ( CH )x 2 C COOH COOH 12 ( CH )y 2 UA 110328 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 у якій: -R1 і R2, які можуть бути однаковими або різними, представлені H або CH 3 -x = 0 або 1, бажано x = 1 -у = 1 або 2, де x + у = 2. Для EMA, x = 0 і у = 2 і для карбомерів x = у = 1. Ці полімери є розчинними у воді або фізіологічному сольовому розчині (20 г/л NaCl) і рН може бути доведений до 7,3-7,4, наприклад, лугом (NаOH), для отримання розчину ад′юванта, в який може (можуть) бути включений (включені) вектор (вектори) експресії. Концентрація полімеру в кінцевій імунологічній композиції або вакцині може знаходитися в діапазоні між 0,01 і 1,5% (вага/об'єм) між 0,05 і 1% (вага/об'єм) і між 0,1 і 0,4% (вага/об'єм). Інший аспект даного винаходу стосується способу індукції імунологічної відповіді у тварини до антигену, який передбачає введення тварині вакцини або фармацевтичної композиції, яка містить модифікований рекомбінантний вірус APMV, який включає і кодує антиген патогену для вказаної тварини. Ще інший аспект даного винаходу стосується способу індукції імунологічної відповіді у тварини на антиген в режимі введення «прайм-буст», який передбачає, щонайменше, одне первинне введення і, щонайменше, одне бустерне введення із застосуванням, щонайменше, одного загального поліпептиду, антигену, епітопа або імуногену. Імунологічна композиція або вакцина, яка застосовується при первинному введенні, може бути тією ж самою або може відрізнятися за своєю природою від тієї, що використовується при бустерному введенні. У одному аспекті протоколу «прайм-буст» даного винаходу композиція або вакцина, яка включає рекомбінантний вірус APMV (вірусний вектор) даного винаходу вводиться перед подальшим введенням інактивованої вірусної вакцини або композиції, яка включає антиген, або вакцини або композиції, що включає субодиницю (білок, антиген), або ДНК-плазмідної вакцини або композиції, яка містить або експресує антиген. Подібно до цього, протокол «прайм-буст» може включати введення інактивованої вірусної вакцини або композиції, яка включає антиген, або вакцини або композиції, яка включає субодиницю (білок, антиген), або ДНК-плазмідної вакцини або композиції, яка містить або експресує антиген, перед подальшим введенням композиції або вакцини, яка включає рекомбінантний вірус APMV (вірусний вектор) даного винаходу. Слід також вказати, що обидва введення, і первинне, і вторинне, можуть включати композицію або вакцину, яка включає рекомбінантний вірус APMV (вірусний вектор) даного винаходу. Первинне введення може включати одне або більше введення одних і тих же імунологічних композицій вакцини на основі вірусного вектора. Подібно до цього, бустерне введення може включати одне або більше введення тієї ж імунологічної композиції вакцини на основі вірусного вектора. Шляхи введення при первинному і бустерному введенні можуть бути однаковими або різними. Подібно до цього, походження захисного гена, присутнього в первинному і в бустерному введеннях, може бути одним і тим же або різним (наприклад, різні штами). Різні введення проводяться бажано з інтервалом від 1 до 6 тижнів одне від іншого, краще приблизно через 3 тижні. Згідно кращій схемі також передбачаються щорічні бустерні введення, бажано із застосуванням імунологічної композиції вакцини на основі вірусного вектора. Тварини бажано мають вік, щонайменше, один день при першому введенні. Може застосовуватися багато способів введення, таких як підшкірний або внутрішньом'язовий, внутрішньошкірний або трансдермальний, у вигляді спрею, питної води, очних крапель, внутрішньоназально, перорально, з їжею, in ovo, або їх комбінація (наприклад, в очі і ніс, в рот і ніс). Даний винахід далі буде детально описаний за допомогою наступних нелімітуючих прикладів. ПРИКЛАДИ Приклад 1 APMV-2, APMV-4 і APMV-6 А. Віруси і Птахи Одноденні курчата (Merial, Gainesville, GA) SPF (вільні від специфічного антигену) містилися в ізольованих клітках Horsfall-Baur під позитивним тиском. Корм і вода надавалися ad libitum, і птахи оглядалися двічі на день. Використані в експериментальних дослідженнях віруси (APMV2, 4 і 6) були виділені з диких птахів і класифіковані в National Veterinary Service Laboratory (NVSL, Ames Iowa, USA). Віруси розмножували в 9-денних зародках SPF курячих яєць (SunRise Farms, Catskill, NY, USA) шляхом інокуляції через алантоїс. Алантоїсну рідину збирали на 3 день після інокуляції, розділяли на аліквоти і зберігали при –80 °C. Підтип APMV підтверджували в тесті HI з використанням стандартних сивороток (NVSL, Ames, Iowa, USA). Інфекційна доза для 50% яєць (EID50) для кожного ізоляту була визначена за допомогою інокуляції 10-разових серійних розведень алантоїсної рідини в зародки SPF яєць. Титр 13 UA 110328 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розраховували за методом, описаним Reed and Muench (Reed, LJ et al., 1938, Am. J. Epidemiol. 27:493-497). B. Експериментальне інфікування По двадцять п'ять одноденних курчат SPF в кожній групі інфікували 106 EID 50 на одне курча окулярно-назальним шляхом (через очі і ніс). Курчат в контрольній групі інокулювали неінфікованим PBS (фосфатний буферний розчин). В дні 2, 4, 7, 14 і 28 після інфікування у п'яти птахів з кожної групи забирали кров з плечової вени для збору зразків сироватки, птахів убивали під CO2, і проводили розтин. Відбирали зразки тканин трахеї, легенів, підшлункової залози і кишківника. Для кожного органу використовували нову пару стерильних ножиць і пінцетів. Половину зразка тканини поміщали в пробірку Lysing Matrix D tube (MP Biomedicals, Solon, OH), яка містить середовище для перенесення вірусів (1X мінімальне основне середовище, 7,5% бікарбонат натрію, 15 мМ HEPES, 1% фетальна сироватка телят, 4000 Од/мл пеніцилін, 400 мкг/мл гентаміцин, 8 мкг/мл амфотерицин B, 4000 мкг/мл стрептоміцин, 1000 мкг/мл канаміцин сульфат). Друга половина зразка тканини фіксувалася в 10-процентному забуференому формаліні і заливалася в парафін. Зрізи залитих в парафін тканин фарбували гематоксиліном Майєра і еозином (H&E). Результати показали, що слабка діарея спостерігалася на четвертий день і на сьомий день після інфікування у птахів, інфікованих APMV-2 або APMV 4. При розтині у птахів, інфікованих APMV-2, спостерігалося невелике збільшення підшлункової залози на другий і на четвертий день після інфікування. Ніяких інших значних пошкоджень ні в одній групі виявлено не було. C. Серологія Для виявлення вірусу в алантоїсній рідині і аналізу присутності HI антитіл в зібраних зразках сироватки використовувалися тести гемаглютинації (НА) та інгібування гемаглютинації (HI) відповідно. Тести проводили стандартним способом, використовуючи 0,8% еритроцитів курчат, ресуспендованих в PBS. Тест HI проводили методом розведення сироватки при постійному рівні антигена. Для кожного розведення сироватки використовували вісім HA одиниць вірусного антигена. Титри HI антитіл досліджували в дні 2, 4, 7, 14 і 28 після інфікування. Позитивні титри HI (≥1:16) були виявлені в зразках сироватки інфікованих птахів APMV-2 на 7 день (1/5), 14 день (5/5) і 28 день після інфікування (5/5). Цікаво відзначити, що тільки одне курча, інфіковане APMV-4, продемонструвало титр HI, який був оцінений як позитивний під час всього ходу експерименту на 14 день після інфікування. Подібно до цього для групи APMV-6 двоє курчат з п'яти показали титр HI 1:16 тільки на 28 день після інфікування. Фіктивно інфіковані птахи залишалися негативними на наявність HI антитіл проти всіх трьох APMV, які використовувались в цьому експерименті. Крім того, для виключення перехресного зараження всі сироватки були протестовані на наявність HI антитіл проти двох інших антигенів і показали негативні результати. D. Виділення вірусу Зразки тканин, зібрані в Lysing Matrix D tubes (MP Biomedicals, Solon, OH, USA), були двічі ® прогомогенізовані з використанням Fastprep -24 (MP Biomedicals, Solon, OH) в режимі 4,0 M/S протягом 20 секунд. Після інкубації протягом 15 хв. за кімнатної температури гомогенізовані зразки центрифугували 20 хв. при 2000 g при 4 °C. Стерильність перевіряли після інокуляції 50 мкл отриманого супернатанту в 2 мл триптозо-фосфатного бульйону (TPB) (DIFCO, Becton Dickenson, Sparks, MD, USA), збагаченого 10% гідролактальбуміну, при інкубації при 37 °C на обертальному (орбітальному) шейкері протягом ночі. Нестерильні зразки фільтрували через 0,45 мкм шприцеві фільтри (Whatman Inc., Florham Park, NJ, USA). Зразки зберігали при –80 °C. Виділення вірусу проводили шляхом інокуляції 0,1 мл в алантоїсну порожнину 9-денних зародків SPF курячих яєць. Після інкубації протягом трьох днів при 37,5 °C алантоїсну рідину збирали і аналізували на наявність гемаглютинуючої активності в тесті HA. Для виявлення місць розмноження вірусу декілька органів (трахея, легені, кишківник, підшлункова залоза) аналізували на інфекційний вірус шляхом ізолювання вірусу із зародків яєць (Фігура 1). В цілому, вірус, що розмножується, був виявлений тільки в декількох курчат. Коротко, APMV-4 був виділений на 2 день з трахеї, легенів і підшлункової залози, тоді як APMV6 був виділений з легенів і підшлункової залози. На 4 день APMV-2 був виділений з трахеї і легенів, тоді як APMV-6 був виділений зі всіх тестованих органів за винятком кишківника. На 7 день APMV-2 був виділений з єдиного зразка кишківника, APMV-4 був виділений з підшлункової залози, тоді як APMV-6 був виділений із зразків легенів і підшлункової залози. Несподівано на 14 день після інфікування віруси не були виділені, а на 28 день після інфікування APMV-2, 4 і 6 були виділені з підшлункової залози. З фіктивно інокульованих птахів вірусів виділено не було. Ідентичність знов виділених вірусів була підтверджена в тесті HI з використанням стандартних 14 UA 110328 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сивороток, які надаються NVSL. Для оцінки патологічного потенціалу досліджуваних вірусів були проаналізовані мікроскопічні ураження в отриманих органах (Фігура 2). На 2 день після інфікування у всіх інфікованих курчат спостерігалися катаральний трахеїт в комбінації з втратою війок в респіраторному (миготливому) епітелії і слабкий ентерит. На 4 день після інфікування інфіковані курчата APMV-2 демонстрували збільшену кількість гіпертрофованих слизових залоз в трахеї і фокальну (осередкову) виразку респіраторного епітелію. Інфіковані птахи APMV-4 демонстрували зміни, які дозволяють віднести їх до респіраторної інфекції, такі як слабкий трахеїт, слабкий до помірного багатоосередковий лімфоцитарний панкреатит, а також фокальна гіперплазія асоційованої з бронхами лімфоїдної тканини (BALT, Bronchus-Associated Lymphoid Tissue) на 4 день після інфікування. Дослідження органів інфікованих курчат APMV-6 виявило зміни в трахеї, такі як катаральний і виразковий трахеїт, і фокальний панкреатит, що узгоджується з ураженням вірусом. На 7 день після інфікування інфіковані курчата APMV-2 демонстрували ослаблення фокального трахеїту або відновлення респіраторного епітелію, що є ознаками одужання. Птахи, інфіковані APMV-4, демонстрували слабку гіперплазію BALT, тоді як інфіковані птахи APMV-6 демонстрували кістозну (пузирчасту) ентеропатію, фокальний ентерит та інфільтрат лімфоцитів в підшлункову залозу. Крім слабкого лімфоцитарного ентериту і слабкої гіперплазії GALT, інфіковані птахи APMV-2 також демонстрували ознаки одужання, такі як ослаблення ураження трахеї на 14 день після інфікування. Зразки органів курчат, інфікованих APMV-4 або 6, демонстрували зміни, що дозволяють зробити висновок про вірусну інфекцію, такі як слабка інтерстиціальна пневмонія, катаральний трахеїт і гіперплазія BALT або GALT на 14 день після інфікування. Всі досліджені зразки, отримані з інфікованих курчат, продемонстрували ураження, такі як гіперплазія GALT, лімфоцитарний панкреатит і лімфоцитарний бронхіт на 28 день після інфікування. На 2 день птахи контрольної групи продемонстрували слабкий катаральний трахеїт, який міг бути пов'язаний з чинниками навколишнього середовища. Фігура 3 показує низькі титри HI (до 1:32 на 14 день) у SPF курчат, інфікованих APMV-4 або APMV-6, указуючи на те, що тільки інфекція APMV-2 викликає HI відповідь, яка може бути охарактеризованою як серопозитивна. Проте, всі три віруси виділялися з трахеї, легенів, кишківника і підшлункової залози інфікованих птахів аж до 7 дня після інфікування і з підшлункової залози аж до 28 дня після інфікування. Інфекція APMV-2, 4 або 6 демонструє характерні гістопатологічні ураження (підсумовані у Фігурі 2) у всіх інфікованих птахів, що указує на стимуляцію вірусним антигеном. Виділення вірусів і гістологічні профілі інфікованих птахів чітко показують тропізм вірусів в інфікованих птахах (трахея і легені від 2 до 7 дні, і кишківник, легені і підшлункова залоза після 7 дня). Всі ізоляти були виявлені в підшлунковій залозі аж до 28 дня після інфікування, але виділення вірусу було неможливим на 14 день після інфікування. Це указує на те, що досліджувані APMV, мабуть, можуть зберігатися і пізніше знов активуватися. Таким чином, носії вірусу можуть бути присутніми в інфікованих групах/популяціях птаха. Тільки APMV-2 індукував утворення HI антитіл, тоді як HI антитіла у курчат, інфікованих APMV-4 і 6, не визначалися. Приклад 2. APMV-8 А. Віруси і птахи Одноденні курчата (Merial, Gainesville, GA, USA) і пекінські качки (Metzer Farms, Gonzales, CA, USA) SPF містилися в ізольованих клітках Horsfall Baur під позитивним тиском. Корм і вода надавалися ad libitum, і птахи оглядалися двічі на день. Використаний в експериментальних дослідженнях вірус APMV-8 (APMV-8: SCWDS ID: MA-7) був ізольований з диких качок (крякв) і класифікований в National Veterinary Service Laboratory (NVSL, Ames Iowa, USA). Вірус розмножували в 9-денних зародках SPF курячих яєць шляхом інокуляції через алантоїс. Алантоїсну рідину збирали на 3 день після інокуляції, об'єднували, розділяли на аліквоти і зберігали при –80 °C. Підтип APMV-8 підтверджували в тесті HI з використанням стандартних сивороток, що надаються National Veterinary Service Laboratory (Ames, IA, USA). Доза EID 50 була визначена за допомогою інокуляції 10-разових серійних розведень алантоїсної рідини в зародки SPF яєць. Титр розраховували методом, описаним Reed and Muench (Reed & Muench, 1938). B. Експериментальне інфікування По двадцять п'ять одноденних курчат або пекінських качок SPF на групу були інфіковані окулярно-назальним шляхом 106 EID50 на кожного птаха в розчині PBS. Птахів в контрольних групах курчат і качок фіктивно інокулювали PBS. У п'яти птахів з кожної групи брали кров з плечової вени для збору зразків сироватки, птахів гуманно забивали за допомогою CO2, і проводили розтин на 2, 4, 7, 14 і 28 дні після інфікування. Брали зразки тканин трахеї, легенів, підшлункової залози і кишківника (дванадцятипалої кишки). Для кожного органу 15 UA 110328 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використовували нову пару стерильних ножиць і пінцетів. Половину зразків тканини поміщали в пробірку Lysing Matrix D tube (MP Biomedicals, Solon, OH), яка містить середовище для перенесення вірусів (1X мінімальне основне середовище, 7,5% бікарбонат натрію, 15 мМ HEPES, 1% фетальна сироватка телят, 4000 Од/мл пеніцилін, 400 мкг/мл гентаміцин, 8 мкг/мл амфотерицин B, 4000 мкг/мл стрептоміцин, 1000 мкг/мл канаміцин сульфат). Друга половина зразка тканини фіксувалася в 10-процентному забуференому формаліні і стандартно оброблялася, заливалася у віск, були отримані зрізи, які фарбували гематоксиліном і еозином (H&E). C. Виділення вірусу Зразки тканин, зібрані в Lysing Matrix D tubes (MP Biomedicals, Solon, OH, USA), були двічі ® прогомогенізовані з використанням Fastprep -24 (MP Biomedicals) в режимі 4,0 M/S протягом 20 секунд. Гомогенізовані зразки інкубували протягом 15 хв. за кімнатної температури, після чого центрифугували 20 хв. при 2000 g при 4 °C. Стерильність перевіряли після інокуляції 50 мкл отриманого супернатанту в 2 мл стерильного TPB, збагаченого 10% гідролактальбуміну, з подальшою інкубацією при 37 °C на обертальному (орбітальному) шейкері,, протягом ночі. Нестерильні зразки фільтрували через 0,45 мкм шприцеві фільтри (Whatman Inc.). Зразки зберігали при -80 °C. Виділення вірусу проводили шляхом інокуляції 0,1 мл в алантоїсну порожнину 9-денних зародків SPF курячих яєць. Після інкубації протягом трьох днів при 37,5 °C алантоїсну рідину збирали і аналізували на наявність гемаглютинуючої активності в тесті HA. D. Серологія Для виявлення вірусу в алантоїсній рідині і аналізу присутності HI антитіл в зібраних зразках сироватки використовувалися тести гемаглютинації (НА) та інгібування гемаглютинації (HI) відповідно. Тести проводили стандартними способами, використовуючи 0,8% еритроцитів курчат, ресуспендованих в PBS. Тест HI проводили методом розведення сироватки при постійному рівні антигена. Для кожного розведення сироватки використовували вісім HA одиниць вірусного антигена. Середній геометричний титр був визначений, як описано раніше (Brugh, 1978). Фігура 4 показує титри HI антитіл у SPF курчат і качок, інфікованих APMV-8. Курчата і качки 6 були інфіковані ороназально в дозі 10 EID50 APMV-8. Зразки сироватки брали на 2, 4, 7, 14, і 28 дні після інфікування і аналізували в тесті HI з антигеном APMV-8. HI титри сироватки показані в логарифмічній шкалі (log2) на лівій осі. E. Показники патогенності APMV-8 у курчат Для оцінки вірулентності APMV-8 був визначений індекс інтрацеребральної патогенності (intracerebral pathogenicity index, ICPI) згідно методу World Organization for Animal Health (OIE, 2008), запропонованому для вірусу хвороби Ньюкасла. Середній час смерті (mean dead time, MDT) для зародків курчат було визначено, як описано раніше (Swayne et al., 1998) з використанням серійного розведення APMV-8 від 10-1 до 10-8. Визначення середнього часу смерті (MDT) для зародків яєць, також як визначення індексу інтрацеребральної патогенності (ICPI), є важливою характеристикою патогенності вірусу. Що стосується MDT для зародків курчат, жоден із зародків в інокульованих яйцях не помер після 7денного періоду і, таким чином, даний ізолят APMV-8 може бути класифікований як лентогенний (з пониженою вірулентністю). Присутність вірусу була підтверджена в тесті HA з використанням алантоїсної рідини з яєць, інокульованих з розведенням 10-6. Всі курчата, інокульовані інтрацеребрально, не показали клінічних ознак за весь час спостереження, що говорить про значення ICPI, яке дорівнює нулю, що свідчить про лентогенний фенотип. F. Бустерна вакцинація APMV-8 По десять одноденних курчат SPF на групу були інфіковані окуло-назальним шляхом дозою 6 10 EID50 на птаха. Птахи з контрольної групи курчат були фіктивно інокульовані розчином PBS. Птахи були повторно інфіковані тією ж дозою на 14 день після першого інфікування. Присутність інфекційного вірусу аналізувалася на 2, 4, 7 і 14 день після першого інфікування і на 2 і 4 день після другого інфікування шляхом виділення вірусу з мазків з трахеї з використанням 9-денних зародків SPF курячих яєць. Відповідь антитіл реєстрували за титром HI в зразках сироватки, узятих в дні 0, 7 і 14 після кожної вакцинації. Для дослідження того, чи забезпечує друга імунізація стійкіший титр HI, був проведений експеримент за схемою «прайм-буст» (Фігура 5). На 7 день після першого інфікування, всі десять птахів продемонстрували HI в діапазоні від 64 до 1024 (GMT 207). На 14 день після інфікування після першого інфікування титр впав (GMT 84), але збільшився після бустерної інфекції на 14 день після першого інфікування. На 7 день після бустерної вакцинації GMT збільшився до 137 і знову знизився до GMT 73 на 14 день Після другого інфікування. Інфекційний вірус може бути ізольований з мазків з трахеї на 2 день (5/10 птахів) і на 4 день 16 UA 110328 C2 5 10 (4/10 птахів) після першого інфікування. Після другого інфікування з мазків, узятих на 2 і 4 дні після інфікування, вірус ізолювати не вдалося. G. Виявлення вірусної РНК за допомогою ЗТ-ПЛР Визначення вірусної РНК в зразках тканин проводили після гомогенізації зразків тканин і подальшого виділення РНК з використанням набору High Pure RNA isolation kit (Roche, Mannheim, Germany). При проведенні ЗТ-ПЛР використовувалася пара праймерів (8NPf1, 8NPr, дивись таблицю 1) з використанням набору Supercript III One Step RT-PCR kit з Platinum Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) відповідно до інструкцій виробника. Отримані продукти реакції аналізували в 1% агарозному гелі (Фігура 6). Тканини трахеї були узяті на 2 день після інфікування з неінфікованих качок (C1-C5) і інфікованих качок APMV-8 (I1-I5). Тканини були прогомогенізовані і РНК приготована для ЗТ-ПЛР. Паралельно був приготований контроль з водою (W). Продукти реакції розділяли в 1,5% агарозному гелі. Розмір фрагмента контролювали з використанням сходів маркерів по 100 п.о. (New England Biolabs, Boston, MA, USA). Розміри фрагментів ДНК показані справа. 15 Таблиця 1 Олігонуклеотиди, які були використані для ЗТ-ПЛР для виявлення вірусної РНК в зразках тканини Назва APMVPolyT 8NPf1 8NPr 20 25 30 35 40 45 Послідовність А SEQ ID NO Орієнтація Локалізація TTTTTTTTTTTTTTTTTTACCAAACARRGAA смислова 1-14 21 CAGGAGACCTGATGTTGCCTCAAC смислова антисмислова 200-223 22 618-642 23 GCAGGCGATCTATAGTCTCTGATAG H. Визначення мінімальної інфекційної дози для курчат і качок Для того, щоб визначити, який вірусний титр буде достатнім у курчат для виявлення сероконверсії, одноденні курчата SPF були інфіковані різними дозами APMV-8. Птахи 1 2 утримувалися, як описано вище. По десять курчат на групу були інфіковані кожен в дозі 10 ,10 , 3 4 5 6 10 , 10 , 10 або 10 EID50. Вірус розводили VTM. Одна група була інокульована VTM і використовувалася як контроль. У птахів брали кров з плечової вени на 7 і 14 день після інфікування. Виходячи з результатів, отриманих в експерименті на курчатах, триденні пекінські 3 4 5 качки були інфіковані різними кількостями вірусу. Були вибрані інфікуючі дози 10 , 10 , 10 або 6 10 EID50 на одну качку. Одна група була фіктивно інфікована VTM. У птахів брали кров із стегнової вени на 7 і 14 день після інфікування. Зразки сироватки аналізували на наявність вірус-специфічних антитіл в тесті HI як описано вище. I. Визначення патогенності у качок і курчат Під час даних експериментів у курчат і качок не спостерігалося клінічних ознак. При розтині у трьох інфікованих курчат було виявлено незначне збільшення підшлункової залози і запалення дванадцятипалої кишки на 2 і 4 день після інфікування. У всіх групах не було виявлено ніяких інших помітних поразок. Серологічну відповідь досліджували на 2, 4, 7, 14 і 28 день після інфікування шляхом визначення титрів HI в сироватці (Фігура 4). Зразки сироватки інфікованих курчат APMV-8 показали позитивні титри HI (≥ 16), починаючи з 7 дня після інфікування (5/5, GMT: 111), 14 дня після інфікування. (5/5, GMT: 48), і 28 дня після інфікування (5/5, GMT: 48). Зразки сироватки інфікованих качок APMV-8 також показали позитивні титри HI (≥ 16) в дні 7 (5/5, GMT 21), 14 (5/5, GMT 28) і 28 (4/5, GMT 14) після інфікування. Діапазон титрів HI для курчат склав від 32 до 256, тоді як для качок діапазон був від 16 до 64. Фіктивно інокульовані птахи обох видів залишалися негативними на наявність HI антитіл проти APMV-8 у всіх тимчасових точках дослідження. Для визначення ділянок розмноження вірусу у курчат і качок було проаналізовано декілька органів (трахея, легені, дванадцятипала кишка і підшлункова залоза) на наявність інфекційного вірусу шляхом виділення вірусу із зародків яєць (Фігура 7). У курчат APMV-8 був отриманий на 2 день після інфікування з трахеї, легенів і дванадцятипалої кишки. На 4 день після інфікування APMV-8 був виділений зі всіх проаналізованих органів, тоді як на 7 день після інфікування APMV-8 був виділений тільки з підшлункової залози. На 14 і 28 день після інфікування ні з одного органу вірус виділити не вдалося. З фіктивно інокульованих птахів вірус виділити не 17 UA 110328 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вдалося. Ідентичність повторно виділеного вірусу була підтверджена в тесті HI з використанням стандартної сироватки, NVSL, що пропонується. Ні з однієї зібраної тканини качок не було виділено вірусу ні в один з моментів часу навіть після двох субпасажів в 9-денні зародки SPF курячих яєць. Таким чином, були проведений дизайн праймерів на основі доступної інформації про послідовність APMV-8 для виявлення присутності вірусної РНК в зібраних зразках тканин (Фігура 7). На 2 день після інфікування вірусна РНК була виявлена в трахеї (Фігура 6), кишківнику і підшлунковій залозі, тоді як на 4 день після інфікування вірусна РНК була виявлена у всіх проаналізованих органах. На 7, 14 і 28 день після інфікування вірусна РНК була виявлена тільки в трахеї і легенях. ЗТ-ПЛР з використанням РНК, отриманої з органів фіктивно інокульованих птахів, не привела до ампліфікації ЗТ-ПЛР фрагмента, що говорить про відсутність APMV-8 у цих птахів. Для оцінки патологічного потенціалу досліджуваного вірусу органи були проаналізовані на наявність мікроскопічних пошкоджень (Фігура 8). На 2 день після інфікування у всіх інфікованих курчат був виявлений слабкий багатоосередковий проліферативний трахеїт. У решті органів не було виявлено відмінностей від контрольної групи. Інфіковані курчата APMV-8 продемонстрували фокальне відновлення або регенерацію респіраторного епітелію в трахеї на 4 день після інфікування, що указує на одужання. Крім того, ці птахи також демонстрували слабкий багатоосередковий лімфоцитарний панкреатит, що указує на вірусну інфекцію. Інфіковані курчата демонстрували зміни в легенів на 7 день після інфікування, такі як від помірного до важкого BALT, зміни в трахеї, такі як катаральний трахеїт, і багатоосередковий лімфоцитарний панкреатит. Ці спостереження також узгоджуються з антигенною стимуляцією. На 14 день після інфікування у інфікованих курчат спостерігалися зміни в трахеї, які свідчать про одужання, і зміни в підшлунковій залозі, такі як лімфоцитарний панкреатит, що дозволяють зробити висновок про вірусну інфекцію. На 28 день після інфікування спостерігалися тільки слабкий катаральний трахеїт і слабкий ентерит у деяких інфікованих курчат. У інфікованих качок спостерігалися багатоосередковий слабкий лімфоцитарний трахеїт, зміни в легенях (інтерстиціальна пневмонія) і зміни в кишківнику (лімфоцитарний ентерит) на 2 день після інфікування, тоді як зміни в трахеї, які свідчать про респіраторну інфекцію, спостерігались на 4 день після інфікування. На 7 день після інфікування у інфікованих качок спостерігалися лімфоцитарний трахеїт і панкреатит, які свідчать про вірусну інфекцію, тоді як катаральний трахеїт, який спостерігався на 14 день після інфікування дозволяв зробити висновок про одужання. Крім того, інфіковані качки демонстрували лімфоцитарний панкреатит на 14 день після інфікування. Пізніше, на 28 день після інфікування у інфікованих качок в легенях була відмічена гіперплазія BALT і також слабкий багатоосередковий нейтрофільний трахеїт. Обидва патологічні мікроскопічні ураження свідчили про вірусну інфекцію. У неінфікованих контрольних птахів не спостерігалося ніяких змін в досліджуваних органах. J. Визначення мінімальної дози, необхідної для індукції імунної відповіді Для визначення мінімальної інфекційної дози, яка необхідна для індукції сероконверсії у курчат, для інфікування десяти одноденних курчат SPF використовувалися десятиразові розведення APMV-8 (Фігура 9). Для тесту HI використовували 4 одиниці HA, внаслідок чого поріг, який дорівнював 16, розглядався як позитивний. Зразки сироватки, узяті на 14 день після 3 інфікування, показали, що доза EID50, яка становить 10 , була достатньою для індукції імунної відповіді у 4/10 курчат, що розглядалося як позитивний результат (GMT 11). На 14 день після 4 інфікування дозою EID50 10 дев'ять з десяти птахів показали титр ≥16 (GMT 34). Інфікування 5 6 дозами EID50 10 і 10 індукувало титр HI ≥16 на 14 день після інфікування у всіх птахів з GMT 73 і 137 відповідно. Виходячи з даних результатів в кожній групі були інфіковані APMV-8 по 8 качок, починаючи з 3 6 дози EID50 10 на птаха до дози EID50 10 на птаха (Фігура 10). Шість з восьми качок показали значні титри (≥16) через 14 днів після інфікування з GMT 14 при інфікуванні дозою EID 50 4 5 10 /птаха. На 14 день після інфікування 6/8 качок, інфікованих дозою EID 50 10 /птаха, і 7/8 качок, 6 інфікованих дозою EID50 10 /птаха, показали значні титри (≥16) з GMT 17 і 23 відповідно. Приклад 3. Визначення повнорозмірної послідовності APMV-8 Для визначення повнорозмірної послідовності APMV-8 спочатку необхідна інформація про послідовність вірусної РНК. Для цього був клонований 3’-кінець вірусного геному з використанням праймера (APMV-polyT, дивися таблицю 1), який містив вироджену послідовність, засновану на доступних 3’-послідовностях APMV1 (Genbank accession No. AF077761), APMV-2 (Genbank accession No. EU338414), і APMV-6 (Genbank accession No. EF569970). Вірусна РНК була очищена з алантоїсної рідини з використанням набору High Pure RNA isolation kit (Roche, Mannheim, Germany). Дана послідовність була ампліфікована з використанням 5′ RACE System для швидкої ампліфікації кінців кДНК Version 2.0 (Invitrogen) 18 UA 110328 C2 5 10 15 20 25 відповідно до інструкцій виробника. Було отримано декілька фрагментів, які елюювали з гелю і клонували у вектор для клонування Topo TA (Invitrogen), після чого позитивні клони, відібрані в результаті селекції, були просеквеновані. Отримані нуклеотидні послідовності були проаналізовані з використанням програми nblast search за базою даних NCBI, що не виявило схожості. Аналіз tblastx search за базою даних NCBI показав схожість на 83% з нуклеопротеїном з параміксовірусу 2 птахів (APMV-2/Chicken/California/Yucaipa/56, Genbank accession № EU338414) і схожість на 56% з штамом параміксовірусу 6 птахів (APMV6/Goose/FarEast/4440/2003, Genbank accession № EF569970). З використанням цього праймера був застосований метод блукаючого праймера з використанням 5′ RACE System для швидкої ампліфікації кінців кДНК Version 2.0 (Invitrogen). При проведенні 5’-RACE був отриманий фрагмент розміром приблизно 800 п.о. З використанням цього методу була отримана нова інформація про послідовність на основі інформації про послідовність з попередніх послідовностей, яка була використана для створення нових олігонуклеотидів. 5’-кінець вірусного геному був також визначений методом 5’-RACE. 3’-кінець вірусного геному був отриманий після лігування РНК з використанням T4 РНК-лігази 1 (New England Biolabs). Продукт реакції лігування був знову очищений з використанням набору High Pure RNA isolation kit (Roche) і була проведена ЗТ-ПЛР з використанням набору Superscript III One Step RT-PCR kit з Platinum Taq (Invitrogen). Отриманий фрагмент кДНК було клоновано у вектор pCR2.1 (Invitrogen) і секвеновано. Три плазміди з кожного клонованого фрагмента були просеквеновані в обох напрямах, внаслідок чого кожен нуклеотид в послідовності був прочитаний 6 разів. Повнорозмірна послідовність геному аналізованого штаму APMV-8 склала 15342 нуклеотиди, що узгоджується з «правилом шести» (Calain, P. & Roux, L., 1993) для Paramyxovirinae. Було виявлено шість відкритих рамок зчитування (ORF), які кодують білки. Порядок білків був визначений як 3’-NP-P-M-F-HN-L-5’ (послідовність геному SEQ ID NO:1 є антигеномом (антисмисловий) і має напрямок від 5’ до 3’) з використанням подібності білкових послідовностей з білками інших параміксовірусів птахів. Передбачувані старт- і стоп-кодони у відкритих рамках зчитування і теоретична молекулярна вага білків (сайт Swiss Institute of Bioinformatics ExPASy) показані в таблиці 2. Таблиця 2 Параметри білків, які кодуються послідовністю APMV-8 Білок Старт кодон Стоп кодон Нуклеопротеїн (NP) Фосфопротеїн (P) Матрікспротеїн (M) Ф’юженпротеїн (F) Гемаглютинін/нейрамінідаза (HN) 141-143 1693-1695 3076-3078 4499-4501 6383-6385 8273-8275 або 8297-8299 1524-1526 2908-2910 4193-4195 6128-6130 8114-8116 Полімераза (L) 15011-15013 Теоретична молекулярна вага (кДа) 51,2 43,5 40,6 58,5 63,5 254,6 253,6 30 35 40 Передбачувані геноми лідерні і трейлерні послідовності були визначені шляхом визначення передбачуваного початку гена для гена NP (лідер) і передбачуваної послідовності кінця гена білка L (трейлер). Лідерна послідовність розташовується від нуклеотида 1 до нуклеотида 55. Передбачувана послідовність початку гена (нуклеотиди 56-63) гена NP завершує лідерну послідовність. Трейлерна послідовність локалізована позаду послідовності кінця останнього гена у вірусному геномі. Із-за наявності двох можливих послідовностей кінця гена для гена РНК полімерази (нуклеотиди 15161-15171 або 15288 -15297) були ідентифіковані дві передбачувані трейлерні послідовності (нуклеотиди 15172-15342 або 15289-15342). Локалізація передбачуваних послідовностей початку генів (послідовності, які містять полі-G) і послідовностей кінців генів (сигнальна послідовність для поліаденілювання) і міжгенні послідовності показані в таблиці 3. 19 UA 110328 C2 Таблиця 3 Послідовності і розташування передбачуваних початкових ділянок генів, міжгенних ділянок і кінців генів в послідовності APMV-8 Ген Нуклеопротеїн Фосфопротеїн Матрікспротеїн Фьюженпротеїн Гемаглютинін/нейрамінідаза РНК полімераза Початок гена 56-63 1628-1635 3032-3039 4442-4449 6279-6287 8275-8283 Кінець гена 1615-1625 2991-3001 4404-4416 6260-6271 8261-8273 15161-15171 або 15288-15297 міжгенні ділянки 1626-1627 3002-3031 4417-4441 6272-6278 8274-8275 Таблиця 4 SEQ ID NO для послідовностей ДНК і білків. SEQ ID NO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 5 Назва гена APMV-8 послідовність геному APMV-8 нуклеопротеїн (NP) APMV-8 нуклеопротеїн (NP) APMV-8 фосфопротеїн (P) APMV-8 фосфопротеїн (P) APMV-8 матрікспротеїн (M) APMV-8 матрікспротеїн (M) APMV-8 ф’юженпротеїн (F) APMV-8 ф’юженпротеїн (F) APMV-8 гемаглютинін/нейрамінідаза (HN) APMV-8 гемаглютинін/нейрамінідаза (HN) APMV-8 полімераза (L) ДНК APMV-8 полімераза (L) білок 1 APMV-8 полімераза (L) білок 2 Тип ДНК або РНК ДНК або РНК Білок ДНК або РНК Білок ДНК або РНК Білок ДНК або РНК Білок ДНК або РНК Білок ДНК або РНК Білок Білок Передбачувані послідовності початкових ділянок генів для APMV-8 були консервативними і містили полі-(С)5 послідовність, розташовану перед послідовністю 3’-GCU-5’. Єдиним виключенням є передбачувана послідовність початку гена для вірусної РНК-полімерази (3’CUCCCGCU-5’). Передбачувані послідовності кінців генів були також консервативними і містили полі-(U)6 послідовність на 5’-послідовності геному вірусу (таблиця 5). Таблиця 5 Послідовності початкових ділянок генів і кінців генів в APMV-8 Назвагена Початок гена Кінець гена NP ген P ген M ген F ген HN ген L NP ген P ген M ген F ген HN ген Послідовності (5-3’ орієнтація антигеному (антисмислова)) CCCCCGCUUCUGUCA CCCCCGCUGGAGUUA CCCCCGCUUCUGUGC CCCCCGCUUUAGAAC CCCCCGCUGGGUAAA CUCCCGCUGGAGAUG AACUAAAUUCUUUUUU UAACUAAUUCUUUUUU AGGAUUAAUAUUUUUU CUAUAAAUUAUUUUUU UACUUAAUUCUUUUUU 20 SEQ ID NO 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 UA 110328 C2 Продовження таблиці 5 Послідовності (5-3’ орієнтація антигеному (антисмислова)) ACUAAAAUUCUUUUUU UUAUUGAUUUUUUUUU Назва гена L ген (1) L ген (2) 5 10 15 20 25 SEQ ID NO 35 36 Ці послідовності були передбачені виходячи з послідовностей, які були описані для інших параміксовірусів з роду Avulavirus (Chang et al., 2001, Nayak et al, 2008, Jeon et al., 2008). Існують два можливі стартові кодони для відкритої рамки зчитування (ORF) РНК полімерази. Перший стартовий кодон (нуклеотиди 8273-8275) локалізований на ділянці кінець гена міжгенна ділянка - початок гена між ORF HN і ORF вірусною РНК полімерази. Це робить цей стартовий кодон маловірогідним, але не неможливим. Другий стартовий кодон (8297 -8299) розташований нижче від ділянки кінець гена - міжгенна ділянка - початок гена і може працювати як ініціюючий кодон, для початку трансляції РНК-полімерази APMV-8. Геном APMV-8 має довжину 15342 нуклеотида. Це більше, ніж APMV-1 (SQ ID NO:15, 15186 нуклеотидів, de Leeuw & Peeters, 1999), APMV-2 (SEQ ID NO:16, 14,904 нуклеотида, Subbiah et al., 2008) і APMV-4 (SEQ ID NO:18, 15054 нуклеотида, Nayak et al., 2008), і менше ніж APMV-3 (SEQ ID NO:17, 16,272 нуклеотида, Kumar et al., 2008) і APMV-9 (SEQ ID NO:20, 15,438 нуклеотидів, Samuel et al., 2009). Довжина лідерної послідовності, яка складається з 55 нуклеотидів, ймовірно, є консервативною для всіх APMV (Krishnamurthy & Samal, 1998, de Leeuw & Peeters, 1999, Subbiah et al., 2008, Nayak et al., 2008, Kumar et al., 2008, Samuel et al., 2009), тоді як трейлерна послідовність, мабуть, є варіабельною щодо її довжини. Послідовності початку генів і кінця генів вірусних генів також були висококонсервативними для APMV-8 (як показано в таблиці 5). Це також описано для послідовностей APMV-2 (Subbiah et al, 2008), APMV-3 (Kumar et al, 2008), APMV-4 (Jeon et al., 2008, Nayak et al, 2008), APMV-6 (Chang et al, 2001), і недавно для APMV-9 (Samuel et al., 2009). Число нуклеотидів в повнорозмірній послідовності кратне шести, що узгоджується з «правилом шести» для геномів параміксовірусів (Kolakofsky et al., 1998). Ідентичність послідовностей між послідовностями геномів APMV-1, 2, 3, 4, 6, 8 і 9 показана в таблиці 6. Таблиця 6 Відсоток ідентичності послідовності між геномами APMV-1, 2, 3, 4, 6, 7, 8 і 9 APMV 8 30 35 40 1 SEQ ID NO 1 2 3 4 6 7 8 8 8 8 9 15 16 17 18 19 20 1 37 38 39 40 48 61 47,2 47,6 52 53 100 99,1 96,5 96,4 48 Відсоток ідентичності послідовностей між двома послідовностями нуклеїнових кислот або поліпептидів визначається з використанням програми Vector NTI 11.0 (РС) software package (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA). Для визначення відсотка ідентичності двох нуклеїнових кислот використовуються gap opening penalty 15 і gap extension penalty 6,66. Для визначення відсотка ідентичності двох поліпептидів використовуються gap opening penalty 10 і gap extension penalty 0,1. Відсоток ідентичності розраховується на основі коротшої послідовності. Приклад 4. Вакцинація одноденних курчат-бройлерів штамом APMV-8 Двадцять одноденних курчат було розділено на дві групи, як показано нижче в таблиці 7. У 1 день у одноденних курчат брали кров для визначення статусу антитіл проти вірусу хвороби Ньюкасла (NDV) і APMV-8 з використанням визначення інгібування гемаглютинації (тест HI). Тест проводили з використанням алантоїсної рідини з SPF яєць, інфікованих або штамом Lasota NDV, або APMV-8. Для тесту HI використовували чотири HA одиниці штаму Lasota NDV або APMV-8 і 1% еритроцитів курчат. Отримані титри HI показують, що сироватка курчат містила HI антитіла проти NDV, але не містила таких кількостей антитіл проти вірусу APMV-8 які б було можливо визначити. 45 21 UA 110328 C2 Таблиця 7 Інфікування/вакцинація одноденних курчат-бройлерів Обробка День 1: вакцинація штамом APMV-8 День 14: HI тест День 14: друга вакцинація штамом APMV-8 (бустер) День 28: HI тест Група 1 (десять одноденних курчат) Група 2 (контроль) (десять одноденних курчат) Так Немає Так 5 курчат (група 1-1): друга вакцинація/ перша вакцинація. 5 курчат (група 1-2): без другої вакцинації/ перша вакцинація Так Так 5 курчат (група 2-1): друга вакцинація 5 курчат (група 2-2): не вакцинували Так 6 5 10 15 20 25 30 35 40 У 1 день група 1 з 10 курчат була інфікована через ніс в дозі 10 EID50 штамом APMV-8, група 2 з 10 курчат не була інфікована і виконувала роль контролю. Через 14 днів після інфікування (день 14) у курчат відбирали кров, і отримані зразки сироватки знову аналізували на наявність HI антитіл проти NDV і APMV-8 (Фігура 20). Результати показали, що вакциновані курчата APMV-8 показують HI титри з використанням APMV-8 як антигенів. Специфічні до APMV-8 HI тири були між 128 і 2048. Титри HI проти NDV знижувалися до HI титру нижче 16, отже, вони не розглядалися як NDV-позитивні. Результати показали, що курчата, які отримали від матері антитіла проти NDV, не уникали інфікування APMV-8, таким чином, інтерференція таких антитіл з вакцинацією APMV-8 є маловірогідною. Через 14 днів після інфікування (14 день) курчата в групі 1 і групі 2 були розділені. По п'ять 6 курчат з групи 1 (група 1-1) і з групи 2 (група 2-1) були знову інфіковані дозою 10 EID50 штамом APMV-8 (таблиця 7), а решта п'ять курчат в кожній групі (група 1-2 і група 2-2) інфіковані не були. Цей експеримент був проведений для того, щоб дослідити, чи буде пізніше зараження впливати на інфекцію, і чи буде друге інфікування (бустер-вакцинація) збільшувати титр антитіл. Через чотирнадцять днів (день 28) у всіх курчат знову відбирали кров, і досліджували сироватку на наявність антитіл проти APMV-8 і NDV. Титри сироватки (Фігура 21) показали, що перша вакцинація на 14 день (група 2-1) індукувала титри специфічних антитіл проти APMV-8, які знаходяться в діапазоні від 32 до 512. У курчат, вакцинованих тільки у 1 день (група 1-2), титри антитіл впали до рівня між 128 і 512. У курчат, які були вакциновані у 1 і на 14 день день(група 1-1), титр антитіл, специфічних для APMV-8, не збільшився, що дозволяє припускати, що використаний для другої вакцинації вірус був нейтралізований антитілами, специфічними для APMV-8, які індукуються першою інфекцією. Сироватка невакцинованих контрольних курчат (група 2-2) не містила HI антитіл, специфічних для APMV-8. На 28 день вміст антитіл проти NDV знизився ще більше, тільки 11 курчат з 20 показали які-небудь титри HI з антигеном NDV, тоді як на 14 день чотирнадцять курчат демонстрували низькі титри антитіл проти NDV. Приклад 5. In ovo вакцинація зародків SPF яєць Це дослідження було проведене з метою з'ясувати, чи буде вакцинація з APMV-8 in ovo призводити до відповіді антитіл у курчат, і чи буде вакцинація in ovo впливати на їх відсоток викльовування з яєць і життєздатність. У дослідженні 1, 108 SPF яєць були вакциновані in ovo вірусом штаму APMV-8 з використанням INOVOJECT (Pfizer Animal Health, NY, USA) на 18 день інкубації. Вірус був розведений стерильним 0,9% розчином NaCl. Зворотне титрування розведеного вірусу 5,5 показало титр 10 EID50 /100 мкл. Для контролю 108 яєць інокулювали стерильним 0,9% розчином NaCl. Об'єм введення склав 100 мкл на одне яйце. У контрольній групі вилупилося вісімдесят курчат, а у вакцинованій групі APMV-8 вилупилося сорок п'ять курчат. По десять курчат з кожної групи пересадили в окремі клітки Horsefall-Bauer. Крім того, курчата з вакцинованої групи APMV-8 і п'ять курчат з контрольної групи були посаджені разом в одну клітку Horsefall-Bauer для перевірки можливості передачі APMV-8 після вакцинації. Вода і корм задавалися ad libitum. Через чотирнадцять і через двадцять вісім днів після вилуплення були узяті зразки крові і протестовані на присутність HI антитіл проти APMV-8 з використанням 4 одиниць HA і 1% розчину еритроцитів курчат. Результати (Фігура 22) показали, що вакцинація in ovo на 18 день інкубації яєць викликає імунну відповідь, на що указує присутність титрів HI в 22 UA 110328 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 протестованих зразках сироватки. Через чотирнадцять днів після вилуплення спостерігалися титри HI від 256 до 4048 у групи, вакцинованої in ovo. У сироватці контрольних курчат, які контактували з вакцинованими курчатами, через 14 днів після початку контакту спостерігалися HI титри від 256 до 2048, що говорить про поширення вірусу, який застосовувався для вакцинації. У контрольній групі не було виявлено HI титру, специфічного для APMV-8. Ще через чотирнадцять днів у курчат знову брали кров, в якій були виявлені титри від 256 до 4096 у вакцинованій групі APMV-8 і від 256 до 1024 в групі, яка контактувала з вакцинованими курчатами APMV-8. У контрольній групі HI антитіл проти APMV-8 виявлено не було. У дослідженні 2, 88 SPF (вільних від специфічного антигена) яєць були вакциновані in ovo з використанням INOVOJECT на 19 день інкубації. Штам вірусу APMV-8 був розведений стерильним 0,9% розчином NaCl. Титр вірусу склав 105,75 EID 50 /100 мкл, як показало зворотне титрування розведеного вірусу. Як контроль 88 SPF яєць інокулювали стерильним 0,9% розчином NaCl. Об'єм введення склав 100 мкл на одне яйце. У контрольній групі (NaCl) вилупилися сімдесят чотири курчата, а в групі, вакцинованій APMV-8, вилупилося сімдесят шість курчат. По десять курчат з кожної групи пересадили в окремі клітки Horsefall-Bauer. Вода і корм задавалися ad libitum. Через чотирнадцять днів після вилуплення були узяті зразки крові і протестовані на присутність HI антитіл проти APMV-8 з використанням 4 одиниць HA і 1% розчину еритроцитів курчат. Результати (Фігура 23) показали, що вакцинація in ovo на 19 день інкубації яєць приводить до імунної відповіді з HI титрами, специфічними для APMV-8. Через чотирнадцять днів після вилуплення в групі, вакцинованій APMV-8 in ovo, спостерігався титр HI від 256 до 4048. У контрольній групі не спостерігалося якого-небудь титру, специфічного для APMV-8. На 28 день після вилуплення у курчат знову була узята кров. Титри HI в групі, вакцинованій APMV-8, склали від 512 до 4096 (Фігура 23), тоді як сироватка контрольних курчат все ще залишалася негативною щодо APMV-8. У третьому дослідженні по 108 SPF яєць в групі 1 і групі 2 були вакциновані in ovo з 3,5 4,5 використанням INOVOJECT на 18 день інкубації в дозах 10 EID50 і 10 EID50 відповідно. Штам вірусу APMV-8 був розведений стерильним 0,9% розчином NaCl. У третій контрольній групі 108 SPF яєць були інокульовані стерильним 0,9% розчином NaCl. У групі 1 вивелися вісімдесят три курчати, в групі 2 вивелося сімдесят дев'ять курчат, і в групі 3 вивелося вісімдесят вісім курчат (дивися таблицю 8). Після вилуплення по десять курчат з кожної групи пересадили в окремі клітки Horsefall-Bauer. Вода і корм надавалися ad libitum. Після вилуплення десять курчат з 6 групи 3 були вакциновані підшкірно в шию з використанням 100 мкл 10 EID50 вірусу APMV-8. Через чотирнадцять днів після вилуплення були узяті зразки крові і протестовані на наявність HI антитіл проти APMV-8 з використанням 4 одиниць HA і 1% розчину еритроцитів курчат. Результати (Фігура 24) показали, що вакцинація in ovo на 18 день інкубації призводить до імунної відповіді з титрами HI, специфічними для APMV-8. Через 14 днів після вилуплення у групи, вакцинованої in ovo вірусом APMV-8, спостерігалися титри HI від 4096 до 16384. У контрольній групі титру HI антитіл, специфічних для APMV-8, виявлено не було. Група, вакцинована APMV-8 підшкірно, показала сероконверсію з титром в діапазоні від 64 до 4096. На 28 день після вилуплення у курчат знову відібрали кров і тестували на наявність HI антитіл, специфічних для APMV-8. Титри HI через чотири тижні після вилуплення знизилися і знаходилися в діапазоні від 512 до 4096. У контрольній групі не було виявлено титру HI, специфічного для APMV-8. Титр HI в групі, яка була вакцинована підшкірно, знаходився в діапазоні від 32 до 256. 45 Таблиця 8 SPF яйця Курчата, що вилупилися Вакцинація з APMV-8 на 18 день інкубації 50 Група 1 108 83 3,5 10 EID50 100 мкл на 1 яйце Група 2 108 79 4,5 10 EID50 100 мкл на 1 яйце Група 3 (контроль) 108 88 0,9% стерильний розчин NaCl Приклад 6. Розробка системи зворотної генетики для штаму APMV-8 і створення мутантів APMV-8, які експресують гетерологічні гени Конструювання і експресія плазмід, які містять гени NP, P, і L вірусу APMV-8 Для створення зворотної генетичної системи для параміксовірусів необхідне створення плазмід, які експресують білки, які беруть участь в реплікації вірусної РНК. Відкриті рамки зчитування (ORF) для трьох білків APMV-8 (нуклеопротеїн NP, фосфопротеїн P, білок РНКзалежної РНК-полімерази або білок L) були клоновані в еукаріотичний експресійний вектор 23 UA 110328 C2 5 10 pcDNA3 (Invitrogen, California, USA). Для цього РНК з алантоїсної рідини, яка містить APMV-8, була очищена з використанням набору High Pure RNA Isolation Kit (Roche, Basel, Switzerland). Очищена РНК була використана для зворотної транскрипції в полімеразній ланцюговій реакції ЗТ-ПЛР з використанням набору Titan One Tube RT-PCR Kit (Roche). Відкриті рамки зчитування білків були ампліфіковані з використанням відповідних пар праймерів [NP (NP-FP, NP-RP), P (PFP, P-RP), L (L-FP, L-RP), дивися таблицю 9]. Продукти реакції розділяли в 0,7% агарозному гелі і елюювали з гелю з використанням набору QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany) відповідно до інструкцій виробника. Фрагменти, отримані за допомогою ЗТ-ПЛР, інкубували з відповідними ферментами рестрикції (NP і P з Eco RI/NotI; L з Kpn I/NotI), знову елюювали з гелю і лігували в еукаріотичний експресійний вектор pcDNA3, розщеплений відповідними ферментами рестрикції. Клітини Top10F (Invitrogen) трансформували продуктами реакції лігування в, і плазмідну ДНК, виділену з клітин Top10F, розщеплювали відповідними ферментами рестрикції (дивися вище). Плазміди, які містять фрагменти ДНК (pcDNA-NP, pcDNA-P, pcDNA-L) потрібного розміру, секвенували. 15 Таблиця 9 Праймери для ампліфікації генів для білків РНП комплексів Назва праймера Послідовність праймера a Орієнтація b Полос ження SEQ ID NO: Eco RI ccGAATTC ATGTCATCTGTGTTCAATGAGTATCAGG смисловий 141-168 41 Not I ccGCGGCCGCTTACCATTCTAGCCCGTTCTCGTATG анти1501-1526 смисловий 42 Eco RI ccGAATTCATGGATTTCGCCAATGATGAAG смисловий 1693-1714 43 Not I P-RPантиccGCGGCCGCTTACGCATTATATATTGCCTGCTTGACTCG 2881-2910 pc3 смисловий 44 NP-FPpc3 NP-RPpc3 P-FPpc3 L-FPpc3 L-RPpc3 20 25 30 35 Kpn I ccGGTACCATGGATATAAAACAAGTTGACCTG Not I ccGCGGCCGCTTATTTCAACTTGATGATTGCACCG смисловий 8292-8320 45 антисмисловий 46 1498915013 а Послідовність праймера містить сайти для розщеплювання ферментом рестрикції, що використовуються для клонування. Сайти рестрикції вказані і виділені жирним шрифтом. Старт і стоп кодони виділені курсивом. Вірус-специфічні послідовності підкреслені. b Орієнтація послідовності праймерів дана відповідно до вірусної інформаційної РНК. с Показано положення вірус-специфічних послідовностей в повнорозмірному геномі вірусу. Конструювання плазміди, яка містить повнорозмірний геном APMV-8 Для створення плазміди, яка містить повнорозмірний геном APMV-8, була синтезована кДНК геному вірусу (Genscript, New York, USA) на основі створених консенсусних послідовностей з двох різних частин (5’-FLG, 3’-FLG, дивися Фігуру 25). 5’-частина (5’-FLG, SEQ ID NO:47) вірусної послідовності була синтезована з нуклеотидів 1-5564. Попередня послідовність APMV-8 є послідовністю касети, яка складається з промотору CMV-IE, розташованої за ним послідовності для розщеплювання ферментом рестрикції XMAI (для можливих подальших процедур клонування) і послідовності «хамерхед» рібозиму (у вигляді головки молотка, hammerhead ribozyme). На 5’-кінці і 3’-кінці даної послідовності були додані сайти для розщеплювання ферментами рестрикції Not I і SACII відповідно. Синтезована 3’-частина (3’-FLG, SEQ ID NO:48) послідовності (нуклеотиди 5503-15342) завершувалася послідовністю рібозиму гепатиту дельта і полі-А сигнальною послідовністю гормону росту бика. Для цілей клонування на 5’-кінець 3’-FLG була додана послідовність для розщеплювання ферментом рестрикції Not I, і на 3’-кінці послідовності була додана послідовність для розщеплювання ферментом рестрикції Sac II. 24 UA 110328 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В межах частин 5’-FLG і 3’-FLG (нуклеотиди 5503-5564), які перекриваються, знаходилася послідовність для унікального ферменту рестрикції (Bmt I), який розщеплює послідовність по нуклеотиду 5541 повнорозмірної послідовності. Обидві частини ДНК (5’-FLG, 3’-FLG) лігували окремо в плазміду pUC57 (Genscript) з отриманням плазмід pUC57/5’-FLG і pUC57/3’-FLG. Для клонування разом обох фрагментів pUC57/5’-FLG була розщеплена ферментами BmtI і Sac II і плазміда, яка містить5’-FLG, була елюйована з гелю. Паралельно pUC57/3’-FLG була розщеплена тими ж ферментами і фрагменти 3’-FLG були елюйовані з гелю. Потім 3’-FLG лігував в плазміду, яка містить 5’-FLG, для отримання плазміди, яка містить повнорозмірну послідовність кДНК геному APMV-8 під контролем промотору CMV-IE (pUC57-FL-APMV-8). Конструювання плазміди, яка містить мінігеном APMV-8 Плазміда, яка містить всі функціональні елементи мінігеному для APMV-8 (pMG-APMV-8), була сконструйована з використанням методу, описаного Conzelmann, et al. (J Virol. 68:713-719, 1994). Плазміда pMG-APMV-8 містить трейлерну і лідерну ділянку геному APMV-8, яку фланкували промотором Т7 і послідовністю рібозиму антигеному вірусу гепатиту дельта (Collins, et al., PNAS USA 88:9663-9667, 1991). Після послідовності рібозиму антигеному вірусу гепатиту дельта розташовується послідовність термінатора транскрипції Т7. Між трейлерною і лідерною ділянками розміщена кодуюча послідовність посиленого зеленого флуоресцентного білка в антисмисловій орієнтації. Перед трейлерною послідовністю і відразу за промотором T7 розташовуються три додаткові залишки G. Вставка була фланкірувана сайтами розщеплювання ферментів рестрикції Eco RI і Not I і була клонована по тупих кінцях в плазміду pUC57. Ця конструкція була субклонована в плазміду pUC18. Для цього плазміда pMG-APMV-8 була розщеплена ферментами Eco RI і Hind III і потрібний фрагмент був елюйований з гелю і ліговано в розщеплену відповідним чином плазміду pUC18 для отримання плазміди puC18-MGAPMV-8. Наявність вставки була підтверджена секвенуванням. Створення експресійної плазміди, яка забезпечує експресію T7-полімерази Для створення плазміди, яка кодує T7 ДНК-залежну РНК-полімеразу (T7 полімеразу) кодуюча послідовність (GenBank accession number AY264778) була синтезована з використанням Genscript. Послідовність Т7-полімерази (SEQ ID NO:49) була модифікована для оптимізації кодонів, які використовувались для експресії в еукаріотичній системі, і для видалення можливих донорних/акцепторних ділянок сплайсингу в послідовності. Послідовність, яка кодує Т7-полімеразу, була фланкована сайтами для EcoRI (5’) і NotI (3’). Синтезований фрагмент був клонований по тупих кінцях у вектор pUC57 (pCU57-T7). Ця плазміда була розщеплена ферментами EcoRI/NotI і фрагмент, який кодує Т7-полімеразу був елюйований з гелю. Потім даний фрагмент був клонований в еукаріотичний експресійний вектор pcDNA3 (Invitrogen) для отримання pcDNA3-T7. Наявність фрагмента у векторі pcDNA3-T7 була підтверджена секвенуванням. Створення плазміди для експресії посиленого зеленого флуоресцентного білка з використанням внутрішнього сайту скріплення рибосоми під контролем промотору T7 Для тестування функціональної активності Т7-полімерази методом ПЛР була ампліфікована відкрита рамка зчитування посиленого зеленого флуоресцентного білка (EGFP) з використанням плазміди pEGFP-N1 (Clontech, California,USA) і наступної пари праймерів: EGFP-FP (CCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG) SEQ ID NO:50 і EGFP-RP (CCGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG) SEQ ID NO:51 Отриманий ПЛР-фрагмент був елюйований з гелю і проінкубований з ферментами рестрикції BamHI і NotI. Продукт реакції було елюйовано з гелю і ліговано у відповідним чином розщеплений вектор pCITE 4A (Novagen). Отримана плазміда (pCITE4A-EGFP) була використана в подальших експериментах. Плазміди pCITE4A-EGFP і pcDNA3-T7 були трансфіковані окремо або разом в клітинну лінію курей DF1, яка культивувалась в 24-коміркових планшетах, з використанням Lipofectin 2000 (Invitrogen). Через двадцять чотири години після трансфекції середовище видаляли і додавали стерильний фосфатний буферний розчин (PBS). Клітини досліджували з використанням інвертованого флуоресцентного мікроскопа Axiovert 40 CFL (Zeiss, Jena, Germany). Зелена флуоресценція спостерігалася тільки в комірках планшета з культурою клітин, які були одночасно трансфіковані обома плазмідами. Результати говорять про те, що обидві плазміди, pCITE4A-EGFP і pcDNA3-T7, були функціонально активними. Підтвердження функціональної активності вірусних білків NP, P і L, експресованих з використанням мінігеному плазміди Клітини DF1 були котрансфіковані pcDNA3-T7, pUC18-MG-APMV-8, pcDNA-NP, pcDNA-P і pcDNA-L для підтвердження функціональної активності експресованих білків NP, P і L. Через двадцять чотири години після трансфекції середовище видаляли і додавали стерильний розчин фосфатного буфера (PBS). Клітини досліджували з використанням інвертованого 25 UA 110328 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 флуоресцентного мікроскопа Axiovert 40 CFL (Zeiss, Jena, Germany). Зелена флуоресценція спостерігалася тільки в комірках планшета з культурою клітин, які були трансфіковані всіма 5 плазмідами. Ці результати указують, що експресовані вірусні білки NP, P і L були функціонально активними і забезпечували транскрипцію мінігеному APMV-8 в мРНК і експресії білка EGFP, кодованого pUC18-MG-APMV-8. Відновлення вірусу AMPV8 з плазміди, яка містить повнорозмірну послідовність APMV-8 Клітини DF1 були котрансфіковані pUC57-FL-APMV-8, pcDNA-NP, pcDNA-P, і pcDNA-L. Через 48-96 годин супернатанти клітин DF1 інокулювали в 1—денні зародки яєць для розмноження вірусу. Через 3-5 днів збирали алантоїсну рідину і тестували на гемаглютинацію (НА) з використанням 1% розчину еритроцитів курей. Алантоїсна рідина, позитивна на НА активність, використовувалася в трьох дослідженнях: 1) клітини DF1 інфікувалися алантоїсною рідиною і тестувалися через 36 годин після інфекції з APMV-8-специфічної антисироваткою на наявність експресії білків APMV-8 в непрямому імунофлуоресцентному аналізі. 2) Алантоїсна рідина тестувалася на специфічність щодо APMV-8 з використанням APMV-8-специфічної сироватки курей (надана National Central Veterinary Laboratory, Ames, Iowa, USA) в дослідженні інгібування гемаглютинації. 3) Відновлення вірусу було встановлене ЗТ-ПЛР з використанням специфічних для APMV-8 олігонуклеотидів. Відсутність вірусної кДНК була підтверджена виключенням стадії зворотної транскрипції під час реакції. Зразки, позитивні за всіма трьома тестами, далі розмножувалися в зародках SPF курячих яєць. Розмноження APMV-8 в клітинах, які не є курячими клітинами Клітини різних видів тварин [хом'яка (клітини нирок хом'яка, Baby hamster kidney cells, клітини BHK-21), мавпи (Vero cells, клітинна лінія, отримана з нирок Африканської зеленої мавпи), собаки (клітини нирок собаки, Madin-Darby canine kidney cells, MDCK) і перепілки (лінія м'язових клітин перепілки, Quail muscle cell line QM7)] вирощували в 24-коміркових планшетах для культивування тканин і інфікували численними інфекціями 0,01. Клітини фіксували крижаним етанолом через 24 години після інфекції і аналізували на наявність специфічних для APMV-8 білків за допомогою непрямої імунофлуоресценції з використанням специфічної до APMV-8 антисироватки з інфікованих APMV-8 SPF курчат. Скріплення антитіл візуалізували з використанням ФІТЦ (fluorescein isothiocyanat, FITC)-кон'югата кози, специфічного проти IGY курчат. Неінфіковані клітини використовувалися як негативний контроль. Зелена флуоресценція спостерігалася тільки в інфікованих клітинах APMV-8. Це указує на те, що APMV-8 був здатний інфікувати клітини з інших видів тварин, а не тільки клітини курей. Реплікація APMV-8 була збільшена у присутності трипсину. Клітини MDCK були інфіковані APMV-8, як описано вище. Після інфекції клітини промивали безсироватковим середовищем і переносили або в безсироваткове середовище, яке містить трипсин в концентрації 1 мкг/мл, або в безсироваткове середовище без трипсину. Через двадцять чотири, сорок вісім і дев'яносто шість годин після інфекції супернатанти клітин видаляли і в клітинах DF1 визначали TCID50 з використанням непрямої імунофлуоресценції, як описано вище. Отримані дані указують на те, що у присутності трипсину APMV-8 реплікується до вищого титру, ніж за відсутності цього ферменту (Фігура 19B). Результати цього експерименту показали, що подібно до AMPV-1, APMV-8 здатний проникати в клітини різних видів і ініціювати свій реплікаційний цикл. Таким чином, він є вектором, придатним для багатьох видів. Отримання рекомбінантного вірусу APMV-8, який експресує чужорідні гени, з використанням системи зворотної генетики Для створення рекомбінантного вірусу APMV-8 (вірусного вектора), який експресує ген гемаглютиніну (HA) високопатогенного пташиного грипу (HPAI), кодуюча послідовність гена НА підтипів Н5 або Н7 вірусу HPAI була вставлена в несмислові ділянки, наприклад, між генами М і F або між генами Р і М геному APMV-8, в плазміду, яка містить повнорозмірний геном APMV-8. З цією метою кодуюча послідовність відкритої рамки зчитування гемаглютиніну фланкувалась всіма необхідними регуляторними послідовностями гена F, які включали послідовність старту гена, 5’-некодуючу послідовність, 3’-некодуючу послідовність і послідовність кінця гена. Конструкція була синтезована так, щоб сайти розщеплювання ферментами рестрикції Bsu 36I і Nhe I можна було використовувати для лігування потрібного фрагмента в існуючу плазміду, яка містить повнорозмірний геном APMV-8, за рахунок їх унікальності в плазмідній конструкції. Отримана плазміда була бажаною траскрипційною плазмідою, яка містить ген гемаглютиніну в несмисловій ділянці повнорозмірного геному APMV-8. З використанням цього підходу можна клонувати кодуючі послідовності багатьох вірусних і бактеріальних антигенів в каркас послідовності APMV-8. Інші можливі антигени, які можуть бути вставлені в геном APMV-8, є злитим білком вірусу хвороби Ньюкасла, S-білком вірусу пташиного бронхіту, іншими генами 26 UA 110328 C2 5 10 15 20 25 гемаглютиніну вірусів пташиного грипу, відмінними від Н5 і Н7, геном структурного білка VP1 вірусу курячої анемії, генами глікопротеїнів з вірусу інфекційного ларинготрахеїту. Приклад 7. Вакцинація тварин Тварини вакцинуються одним, двома введеннями або за схемою «прайм-буст» композицією або вакциною, яка містить рекомбінантний вірус APMV-8 (вірусний вектор), як описано в прикладі 6. Для курчат/птахів проводяться різні режими введення, наприклад, введення in ovo на 18 день або 19 день, підшкірне введення одноденним пташенятам, або мукозальне введення (спрей, питна вода, очні краплі) в різному віці. Дозування складає між 3 і 7 log10 (бажано 4-6 log10 EID50). Для ссавців застосовується мукозальний (інтраназальний, інтраокулярний, пероральний) або парентеральний (внутрішньом'язовий, підшкірний, трансдермальний або внутрішньошкірний спосіб введення без голки) способи введення. Дозування складають від 5 до 9 log (бажано 6-8 log). Зазвичай проводиться два введення з інтервалом в 3-4 тижні. Також є бажаним гетерологічний прайм-буст (наприклад, бустерне введення білків). Ефективність захисту, який індукується композицією або вакциною, оцінюється проти специфічного патогену, що вводиться тварині. Захисна ефективність оцінюється шляхом клінічних спостережень і/або вірусного навантаження специфічного патогену в тканинах, крові або мазках із слизових оболонок. Зразки крові вакцинованих тварин беруться на різних стадіях і тестуються на серологію. Результати показують, що композиція або вакцина даного винаходу є імуногенною і забезпечує захист вакцинованих тварин. Таким чином, познайомившись з детальним описом кращих втілень даного винаходу, слід розуміти, що даний винахід, описаний вище, не обмежується приведеними вище конкретними деталями, і що можливими є багато очевидних варіацій даного винаходу не відходячи від рамок або духу даного винаходу. Всі процитовані або згадані тут документи («процитовані тут документи») і всі документи, процитовані або згадані в процитованих тут документах, разом з будь-якими інструкціями виробників, описами, специфікаціями продуктів і технологічними картами для будь-яких продуктів, згаданих тут або в будь-якому документі, включеному до даного винаходу шляхом посилання, є також включеними до даного винаходу шляхом посилання і можуть застосовуватися при здійсненні даного винаходу. 30 35 40 45 50 55 60 Посилання: Alexander, 1988. Newcastle disease, р. x, 378 р. In D. J. Alexander (ed.), Developments in veterinary virology. Kluwer Academic, Boston. Alexander, Characterization of viruses which represent further distinct serotypes (PMV-8 and PMV-9) of avian paramyxoviruses. Arch Virol 78:29-36. Alexander, et al., 1979. Properties of а newly isolated, serologically distinct avian paramyxovirus. Arch Virol 60:105-13. Alexander, 2003. Newcastle Disease, other Paramyxoviruses, and Pneumovirus Avian Paramyxoviruses 2-9, р. 63-99. In Y. M. Saif (ed.), Diseases of poultry, 11th ed. Iowa State Press, Ames, Iowa. Andral, et al., 1984. Isolation of avian paramyxovirus 2 and 3 from turkeys in Brittany. Vet Rec 114:570-1. Bankowski, et al., 1981, Effect of paramyxovirus yucaipa on fertility, hatchability, and poult yield of turkeys. Avian Dis 25:517-20. Bankowski, et al., 1960. Isolation of an Unidentified Agent from the Respiratory Tract of Chickens. Science 132:292-293. Bradshaw, et al., 1979. The Epidemiology of Yucaipa Virus in Relationship to the Acute Respiratory Disease Syndrome in Turkeys. Avian Diseases 23:539-542. Capua, et al., 2004. Isolation of an avian paramyxovirus type 9 from migratory waterfowl in Italy. Vet Rec 155:156. Chambers, et al., 1988. Protection of chickens from lethal influenza infection by vaccineexpressed hemagglutinin. Virology 167:414–421. Collins, P. L., et al., 1991. Rescue of synthetic analogs of respiratory syncytial virus genomic RNA and effect of truncations and mutations on the expression of а foreign reporter gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9663-9667 Conzelmann KK, and Schnell M., 1994. Rescue of synthetic genomic RNA analogs of rabies virus by plasmid-encoded proteins. J Virol. 68:713-719 Darteil, R., M. Bublot, E. Laplace, J.F. Bouquet, J.C. Audonnet and M. Riviere (1995). Herpesvirus of turkey recombinant viruses expressing infectious bursal disease virus (IBDV) VP2 immunogen induce protection against an IBDV virulent challenge in chickens. Virology 211, 481–490. 27 UA 110328 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 de Leeuw, et al., 1999. Complete nucleotide sequence of Newcastle disease virus: evidence for the existence of а new genus within the subfamily Paramyxovirinae. J Gen Virol 80:131-136. Fleury, et al., 1979. Isolation of twenty-three Yucaipa-like viruses from 616 wild birds in Senegal, West Africa. Avian Dis 23:742-4. Gao, et al., (2006). Protection of mice and poultry from lethal H5N1 avian influenza virus through adenovirus-based immunization. J Virol 80:1959–1964. Ge, et al., (2007) Newcastle disease virus-based live attenuated vaccine completely protects chickens and mice from lethal challenge of homologous and heterologous H5N1 avian influenza viruses. Journal of Virology, 81(1), 150-158. Goodman, et al., 1988. Isolation of avian paramyxovirus-2 from domestic and wild birds in Costa Rica. Avian Dis 32:713-7. Gough, et al., 1984. Avian paramyxovirus type 4 isolated from а ringed teal (Calonetta leucophrys). Vet Rec 115:653. Hoelscher, et al., (2008). A broadly protective vaccine against globally dispersed clade 1 and clade 2 H5N1 influenza viruses. J Infect Dis. 197:1185-1188. Huang, et al., (2004) A recombinant Newcastle Disease Virus (NDV) expressing VP2 protein of Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) protects against NDV and IBDV. Journal of Virology, 78, 10054-10063. Hunt, et al., (1988). Retrovirus-expressed hemagglutinin protects against lethal influenza virus infections. J Virol 62:3014–3019. Inoue K, Shoji Y, Kurane I, Iijima T, Sakai T, Morimoto K. (2003). An improved method for recovering rabies virus from cloned cDNA. J Virol Methods. 107:229-236. Krishnamurthy, et al., 1998. Nucleotide sequences of the trailer, nucleocapsid protein gene and intergenic regions of Newcastle disease virus strain Beaudette C and completion of the entire genome sequence. J Gen Virol 79:2419-2424. Krishnamurthy, S., Huang, Z. & Samal, S. K. (2000) Recovery of а virulent strain of Newcastle disease virus from cloned cDNA: expression of а foreign gene results in growth retardation and attenuation. Virology, 278, 168-182. Lamb, et al., 2007. Paramyxoviridae: The viruses and Their Replication, р. 1449-1496. In B. N. Fields, D. M. Knipe, and P. M. Howley (ed.), Fields' virology 5th ed. Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia. Lang, G., A. Gagnon, and J. Howell. 1975. The occurrence of Paramyxovirus yucaipa in Canadian poultry. Can Vet J 16:233-7. Lipkind, et al., 1982. Isolation of yucaipa-like avian paramyxovirus from а wild mallard duck (Anas platyrhinchos) wintering in Israel. Vet Rec 110:15-6. Lipkind, et al., 1979. The isolation of yucaipa-like paramyxoviruses from epizootics of а respiratory disease in turkey poultry farms in Israel. Vet Rec 105:577-8. Maldonado, et al., (1995) Serological survey for avian paramyxoviruses from wildfowl in aquatic habitats in Andalusia. Journal of Wildlife Diseases, 31(1), 66-69. Mayo, et al., 2002. A summary of taxonomic changes recently approved by ICTV. Arch Virol 147:1655-63. Nayak B, et al., (2008). Molecular characterization and complete genome sequence of avian paramyxovirus type 4 prototype strain duck/Hong Kong/D3/75. Virol J. 20;5:124. Park, et al., (2006) Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: Avian influenza and Newcastle disease. Proceedings of the National Academy of Sciences, 103(21), 8203-8208. Peeters, et al., (1999) Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is а major determinant for virulence. Journal of Virology, 73(6), 50015009. Redmann, et al., 1991. [Isolation of а paramyxovirus-3 from turkeys with respiratory tract disease in Germany]. Dtsch Tierarztl Wochenschr 98:138-41. Reed, et al., 1938. A SIMPLE METHOD OF ESTIMATING FIFTY PER CENT ENDPOINTS. Am. J. Epidemiol. 27:493-497. Romer-Oberdorfer, et al., (1999) Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA. Journal of General Virology, 80, 2987-2995. Rosenberger, et al., (1974) Isolation of Newcastle disease and type-A influenza viruses from migratory waterfowl in the Atlantic flyway. Avian Diseases, 18(4), 610-613. Saif, et al., 1997. Natural and Experimental Infection of Turkeys with Avian Paramyxovirus-7. Avian Diseases 41:326-329. Shihmanter, et al., 1998. Isolation of avian serotype 3 paramyxoviruses from imported caged birds in Israel. Avian Dis 42:829-31. 28
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюRecombinant avian paramyxovirus vaccine and method for making and using thereof
Автори англійськоюBublot, Michel, Mebansion, Teshome, Pritchard, Joyce, Mundt, Egbert
Автори російськоюБюбло Мишель, Мебатсьон Тезом, Притчард Джойс, Мундт Эгберт
МПК / Мітки
МПК: A61K 39/155
Мітки: основі, птахів, приготування, вакцина, спосіб, застосування, параміксовірусів, рекомбінантна
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/327-110328-rekombinantna-vakcina-na-osnovi-paramiksovirusiv-ptakhiv-i-sposib-prigotuvannya-ta-zastosuvannya.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Рекомбінантна вакцина на основі параміксовірусів птахів і спосіб її приготування та застосування</a>
Штам mva-bn модифікованого вірусу коров’ячої віспи ankara, фармацевтична композиція, вакцина, застосування mva-bn для приготування лікарського препарату та для приготування вакцини, спосіб введення гомологічної
Номер патенту: 76731
Опубліковано: 15.09.2006
Автори: Чаплін Пол, Мейсінгер Крістін, Хаулі Пол
МПК: A61K 39/275, C12N 7/02, A61K 39/285, A61P 37/04, A61K 48/00, C12N 7/01, C12N 15/39, C12N 5/10, A61K 39/39, C12N 15/09, C12N 15/863, C12N 7/04, C12P 21/02
Мітки: застосування, препарату, коров'ячої, штам, віспи, лікарського, фармацевтична, вірусу, приготування, вакцини, модифікованого, вакцина, ankara, mva-bn, введення, композиція, спосіб, гомологічної
Формула / Реферат:
1. Штам MVA-BN модифікованого вірусу коров'ячої віспи Ankara, депонований в Європейській колекції клітинних культур (ЕСАСС), Солсбері (UK), під номером V00083008, та його похідні, що мають принаймні одну з таких властивостей:(і) здатність до репродукції шляхом реплікації у фібробластах ембріонів курчат (CEF) і в лінії клітин нирок дитинчат хом'яка ВНК, але нездатність до репродукції шляхом реплікації у клітинних лініях...
Атенуйований рекомбінантний вірус герпесу великої рогатої худоби типу 1 (bhv-1), вакцина, що його містить, та спосіб виявлення тварин, яким була введена рекомбінантна вірусна вакцина
Номер патенту: 75035
Опубліковано: 15.03.2006
Автор: Чоудхарі Шефікл І.
МПК: A61P 37/04, C12N 15/09, C12N 15/869, G01N 33/53, A61P 31/22, C12N 7/01, C12Q 1/34, G01N 33/573, A61K 39/245, C12N 7/04
Мітки: bhv-1, яким, рекомбінантний, худоби, типу, герпесу, тварин, спосіб, вірус, виявлення, була, вірусна, великої, вакцина, містить, рекомбінантна, введена, атенуйований, рогатої
Формула / Реферат:
1. Атенуйований рекомбінантний вірус герпесу великої рогатої худоби типу І, який являє собою вірус герпесу великої рогатої худоби типу І, в якому частина нативної кодуючої ділянки глікопротеїну Е видалена і замінена генетичною вставкою, яка включає кодуючу ділянку стороннього гена -галактозидази і негайний ранній промотор цитомегаловірусу людини, і при цьому даний...
Вакцина на основі lawsonia та способи її застосування
Номер патенту: 96923
Опубліковано: 26.12.2011
Автори: Руф Майкл Б., Кроулл Джеремі Дж.
МПК: A61K 39/02
Мітки: lawsonia, способи, вакцина, основі, застосування
Формула / Реферат:
1. Спосіб забезпечення підвищеного захисту тварини проти інфекції, викликуваної Lawsonia intracellularis, що включає етапи:(а) вакцинації матері зазначеної тварини вакциною, що містить Lawsonia intracellularis, де матір вагітна зазначеною твариною, причому вакцинацію здійснюють на другій або третій стадії вагітності зазначеною твариною;(б) введення тварині в ефективній дозі вакцини на основі Lawsonia...
Вакцина інактивована рекомбінантна проти інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби
Номер патенту: 49450
Опубліковано: 16.09.2002
Автори: Кассіч Володимир Юрійович, Волосянко Олена Вікторівна
МПК: A61K 39/12
Мітки: ринотрахеїту, інфекційного, рогатої, рекомбінантна, інактивована, худоби, великої, вакцина
Формула / Реферат:
Вакцина інактивована рекомбінантна проти інфекційного ринотрахеїту (ІРТ) великої рогатої худоби, що містить мікроорганізм, який має антигени, ідентичні вірусу ІРТ, яка відрізняється тим, що як вірус використовують рекомбінантний штам Bacillus alvei-413, при цьому вакцинний матеріал вирощують на м'ясо-пептонному бульйоні з додаванням (1 %) глюкози та (5 %) сироватки крові коней.
Композиція для лікування серцевих захворювань на основі екстрактів з кореня radix salviae та рanax notogingseng, спосіб її приготування та застосування
Номер патенту: 81124
Опубліковано: 10.12.2007
Автори: Ян Ксижун, Лью Ян, Е Женглиан, Ву Найфен, Гуо Жиксин
МПК: A61K 36/537, A61K 36/258, A61K 9/10
Мітки: серцевих, radix, спосіб, захворювань, композиція, приготування, лікування, екстрактів, рanax, notogingseng, основі, кореня, застосування, salviae
Формула / Реферат:
1. Композиція для лікування хронічної стійкої стенокардії, що містить рослинні екстракти з сирих рослин: 80,0-97,0 % з кореня шавлії Radix Salviae Miltorrihizae, 1,0-19,0 % з женьшеню Раnах Notogingseng і 0,1-1,0 мг борнеолу.2. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що вона містить рослинні екстракти з сирих рослин: 90,0-97,0 % з кореня шавлії Radix Salviae Miltorrihizae, 2,5-9,60 % з женьшеню Раnах...
Попередній патент: Смако-ароматична активна композиція
Наступний патент: Кон’югати жирних кислот і ніацину та їх застосування
Випадковий патент: Пристрій для зміни жорсткості робочої кліті прокатного стана