Білки специфічного зв’язування і їх застосування

Реферат: Винахід стосується виділеного антитіла до епідермального фактора росту (EGFR), яке містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 164, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 166, та його застосування при терапії в комбінації з UA 106607 C2 (12) UA 106607 C2 хіміотерапевтичними або протираковими засобами і/або з іншими антитілами або їх фрагментами. UA 106607 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ОПИС ДАНІ ПРО СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ Дана міжнародна заявка PCT на патент вимагає пріоритет заявки на патент США № 12/388504, поданої 18 лютого 2009 року, опис якої в його повному об'ємі тим самим включений за допомогою посилання. Дана міжнародна заявка PCT на патент також включає за допомогою посилання опис в його повному об'ємі кожної з наступних заявок: заявки на патент США № 10/145598, поданої 13 травня 2002 року (нині патенту США № 7589180, виданого 15 вересня 2009 року); попередньої заявки на патент США № 60/290410, поданої 11 травня 2001 року; попередньої заявки на патент США № 60/326019, поданої 28 вересня 2001 року; попередньої заявки на патент США № 60/342258, поданої 21 вересня 2001 року; міжнародної заявки PCT на патент № PCT/US02/15185, поданої 13 травня 2002 року (опублікованої як WO 02/092771 21 листопада 2002 року); міжнародної заявки PCT на патент № PCT/US2008/009771, поданої 14 серпня 2008 року (опублікованої як WO 2009/023265 19 лютого 2009 року); і попередньої заявки на патент США № 60/964715, поданої 14 серпня 2007 року. ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ Даний винахід належить до членів специфічного зв'язування, зокрема, антитіл і їх фрагментів, які зв'язуються з ампліфікованим рецептором епідермального фактора росту (EGFR) і з EGFR з делецією всередині рамки зчитування екзонів 2-7 EGFR, що приводить до зрізаного рецептору EGFR, в якому пропущені 267 амінокислот екстраклітинного домену (de2-7 EGFR). Зокрема, епітоп, який розпізнається членами специфічного зв'язування, зокрема, антитілами і їх фрагментами, є посиленим або вираженим внаслідок аберантної посттрансляційної модифікації. Ці члени специфічного зв'язування корисні при діагностуванні і лікуванні раку. Зв'язувальні члени даного винаходу можуть також використовуватися при терапії в комбінації з хіміотерапевтичними або протираковими засобами і/або з іншими антитілами або їх фрагментами. КОРОТКА ІНФОРМАЦІЯ ПРО СПОРІДНЕНУ ТЕХНОЛОГІЮ Лікування проліферативного захворювання, зокрема раку, хіміотерапевтичними засобами часто основується на використанні відмінностей в проліферуючих клітинах-мішенях і інших нормальних клітинах в організмі людини або тварини. Наприклад, розроблена велика кількість хімічних агентів, які включаються в швидко репліковану ДНК, внаслідок чого процес реплікації ДНК і розподілу клітин порушується. Іншим підходом є ідентифікація антигенів на поверхні пухлинних клітин або інших анормальних клітинах, які не експресуються при нормальних умовах в тканині людини, що сформувалася, таких як пухлинні антигени або ембріональні антигени. Такі антигени можуть стати мішенями зв'язувальних білків, таких як антитіла, які можуть блокувати або нейтралізувати антиген. Крім того, зв'язувальні білки, в тому числі антитіла і їх фрагменти, можуть доставляти токсичну речовину або іншу речовину, яка здатна безпосередньо або опосередковано активувати токсичну речовину в місці пухлини. EGFR є привабливою мішенню у разі терапії з використанням направлених на пухлини антитіл, оскільки він надекспресований в багатьох типах епітеліальних пухлин (Voldborg et al. (1997). Epidermal growth factor receptor (EGFR) and EGFR mutations, function and possible role in clinical trials. Ann Oncol. 8, 1197-1206; den Eynde, В. and Scott, A.M. Tumor Antigens. In: P.J. Delves and I.M. Roitt (eds.), Encyclopedia of Immunology, Second Edition, pp. 2424-2431. London: Academic Press (1998)). Крім того, експресія EGFR співналежить з поганим прогнозом в ряді типів пухлин, в тому числі шлунка, ободової кишки, сечового міхура, молочної залози, передміхурової залози, ендометрія, нирки і головного мозку (наприклад, гліоми). Отже, в літературі була описана велика кількіть антитіл проти EGFR з індивідуальною клінічною оцінкою, яка проводиться (Baselga et al. (2000) Phase I Studies of Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Chimeric Antibody C225 Alone and in Combination With Cisplatin. J. Clin. Oncol. 18, 904; Faillot et al. (1996): А phase I study of an anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody for the treatment of malignant gliomas. Neurosurgery. 39, 478-483; Seymour, L. (1999) Novel anticancer agents in development: exciting prospects and new challenges. Cancer Treat. Rev. 25, 301312)). Результати досліджень з використанням мАт проти EGFR на пацієнтах з раком голови і шиї, плоскоклітинним раком легені, гліомами головного мозку і злоякісними астроцитомами вселили надії. Протипухлинна активність більшої частини антитіл проти EGFR посилюється їх здатністю блокувати зв'язування ліганду (Sturgis et al. (1994) Effects of antiepidermal growth factor receptor antibody 528 on the proliferation and differentiation of head and neck cancer. Otolaryngol. Head Neck. Surg. 111, 633-643; Goldstein et al. (1995) Biological efficacy of а chimeric antibody to the epidermal growth factor receptor in а human tumor xenograft model. Clin. Cancer Res. 1, 1311-1318). Ефективність таких антитіл може досягатися як через модуляцію клітинної проліферації, так і 1 UA 106607 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 через антитілозалежні імунні функції (наприклад, активацію комплементу). Однак використання цих антитіл може бути обмежене абсорбцією в органах, які мають високі ендогенні рівні EGFR, таких як печінка і шкіра (Baselga et al, 2000; Faillot et al., 1996). Значна частина пухлин, які мають ампліфікації гена EGFR (тобто множина копій гена EGFR), також коекспресують зрізаний варіант рецептора (Wikstrand et al. (1998) The class III variant of the epidermal growth factor receptor (EGFR): characterization and utilization as an immunotherapeutic target. J. Neurovirol. 4, 148-158), відомий як de2-7 EGFR, ΔEGFR або Δ2-7 (терміни, які використовуються тут взаємозамінні) (Olapade-Olaopa et al. (2000) Evidence for the differential expression of а variant EGF receptor protein in human prostate cancer. Br. J. Cancer. 82, 186-194). Реаранжирування, що спостерігається в de2-7 EGFR, приводить до зрілої мРНК в рамці зчитування, в якій відсутні 801 нуклеотид, що заповнює екзони 2-7 (Wong et al. (1992) Structural alterations of the epidermal growth factor receptor gene in human gliomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 2965-2969; Yamazaki et al. (1990) А deletion mutation within the ligand binding domain is responsible for activation of epidermal growth factor receptor gene in human brain tumors. Jpn. J. Cancer Res. 81, 773-779; Yamazaki et al. (1988) Amplification of the structurally and functionally altered epidermal growth factor receptor gene (c-erbB) in human brain tumors. Mol. Cell Biol. 8, 1816-1820; Sugawa et al. (1990) Identical splicing of aberrant epidermal growth factor receptor transcripts from amplified rearranged genes in human glioblastomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 8602-8606). Відповідний білок EGFR характеризується делецією 267 амінокислот, що включає залишки 6-273 екстраклітинного домену, і має новий залишок гліцину в точці з'єднання (Sugawa et al., 1990). Ця делеція разом з вставкою залишку гліцину породжує унікальний сполучний пептид на стику делеції (Sugawa et al., 1990). de2-7 EGFR був описаний в ряді типів пухлин, в тому числі гліомі, пухлинах молочної залози, легені, яєчника і передміхурової залози (Wikstrand et al. (1997) Cell surface localization and density of the tumor-associated variant of the epidermal growth factor receptor, EGFRvIII. Cancer Res. 57, 4130-4140; Olapade-Olaopa et al. (2000) Evidence for the differential expression of а variant EGF receptor protein in human prostate cancer. Br. J. Cancer. 82, 186-194; Wikstrand, et al. (1995) Monoclonal antibodies against EGFRvIII in are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cancer Res. 55, 3140-3148; Garcia de Palazzo et al. (1993) Expression of mutated epidermal growth factor receptor by non-small cell lung carcinomas. Cancer Res. 53, 3217-20). Хоч цей зрізаний рецептор не зв'язує ліганд, він має низьку нерегульовану активність і дає значну перевагу росту клітинам гліоми, що розвиваються у вигляді пухлинних ксенотрансплантатів в безтимусних мишах (Nishikawa et al. (1994) А mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7727-7731), і здатний до трансформації клітин NIH3T3 (Batra et al. (1995) Epidermal growth factor ligand independent, unregulated, cell-transforming potential of а naturally occurring human mutant EGFRvIII gene. Cell Growth Differ. 6, 1251-1259) і клітин MCF-7. Клітинні механізми, що використовуються de2-7 EGFR в клітинах гліоми, не повністю встановлені, але, як повідомлялося, вони включають зменшення апоптозу (Nagane et al. (1996) А common mutant epidermal growth factor receptor confers enhanced tumorigenicity on human glioblastoma cells by increasing proliferation and reducing apoptosis. Cancer Res. 56, 5079-5086) і невелике посилення проліферації (Nagane et al., 1996). Оскільки експресія цього зрізаного рецептора обмежена пухлинними клітинами, він представляє у високій мірі специфічну мішень у разі терапії з використанням антитіл. Відповідно, ряд лабораторій повідомили про створення як поліклональних (Humphrey et al. (1990) Anti-synthetic peptide antibody reacting at the fusion junction of deletion mutant epidermal growth factor receptors in human glioblastoma. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 4207-4211), так і моноклональних (Wikstrand et al. (1995) Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas; Okamoto et al. (1996) Monoclonal antibody against the fusion junction of а deletion-mutant epidermal growth factor receptor. Br. J. Cancer. 73, 1366-1372; Hills et al. (1995) Specific targeting of а mutant, activated EGF receptor found in glioblastoma using а monoclonal antibody. Int. J. Cancer. 63, 537-543) антитіл, специфічних відносно унікального пептиду de2-7 EGFR. Всі з ряду мишачих мАт, виділених після імунізації унікальним пептидом de2-7, продемонстрували селективність і специфічність відносно зрізаного рецептора і цільових, позитивних по de2-7 EGFR ксенотрансплантатів, що розвиваються в безтимусних мишах (Wikstrand et al. (1995); Reist et al. (1997) Improved targeting of an antiepidermal growth factor receptor variant III monoclonal antibody in tumor xenografts after labeling using N-succinimidyl 5-iodo-3-pyridinecarboxylate. Cancer Res. 57, 1510-1515; Reist et al. (1995) Tumor-specific anti-epidermal growth factor receptor variant III monoclonal antibodies: use of the 2 UA 106607 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 tyramine-cellobiose radioiodination method enhances cellular retention and uptake in tumor xenografts. Cancer Res. 55, 4375-4382). Однак одним потенційним недоліком антитіл проти de2-7 EGFR є те, що лише частина пухлин, що демонструють ампліфікації гена EGFR, також експресує de2-7EGFR (Ekstrand et al. (1992) Amplified and rearranged epidermal growth factor receptor genes in human glioblastomas reveal deletions of sequences encoding portions of the N-and/or C-terminal tails. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 4309-4313). Точний процент пухлин, що містять de2-7 EGFR, не повністю встановлений, оскільки використання різних методів (тобто ПЛР в порівнянні з імуногістохімічним аналізом) і різних антитіл породило широкий ряд значень, визначених для частоти його присутності. Опубліковані дані вказують на те, що приблизно 25-30 % гліом експресують de2-7 EGFR, при цьому експресія є найнижчою в анапластичних астроцитомах і найвищою в мультиформній гліобластомі (Wong et al. (1992); Wikstrand et al. (1998) The class III variant of the epidermal growth factor receptor (EGFR): characterization and utilization as an immunotherapeutic target. J. Neurovirol. 4, 148-158; Moscatello et al. (1995) Frequent expression of а mutant epidermal growth factor receptor in multiple human tumors. Cancer Res. 55, 5536-5539). Повідомлялося, що частка позитивних клітин в експресуючих de2-7 EGFR гліомах коливається від 37 до 86 % (Wikstrand et al. (1997)). Встановлено, що 27 % раків молочної залози і 17 % раків легені є позитивними по de2-7 EGFR (Wikstrand et al. (1997); Wikstrand et al. (1995); Wikstrand et al. (1998); і Hills et al., 1995). Таким чином, можна було б чекати, що специфічні відносно de2-7 EGFR антитіла будуть корисні лише в частині позитивних по EGFR пухлин. Таким чином, незважаючи на те, що існуючі дані про активність антитіл проти EGFR вселяють надію, залишаються помічені обмеження відносно області застосовності і ефективності, відображені вище. Відповідно, була б бажаною розробка антитіл і подібних агентів, які демонструють ефективність відносно широкого діапазону пухлин, і саме на досягнення цієї мети направлений даний винахід. Приведення тут посилань не повинно розглядається як визнання того, що вони є рівнем техніки для даного винаходу. КОРОТКИЙ ВИКЛАД СУТІ ВИНАХОДУ Даним винаходом надаються виділені члени специфічного зв'язування, зокрема, антитіла або їх фрагменти, які розпізнають епітоп EGFR, в якому не виявлені які-небудь зміни або заміни в амінокислотній послідовності в порівнянні з такою EGFR дикого типу, і який виявляється в утворюючих пухлину, гіперпроліферативних або анормальних клітинах і звичайно не є таким, що виявляється в нормальних клітинах або клітинах дикого типу. (Використовуваний тут термін "клітина дикого типу" передбачає клітину, яку експресує ендогенний EGFR, але не de2-7EGFR, і термін виключає, зокрема, клітину, яка надекспресує ген EGFR; термін "дикий тип" належить до генотипу або фенотипу або іншої характеристики, яка є в нормальній клітині, а не в анормальній або утворюючій пухлину клітині). У подальшому аспекті даним винаходом надаються члени специфічного зв'язування, зокрема, антитіла або їх фрагменти, які розпізнають епітоп EGFR, який виявляється в утворюючих пухлину, гіперпроліферативних або анормальних клітинах і звичайно не є таким, що виявляється в нормальних клітинах або клітинах дикого типу, причому цей епітоп є посиленим або вираженим внаслідок аберантної посттрансляційної модифікації або аберантної експресії. У конкретному не обмежуючому прикладі, наданому тут, епітоп EGFR є посиленим або вираженим там, де посттрансляційна модифікація не є повною або повною в тій мірі, яка спостерігається при нормальній експресії EGFR в клітинах дикого типу. У одному аспекті епітоп EGFR є посиленим або вираженим внаслідок початкової модифікації або модифікації в результаті приєднання простих вуглеводів, або раннього глікозилування, зокрема модифікації в результаті приєднання великого числа залишків манози, і є ослабленим або не вираженим в присутності модифікації в результаті приєднання складних вуглеводів. Члени специфічного зв'язування, які можуть бути антитілами або їх фрагментами, такими як їх імуногенні фрагменти, по суті не зв'язуються з нормальними клітинами або клітинами дикого типу, які містять нормальний епітоп EGFR або епітоп EGFR дикого типу, або не розпізнають їх за відсутності аберантної експресії і в присутності нормальної посттрансляційної модифікації EGFR. Конкретніше, члени специфічного зв'язування даного винаходу можуть бути антитілами або їх фрагментами, що розпізнають епітоп EGFR, який присутній в клітинах, які надекспресують EGFR (наприклад, ген EGFR ампліфікований) або експресують de2-7 EGFR, особливо в присутності аберантної посттрансляційної модифікації, і який є звичайно таким, що не виявляється в клітинах, які експресують EGFR в нормальних станах, особливо в присутності нормальної посттрансляційної модифікації. 3 UA 106607 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Автори даного винаходу виявили нові моноклональні антитіла, прикладами яких тут є антитіла, позначені як мАт806, ch806, hu806, мАт175, мАт124 і мАт1133, які специфічно розпізнають аберантно експресований EGFR. Зокрема, антитіла даного винаходу розпізнають епітоп EGFR, який виявляється в утворюючих пухлину, гіперпроліферативних або анормальних клітинах і звичайно не є таким, що виявляється в нормальних клітинах або клітинах дикого типу, причому цей епітоп є посиленим або вираженим внаслідок аберантної посттрансляційної модифікації. Нові антитіла даного винаходу також розпізнають ампліфіковані EGFR дикого типу і de2-7 EGFR, хоч зв'язуються з епітопом, відмінним від унікального сполучного пептиду мутованного de2-7 EGFR. Антитіла даного винаходу специфічно розпізнають аберантно експресований EGFR, в тому числі ампліфіковані EGFR і мутантний EGFR (прикладом якого тут є мутація de2-7), зокрема, внаслідок аберантної посттрансляційної модифікації. Крім того, незважаючи на те, що ці антитіла не розпізнають EGFR при його представленні на клітинній поверхні лінії гліомних клітин, які експресують нормальні кількості EGFR, вони дійсно зв'язуються з екстраклітинним доменом EGFR (sEGFR), іммобілізованим на поверхні планшетів для ELISA, що вказує на розпізнавання конформаційного епітопу. Ці антитіла зв'язуються з поверхнею клітин A431, які мають ампліфікацію гена EGFR, але не експресують de2-7 EGFR. Важливо, що ці антитіла не зв'язуються значною мірою з нормальними тканинами, такими як печінка і шкіра, які експресують ендогенний EGFR дикого типу (wt) на рівнях, які перевищують такі в більшій частині інших нормальних тканин, але в яких EGFR не є аберантно експресованим або ампліфікованим. Антитіла даного винаходу можуть специфічним чином випередити природу позитивних по EGFR пухлин або утворюючих пухлину клітин, за допомогою забарвлювання або іншого розпізнавання цих пухлин або клітин, в яких є аберантна експресія EGFR, в тому числі ампліфікація EGFR і/або мутація EGFR, зокрема de2-7EGFR. Крім того, антитіла даного винаходу демонструють значну in vivo протипухлинну активність проти пухлин, що містять ампліфікований EGFR, і проти позитивних по de2-7 EGFR ксенотрансплантатів. Унікальна специфічність зв'язування цих антитіл з de2-7 EGFR і ампліфікованим EGFR, але не з нормальним EGFR дикого типу, забезпечує діагностичні і терапевтичні застосування для ідентифікації, визначення характеристик і впливу на ряд типів пухлин, наприклад, пухлини голови і шиї, молочної залози або передміхурової залози і гліоми, без проблем, пов'язаних з абсорбцією нормальними тканинами, яку можна спостерігати при використанні раніше відомих антитіл проти EGFR. Відповідно, даним винаходом надаються білки специфічного зв'язування, такі як антитіла, які зв'язуються з de2-7 EGFR в епітопі, який відмінний від сполучного пептиду, але які по суті не зв'язуються з EGFR на поверхні нормальних клітин за відсутності ампліфікації гена EGFR. Термін "ампліфікація", як мається на увазі, містить в собі те, що клітина має множину копій гена EGFR. Переважно епітоп, який розпізнається антитілами даного винаходу, розташовується в області, що включає залишки 273-501 послідовності зрілого нормального EGFR або EGFR дикого типу, і переважно включає залишки 287-302 (SEQ ID NO: 14) послідовності зрілого нормального EGFR або EGFR дикого типу. Отже, також надаються білки специфічного зв'язування, такі як антитіла, які зв'язуються з de2-7 EGFR в епітопі, який розташовується в області, що включає залишки 273-501 і/або 287-302 (SEQ ID NO: 14) послідовності EGFR. Епітоп можна визначити за допомогою будь-яких загальноприйнятих методів картування епітопів, відомих кваліфікованому в даній галузі техніки фахівцю. Альтернативно, можна було б розщепити послідовність ДНК, що кодує залишки 273-501 і/або 287-302 (SEQ ID NO: 14), і результуючі фрагменти експресувати у прийнятному хазяї. Зв'язування антитіл можна було б визначити, як указано вище. У переважному аспекті антитілами є антитіла, які мають характеристики антитіл, які були ідентифіковані і охарактеризовані авторами даного винаходу, зокрема, що розпізнають аберантно експресований EGFR, як встановлено у випадку ампліфікованих EGFR і de2-7EGFR. У іншому аспекті даним винаходом надаються антитіла, здатні конкурувати з антитілами даного винаходу в умовах, в яких зв'язування щонайменше 10 % антитіла, що має послідовності VH і VL антитіл даного винаходу, з de2-7EGFR блоковано внаслідок конкуренції з таким антитілом в аналізі ELISA. Передбачаються, зокрема, антиідіотипічні антитіла, і їх приклади приводяться тут. Тут надаються антиідіотипічні антитіла LMH-11, LMH-12 і LMH-13. Зв'язування антитіла зі своєю мішенню-антигеном опосередковується через визначаючі комплементарність ділянки (CDR) його важкого і легкого ланцюгів, при цьому CDR3 відіграє особливо важливу роль. Відповідно, члени специфічного зв'язування на основі ділянок CDR3 4 UA 106607 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 важкого або легкого ланцюга, а переважно обох ланцюгів, антитіл даного винаходу будуть корисними членами специфічного зв'язування для in vivo терапії. Відповідно, члени специфічного зв'язування, такі як антитіла, які основані на CDR ідентифікованих антитіл даного винаходу, особливо ділянках CDR3, будуть застосовні для впливу на пухлини з ампліфікованим EGFR незалежно від їх de2-7 EGFR-статусу. Оскільки антитіла даного винаходу не зв'язуються значною мірою з нормальним рецептором дикого типу, не буде значної абсорбції нормальною тканиною, обмеження антитіл проти EGFR, які розроблені в цей час. У іншому аспекті надається здатне до зв'язування з EGFR на поверхні клітин пухлин, які мають ампліфікації гена EGFR, при цьому клітини пухлин мають множину копій гена EGFR, і на поверхні клітин пухлин, які експресують зрізаний варіант рецептора de2-7 EGFR, виділене антитіло, яке не зв'язується зі сполучним пептидом de2-7 EGFR, що складається з амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 13, яке зв'язується з епітопом всередині послідовності із залишків 287-302 (SEQ ID NO: 14) EGFR дикого типу людини, і яке не включає послідовність варіабельної області важкого ланцюга, яка відповідає амінокислотній послідовності, представленій в SEQ ID NO: 2, і не включає послідовність варіабельної області легкого ланцюга, яка відповідає амінокислотній послідовності, представленій в SEQ ID NO: 4. У іншому аспекті надається виділене антитіло, яке включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, при цьому важкий ланцюг має амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 42, а легкий ланцюг має амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 47. У іншому аспекті надається виділене антитіло, яке включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, при цьому важкий ланцюг має амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 129, а легкий ланцюг має амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 134. У іншому аспекті надається виділене антитіло, яке включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, при цьому важкий ланцюг має амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 22, а легкий ланцюг має амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 27. У іншому аспекті надається виділене антитіло, яке включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, при цьому важкий ланцюг має амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 32, а легкий ланцюг має амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 37. У іншому аспекті надається виділене антитіло, яке включає легкий ланцюг і важкий ланцюг, де варіабельна область важкого ланцюга включає ділянки зв'язуючого поліпептид домену, що мають амінокислотні послідовності, у високому ступені гомологічні амінокислотним послідовностям, представленим в SEQ ID NO: 44, 45 і 46. У іншому аспекті надається виділене антитіло, яке включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, де варіабельна область легкого ланцюга включає ділянки зв'язуючого поліпептид домену, що мають амінокислотні послідовності, у високому ступені гомологічні амінокислотним послідовностям, представленим в SEQ ID NO: 49, 50 і 51. У іншому аспекті надається виділене антитіло, яке включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, де варіабельна область важкого ланцюга включає ділянки зв'язуючого поліпептид домену, що мають амінокислотні послідовності, у високому ступені гомологічні амінокислотним послідовностям, представленим в SEQ ID NO: 130, 131 і 132. У іншому аспекті надається виділене антитіло, яке включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, де варіабельна область легкого ланцюга включає ділянки зв'язуючого поліпептид домену, що мають амінокислотні послідовності, у високому ступені гомологічні амінокислотним послідовностям, представленим в SEQ ID NO: 135, 136 і 137. У іншому аспекті надається виділене антитіло, яке включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, де варіабельна область важкого ланцюга включає ділянки зв'язуючого поліпептид домену, що мають амінокислотні послідовності, у високому ступені гомологічні амінокислотним послідовностям, представленим в SEQ ID NO: 23, 24 і 25. У іншому аспекті надається виділене антитіло, яке включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, де варіабельна область легкого ланцюга включає ділянки зв'язуючого поліпептид домену, що мають амінокислотні послідовності, у високому ступені гомологічні амінокислотним послідовностям, представленим в SEQ ID NO: 28, 29 і 30. У іншому аспекті надається виділене антитіло, яке включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, де варіабельна область важкого ланцюга включає ділянки зв'язуючого поліпептид домену, що мають амінокислотні послідовності, у високому ступені гомологічні амінокислотним послідовностям, представленим в SEQ ID NO: 33, 34 і 35. У іншому аспекті надається виділене антитіло, яке включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, де варіабельна область легкого ланцюга включає ділянки зв'язуючого поліпептид домену, що 5 UA 106607 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 мають амінокислотні послідовності, у високому ступені гомологічні амінокислотним послідовностям, представленим в SEQ ID NO: 38, 39 і 40. У іншому аспекті надається виділене антитіло, яке є формою антитіла F(ab') 2, scFvфрагментом, діатілом, триатілом або тетратілом. У іншому аспекті надається виділене антитіло, що додатково включає виявлювану або функціональну мітку. У іншому аспекті виявлюваною або функціональною міткою є ковалентно приєднаний лікарський засіб. У іншому аспекті міткою є радіоактивна мітка. У іншому аспекті надається виділене антитіло, яке є ПЕГильованим. У іншому аспекті надається виділена нуклеїнова кислота, яка включає послідовність, що кодує виділене антитіло, описане тут. У іншому аспекті надається спосіб приготування виділеного антитіла, що включає експресію нуклеїнової кислоти, описаної вище і тут, в умовах, які приводять до експресії антитіла, і витягання антитіла. У іншому аспекті надається спосіб лікування пухлини у пацієнта, що є людиною, який включає введення пацієнту ефективної кількості виділеного антитіла, описаного тут. У іншому аспекті надається набір для діагностування пухлини, в якій EGFR аберантно експресований або в якій EGFR експресований в формі зрізаного білка, що включає виділене антитіло, описане тут. У іншому аспекті набір, крім того, включає реагенти і/або інструкції відносно використання. У іншому аспекті надається фармацевтична композиція, що включає виділене антитіло, описане тут. У іншому аспекті фармацевтична композиція, крім того, включає, фармацевтично прийнятний наповнювач, носій або розріджувач. У іншому аспекті фармацевтична композиція, крім того, включає протипухлинний засіб, вибираний з групи, яка складається з хіміотерапевтичних засобів, антитіл проти EGFR, радіоімунотерапевтичних засобів і їх комбінацій. У іншому аспекті хіміотерапевтичні засоби вибирають з групи, яка складається з інгібіторів тирозинкінази, інгібіторів каскаду реакцій фосфорилування, модуляторів посттрансляційної модифікації, інгібіторів росту або розподілу клітин (наприклад, антимітотичних засобів), інгібіторів передачі сигналів і їх комбінацій. У іншому аспекті інгібітори тирозинкінази вибирають з групи, яка складається з AG1478, ZD1839, STI571, OSI-774, SU-6668 і їх комбінацій. У іншому аспекті антитіла проти EGFR вибирають з групи, яка складається з антитіл проти EGFR 528, 225, SC-03, DR8.3, L8A4, Y10, ICR62, ABX-EGF і їх комбінацій. У іншому аспекті надається спосіб запобігання і/або лікування раку у ссавців, що включає введення ссавцеві терапевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, описаної тут. У іншому аспекті надається спосіб лікування властивих головному мозку раків, які продукують аберантно експресований EGFR, у ссавців, що включає введення ссавцеві терапевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, описаної тут. У іншому аспекті властивий головному мозку рак вибирають з групи, яка складається з гліобластом, медулобластом, менінгіом, неопластичних астроцитом і неопластичних артеріовенозних мальформацій. У іншому аспекті надається одноклітинний хазяїн, трансформований рекомбінантною молекулою ДНК, яка кодує виділене антитіло, описане тут. У іншому аспекті одноклітинний хазяїн вибирають з групи, яка складається з Е. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, дріжджів, клітин CHO, YB/20, NSO, SP2/0, Rl.1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 і BMT10, клітин рослин, клітин комах і клітин людини в культурі тканини. У іншому аспекті надається спосіб виявлення присутності ампліфікованого EGFR, de27EGFR або EGFR, глікозованного в результаті приєднання великого числа залишків манози, в якому EGFR вимірюють за допомогою (a) приведення біологічного зразка від ссавця, в якому передбачається присутність ампліфікованого EGFR, de2-7EGFR або EGFR, глікозованого в результаті приєднання великого числа залишків манози, в контакт з виділеним антитілом по пункту 1 в умовах, що допускають виникнення зв'язування EGFR з виділеним антитілом; і (b) виявлення, чи сталося зв'язування між EGFR із зразка і виділеним антитілом; причому виявлення зв'язування служить ознакою присутності або активності EGFR в зразку. 6 UA 106607 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У іншому аспекті способу виявлення присутності ампліфікованого EGFR, de2-7EGFR або EGFR, глікозованого в результаті приєднання великого числа залишків манози, виявлення присутності EGFR служить ознакою наявності пухлини або раку у ссавця. У іншому аспекті надається здатне до зв'язування з EGFR на поверхні клітин пухлин, які мають ампліфікації гена EGFR, при цьому клітини пухлин мають множину копій гена EGFR, і на поверхні клітин пухлин, які експресують зрізаний варіант рецептора de2-7 EGFR, виділене антитіло, яке включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, при цьому важкий ланцюг має амінокислотну послідовність, яка у значному ступені гомологічна амінокислотній послідовності, представленій в SEQ ID NO: 42, а легкий ланцюг має амінокислотну послідовність, яка у значному ступені гомологічна амінокислотній послідовності, представленій в SEQ ID NO: 47. У іншому аспекті важкий ланцюг антитіла включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 42, а легкий ланцюг антитіла включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 47. У іншому аспекті надається здатне до зв'язування з EGFR на поверхні клітин пухлин, які мають ампліфікації гена EGFR, при цьому клітини пухлин мають множину копій гена EGFR, і на поверхні клітин пухлин, які експресують зрізаний варіант рецептора de2-7 EGFR, виділене антитіло, яке включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, причому варіабельна область важкого ланцюга включає ділянки зв'язуючого поліпептид домену, що мають амінокислотні послідовності, у високому ступені гомологічні амінокислотним послідовностям, представленим в SEQ ID NO: 44, 45 і 46, а варіабельна область легкого ланцюга включає ділянки зв'язуючого поліпептид домену, що мають амінокислотні послідовності, у високому ступені гомологічні амінокислотним послідовностям, представленим в SEQ ID NO: 49, 50 і 51. У іншому аспекті надається здатне до зв'язування з EGFR на поверхні пухлин, які мають ампліфікації гена EGFR, при цьому клітини пухлин мають множину копій гена EGFR, і на поверхні пухлин, які експресують зрізаний варіант рецептора de2-7 EGFR, виділене антитіло, яке включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, при цьому важкий ланцюг має амінокислотну послідовність, яка у значному ступені гомологічна амінокислотній послідовності, представленій в SEQ ID NO: 129, а легкий ланцюг має амінокислотну послідовність, яка у значному ступені гомологічна амінокислотній послідовності, представленій в SEQ ID NO: 134. У іншому аспекті важкий ланцюг антитіла включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 129, а легкий ланцюг антитіла включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 134. У іншому аспекті надається здатне до зв'язування з EGFR на поверхні пухлин, які мають ампліфікації гена EGFR, при цьому клітини пухлин мають множину копій гена EGFR, і на поверхні пухлин, які експресують зрізаний варіант рецептора de2-7 EGFR, виділене антитіло, яке включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, причому варіабельна область важкого ланцюга включає ділянки зв'язуючого поліпептид домену, що мають амінокислотні послідовності, у високому ступені гомологічні амінокислотним послідовностям, представленим в SEQ ID NO: 130, 131 і 132, а варіабельна область легкого ланцюга включає ділянки зв'язуючого поліпептид домену, що мають амінокислотні послідовності, у високому ступені гомологічні амінокислотним послідовностям, представленим в SEQ ID NO: 135, 136 і 137. У іншому аспекті надається здатне до зв'язування з EGFR на поверхні пухлин, які мають ампліфікації гена EGFR, при цьому клітини пухлин мають множину копій гена EGFR, і на поверхні пухлин, які експресують зрізаний варіант рецептора de2-7 EGFR, виділене антитіло, яке включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, при цьому важкий ланцюг має амінокислотну послідовність, яка у значному ступені гомологічна амінокислотній послідовності, представленій в SEQ ID NO: 22, а легкий ланцюг має амінокислотну послідовність, яка у значному ступені гомологічна амінокислотній послідовності, представленій в SEQ ID NO: 27. У іншому аспекті важкий ланцюг антитіла включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 22, а легкий ланцюг антитіла включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 27. У іншому аспекті надається здатне до зв'язування з EGFR на поверхні пухлин, які мають ампліфікації гена EGFR, при цьому клітини пухлин мають множину копій гена EGFR, і на поверхні пухлин, які експресують зрізаний варіант рецептора de2-7 EGFR, виділене антитіло, яке включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, причому варіабельна область важкого ланцюга включає ділянки зв'язуючого поліпептид домену, що мають амінокислотні послідовності, у високому ступені гомологічні амінокислотним послідовностям, представленим в SEQ ID NO: 23, 24 і 25, а варіабельна область легкого ланцюга включає ділянки зв'язуючого поліпептид домену, що мають амінокислотні послідовності, у високому ступені гомологічні амінокислотним послідовностям, представленим в SEQ ID NO: 28, 29 і 30. 7 UA 106607 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У іншому аспекті надається здатне до зв'язування з EGFR на поверхні пухлин, які мають ампліфікації гена EGFR, при цьому клітини пухлин мають множину копій гена EGFR, і на поверхні пухлин, які експресують зрізаний варіант рецептора de2-7 EGFR, виділене антитіло, яке включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, при цьому важкий ланцюг має амінокислотну послідовність, яка у значному ступені гомологічна амінокислотній послідовності, представленій в SEQ ID NO: 32, а легкий ланцюг має амінокислотну послідовність, яка у значному ступені гомологічна амінокислотній послідовності, представленій в SEQ ID NO: 37. У іншому аспекті важкий ланцюг антитіла включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 32, а легкий ланцюг антитіла включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 37. У іншому аспекті надається здатне до зв'язування з EGFR на поверхні пухлин, які мають ампліфікації гена EGFR, при цьому клітини пухлин мають множину копій гена EGFR, і на поверхні пухлин, які експресують зрізаний варіант рецептора de2-7 EGFR, виділене антитіло, яке включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, причому варіабельна область важкого ланцюга включає ділянки зв'язуючого поліпептид домену, що мають амінокислотні послідовності, у високому ступені гомологічні амінокислотним послідовностям, представленим в SEQ ID NO: 33, 34 і 35, а варіабельна область легкого ланцюга включає ділянки зв'язуючого поліпептид домену, що мають амінокислотні послідовності, у високому ступені гомологічні амінокислотним послідовностям, представленим в SEQ ID NO: 38, 39 і 40. У іншому аспекті надається здатне до зв'язування з EGFR на поверхні пухлин, які мають ампліфікації гена EGFR, при цьому клітини пухлин мають множину копій гена EGFR, і на поверхні пухлин, які експресують зрізаний варіант рецептора de2-7 EGFR, виділене антитіло, яке не зв'язується зі сполучним пептидом de2-7 EGFR, що складається з амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 13, яке зв'язується з епітопом всередині послідовності із залишків 287-302 EGFR людини дикого типу, при цьому антитіло включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, причому варіабельна область легкого ланцюга включає першу ділянку зв'язуючого поліпептид домену, що має амінокислотну послідовність, яка відповідає амінокислотній послідовності, представленій формулою I: HSSQDIXaa1SNIG (I), де Xaa1 є залишком амінокислоти, що має незаряджену полярну групу R (SEQ ID NO: 151); друга ділянка зв'язуючого поліпептид домену, що має амінокислотну послідовність, яка відповідає амінокислотній послідовності, представленій формулою II: HGTNLXaa2D (II), де Xaa2 є залишком амінокислоти, що має заряджену полярну групу R (SEQ ID NO: 152); і третя ділянка зв'язуючого поліпептид домену, що має амінокислотну послідовність, яка відповідає амінокислотній послідовності, представленій формулою III: VQYXaa3QFPWT (III), де Xaa3 вибирають з групи, яка складається з А, G і амінокислотного залишку, що є консервативною заміною А або G (SEQ ID NO: 153); а варіабельна область важкого ланцюга включає першу ділянку зв'язуючого поліпептид домену, що має амінокислотну послідовність, яка відповідає амінокислотній послідовності, представленій формулою IV: SDXaa4AWN (IV), де Xaa4 вибирають з групи, яка складається з F, Y і амінокислотного залишку, що є консервативною заміною F або Y (SEQ ID NO: 154); друга ділянка зв'язуючого поліпептид домену, що має амінокислотну послідовність, яка відповідає амінокислотній послідовності, представленій формулою V, формулою VI або формулою VII: YISYSGNTRYXaa5PSLKS (V), де Xaa5 є залишком амінокислоти, що має незаряджену полярну групу R (SEQ ID NO:155), YISYSXaa6NTRYNPSLKS (VI), де Xaa6 вибирають з групи, яка складається з G, А і амінокислотного залишку, що є консервативною заміною G або А (SEQ ID NO: 156), YISYSGNTRYNPSLXaa7S (VII), де Xaa7 є залишком основної амінокислоти (SEQ ID NO: 157); і третя ділянка зв'язуючого поліпептид домену, що має амінокислотну послідовність, яка відповідає амінокислотній послідовності, представленій формулою VIII: Xaa8TAGRGFPY (VIII), де Xaa8 вибирають з групи, яка складається з V, А і амінокислотного залишку, що є консервативною заміною V або А (SEQ ID NO: 158), 8 UA 106607 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 і причому антитіло не включає послідовність варіабельної області важкого ланцюга, яка відповідає амінокислотній послідовності, представленій в SEQ ID NO: 2, і не включає послідовність варіабельної області легкого ланцюга, яка відповідає амінокислотній послідовності, представленій в SEQ ID NO: 4. У іншому аспекті Xaa1 є N; Xaa2 є D; Xaa3 є А; Xaa4 є F; Xaa5 є залишком амінокислоти, що має незаряджену полярну групу R; Xaa6 є G; Xaa7 є K; і Xaa8 є V. У іншому аспекті Xaa5 є N або Q. У іншому аспекті Xaa1 є N або S. У іншому аспекті Xaa2 є D або Е. У іншому аспекті Xaa3 є А або G. У іншому аспекті Xaa4 є F або Y. У іншому аспекті Xaa5 є N або Q. У іншому аспекті Xaa6 є G або А, а Xaa7 незалежно являє собою K або R. У іншому аспекті Xaa8 є V або А. У іншому аспекті надається здатне до зв'язування з EGFR на поверхні пухлин, які мають ампліфікації гена EGFR, при цьому клітини пухлин мають множину копій гена EGFR, і на поверхні пухлин, які експресують зрізаний варіант рецептора de2-7 EGFR, виділене антитіло, яке не зв'язується зі сполучним пептидом de2-7 EGFR, що складається з амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 13, яке зв'язується з епітопом всередині послідовності із залишків 273-501 EGFR людини дикого типу, при цьому антитіло включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, причому варіабельна область легкого ланцюга включає першу ділянку зв'язуючого поліпептид домену, що має амінокислотну послідовність HSSQDINSNIG (SEQ ID NO: 18); друга ділянка зв'язуючого поліпептид домену, що має амінокислотну послідовність HGTNLDD (SEQ ID NO: 19); і третя ділянка зв'язуючого поліпептид домену, що має амінокислотну послідовність VQYAQFPWT (SEQ ID NO:20), а варіабельна область важкого ланцюга включає першу ділянку зв'язуючого поліпептид домену, що має амінокислотну послідовність SDFAWN (SEQ ID NO: 15); друга ділянка зв'язуючого поліпептид домену, що має амінокислотну послідовність, яка відповідає амінокислотній послідовності, представленій формулою IX: YISYSGNTRYXaa9PSLKS (IX), де Xaa9 є залишком амінокислоти, що має незаряджену полярну групу R (SEQ ID NO: 159); і третя ділянка зв'язуючого поліпептид домену, що має амінокислотну послідовність VTAGRGFPY (SEQ ID NO: 17). У іншому аспекті антитіло зв'язується з епітопом всередині послідовності із залишків 287-302 (SEQ ID NO: 14) EGFR людини дикого типу. У іншому аспекті Xaa9 є N або Q. У іншому аспекті ділянки зв'язувального домену підтримуються каркасом антитіла людини. У іншому аспекті каркасом антитіла людини є каркас антитіла людини IgG1. У іншому аспекті надається здатне до зв'язування з EGFR на поверхні пухлин, які мають ампліфікації гена EGFR, при цьому клітини пухлин мають множину копій гена EGFR, і на поверхні пухлин, які експресують зрізаний варіант рецептора de2-7 EGFR, виділене антитіло, яке включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, при цьому важкий ланцюг має амінокислотну послідовність, яка у значному ступені гомологічна амінокислотній послідовності, представленій в SEQ ID NO: 2, а легкий ланцюг має амінокислотну послідовність, яка у значному ступені гомологічна амінокислотній послідовності, представленій в SEQ ID NO: 4. У іншому аспекті важкий ланцюг антитіла включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 2, а легкий ланцюг антитіла включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 4. У іншому аспекті надається здатне до зв'язування з EGFR на поверхні пухлин, які мають ампліфікації гена EGFR, при цьому клітини пухлин мають множину копій гена EGFR, і на поверхні пухлин, які експресують зрізаний варіант рецептора de2-7 EGFR, виділене антитіло, яке включає важкий ланцюг і легкий ланцюг, причому варіабельна область важкого ланцюга включає ділянки зв'язуючого поліпептид домену, що мають амінокислотні послідовності, у високому ступені гомологічні амінокислотним послідовностям, представленим в SEQ ID NO: 15, 16 і 17, а варіабельна область легкого ланцюга включає ділянки зв'язуючого поліпептид домену, що мають амінокислотні послідовності, у високому ступені гомологічні амінокислотним послідовностям, представленим в SEQ ID NO: 18, 19 і 20. Інші об'єкти і переваги стануть очевидними кваліфікованим в даній галузі техніки фахівцям в результаті розгляду наступного докладного опису винаходу, який здійснюється з посиланням на наступні ілюстративні фігури, і супровідної формули винаходу. 9 UA 106607 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР На фіг. 1 представлені результати протоково-цитометричного аналізу ліній гліомних клітин. Клітини U87MG (світло-сірі гістограми) і U87MG.Δ2-7 (темно-сірі гістограми) забарвлювали нерелевантним антитілом IgG2b (не зафарбовані гістограми) і тим або іншим антитілом, вибираним з DH8.3 (специфічного для de2-7 EGFR), мАт806 або 528 (зв'язується як з EGFR дикого типу, так і з de2-7 EGFR), як указано. На фіг. 2A-D представлені результати ELISA мАт806, мАтDH8.3 і мАт528. (А) Зв'язування збільшуваних концетрацій мАт806 (▲), антитіла DH8.3 (●) або 528 () з покритими sEGFR планшетами для ELISA. (В) Інгібування зв'язування мАт806 і мАт528 з покритими sEGFR планшетами для ELISA при збільшенні концентрацій розчинного EGFR (sEGFR) в розчині. (С) Зв'язування збільшуваних концентрацій DH8.3 зі сполучним пептидом de2-7. (D) Ілюструються криві зв'язування мАт806 і мАт528 з іммобілізованим sEGFR дикого типу. На фіг. 2E і 2F графічно представлені результати досліджень зв'язування BIAcore, в яких використовується С-кінцевий біотинільований пептид і в які включене моноклональне антитіло даного винаходу, нарівні з іншими відомими антитілами, серед них антитіло L8A4, яке розпізнає сполучний пептид мутанта de2-7 EGFR, і контролями. На фіг. 3 відображена інтерналізація мАт806 і антитіла DH8.3. Клітини U87MG.Δ2-7 попередньо інкубували з мАт806 (▲) або DH8.3 (●) при 4°C, переносили на 37°C, і інтерналізацію визначали за допомогою FACS. Дані представляютьь середню інтерналізацію в кожний момент часу ± стандартна помилка у випадку 3 (DH8.3) або 4 (мАт806) окремих експериментів. На фіг. 4A і 4B ілюструється біорозподіл (% ін'єктованої дози (ID)/г пухлинної тканини) 125 131 мічених радіоактивними ізотопами антитіл: (a) I-мАт806 і (b) I-DH8.3 у безтимусних мишей, що мають ксенотрансплантати U87MG і U87MG.Δ2-7. Кожна точка представляє середнє значення для 5 мишей ± стандартна помилка, за виключення 1 год., коли n=4. 125 На фіг. 5A і 5B ілюструється біорозподіл мічених радіоактивними ізотопами антитіл: I131 мАт806 (не зафарбований стовпчик) і I-DH8.3 (зафарбований стовпчик), представлене у вигляді відношень локалізацій (а) пухлина: кров або (b) пухлина: печінка, у безтимусних мишей, що мають ксенотрансплантати U87MG.Δ2-7. Кожний стовпчик представляє середнє значення для 5 мишей ± стандартна помилка, за виключення 1 год., коли n=4. На фіг. 6A-С ілюструється протоково-цитометричний аналіз ліній клітин, що є ампліфікацію гена EGFR. Клітини A431 забарвлювали тим або іншим антитілом, вибираним з мАт806, DH8.3 і 528, (чорні гістограми) і порівнювали з фарбуванням нерелевантним антитілом IgG2b (незабарвлені гістограми). На фіг. 7A і 7B ілюструється біорозподіл (% ID/г пухлинної тканини) мічених радіоактивними 125 131 ізотопами антитіл: (a) I-мАт806 і (b) I-528 у безтимусних мишей, що мають ксенотрансплантати U87MG.Δ2-7 і A431. 125 На фіг. 8A-D ілюструється біорозподіл мічених радіоактивними ізотопами антитіл: I131 мАт806 (незафарбований стовпчик) і I-528 (зафарбований стовпчик), представлене у вигляді відношень локалізацій (А, В) пухлина: кров або (С, D) пухлина: печінка у безтимусних мишей, що мають ксенотрансплантати (А, С) U87MG.Δ2-7 і (В, D) A431. На фіг. 9A і 9B ілюструється протипухлинний ефект мАт806 на швидкості зростання 6 ксенотрансплантатів (А) U87MG і (В) U87MG.Δ2-7 в превентивній моделі. 3×10 клітин U87MG або U87MG.Δ2-7 ін'єктували підшкірно в обидва боки безтимусних мишей BALB/с віком 4-6 тижнів (n=5) в день 0. Мишам внутрішньочеревинно ін'єктували або дози мАт806, які складають 1 мг, (●), дози мАт806, які складають 0,1 мг, (▲), або носій (Ο), починаючи з дня, який передує дню інокуляції пухлинних клітин. Ін'єкції здійснювали три рази на тиждень протягом двох тижнів, як указано стрілками. Дані представлені як середній об'єм пухлин ± стандартна помилка. На фіг. 10A, 10B і 10C ілюструється протипухлинний ефект мАт806 на ксенотрансплантати 6 (А) U87MG, (В) U87MG.Δ2-7 і (С) U87MG.wtEGFR в моделі укоріненої пухлини. 3×10 клітин U87MG, U87MG.Δ2-7 або U87MG.wtEGFR ін'єктували підшкірно в обидва боки безтимусних мишей BALB/с віком 4-6 тижнів (n=5). Мишам внутрішньочеревинно ін'єктували або дози мАт806, які складають 1 мг, (●); дози мАт806, які складають 0,1 мг, (▲); або носій (Ο), 3 починаючи з того дня, коли середній об'єм пухлин досягав 65-80 мм . Ін'єкції здійснювали три рази на тиждень протягом двох тижнів, як указано стрілками. Дані представлені як середній об'єм пухлин ± стандартна помилка. На фіг. 11A і 11B ілюструється протипухлинний ефект мАт806 на ксенотрансплантати A431 6 в (А) превентивній моделі і (В) моделі укоріненої пухлини. 3×10 клітин A431 ін'єктували підшкірно в обидва боки безтимусних мишей BALB/с віком 4-6 тижнів (n=5). Мишам внутрішньочеревинно ін'єктували або дози мАт806, які складають 1 мг, (●); або носій (Ο), 10 UA 106607 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 починаючи з дня, який передує дню інокуляції пухлинних клітин, в превентивній моделі, або 3 коли середній об'єм пухлин досягав 200 мм . Ін'єкції здійснювали три рази на тиждень протягом двох тижнів, як указано стрілками. Дані представлені як середній об'єм пухлин ± стандартна помилка. На фіг. 12 ілюструється протипухлинний ефект лікування мАт806 в комбінації з лікуванням AG1478 на ксенотрансплантати A431 в превентивній моделі. Дані представлені як середній об'єм пухлин ± стандартна помилка. На фіг. 13 відображено зв'язування мАт806 з клітинами A431 в присутності збільшуваних концетрацій AG1478 (0,5 мкМ і 5 мкМ). На фіг. 14A і 14B ілюструється (А) послідовність нуклеїнової кислоти і (В) амінокислотна послідовність гена VH 806 (SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 2, відповідно), що є результатом її трансляції. На фіг. 15A і 15B ілюструється (А) послідовність нуклеїнової кислоти і (В) амінокислотна послідовність гена VL 806 (SEQ ID NO: 3 і SEQ ID NO: 4, відповідно), що є результатом її трансляції. На фіг. 16 представлена послідовність VH (SEQ ID NO: 2), пронумерована відповідно до Kabat, з підкресленими CDR (SEQ ID NO: 15, 16 і 17). Важливими залишками послідовності VH (SEQ ID NO: 2) є 24, 37, 48, 67 і 78. На фіг. 17 представлена послідовність VL (SEQ ID NO: 4), пронумерована відповідно до Kabat, з підкресленими CDR (SEQ ID NO: 18, 19 і 20). Важливими залишками послідовності VL (SEQ ID NO: 4) є 36, 46, 57 і 71. На фіг. 18A-18D представлені результати in vivo досліджень, спланованих для визначення терапевтичного ефекту комбінованої терапії з використанням антитіл, конкретно, мАт806 і антитіла 528. Мишам інокулювали клітини U87MG.D2-7 (А і В), U87MG.DK (С) або A431 (D). На фіг. 19 A-D показаний аналіз інтерналізації за допомогою електронної мікроскопії. Клітини U87MG.Δ2-7 заздалегідь інкубували з мАт806 або DH8.3, а потім з кон'югованим із золотом антитілом проти IgG миші при 4°C, переносили на 37°C, і інтерналізацію перевіряли в різні моменти часу за допомогою електронної мікроскопії: (А) локалізація антитіла DH8.3 в облямованій ямці (стрілка) через 5 хв.; (В) інтерналізація мАт806 за допомогою макропіноцитозу (стрілка) через 2 хв.; (С) локалізація DH8.3 в лізосомах (стрілка) через 20 хв.; (D) локалізація мАт806 в лізосомах (стрілка) через 30 хв. Початкове збільшення у разі всіх зображень - X30000. На фіг. 20 показана радіоавтографія зрізу ксенотрансплантата U87MG.Δ2-7, отриманого 125 через 8 год. після ін'єкції I-міченого мАт806. На фіг. 21 показаний протоково-цитометричний аналіз ліній клітин, який має ампліфікацію гена EGFR. Клітини HN5 і MDA-468 забарвлювали нерелевантним антитілом IgG2b (незабарвлена гістограма з пунктирними лініями), мАт806 (зафарбована гістограма) або 528 (незабарвлена гістограма із замкненими лініями). Обидві лінії клітин були повністю негативними по реактивності з антитілом DH8.3 (не представлені дані). На фіг. 22 показана імунопреципітація EGFR з клітинних ліній. Імунопреципітації піддавали 35 EGFR з S-мічених клітин U87MG.Δ2-7 або A431 за допомогою мАт806, антитіла sc-03 або співпадаючого по ізотипу контролю IgG2b. Стрілки збоку вказують положення de2-7 і EGFR дикого типу. Ідентичні картини смуг були отримані в трьох незалежних експериментах. На фіг. 23 показана ауторадіографія зрізу ксенотрансплантата A431, отриманого через 24 125 год. після ін'єкції I-міченого мАт806, області локалізації життєздатної тканини показані стрілками. На фіг. 24A і 24B показане збільшення виживаності безтимусних мишей, що мають внутрішньочерепні ксенотрансплантати U87MG.ΔEGFR (А) і LN-Z308.ΔEGFR (В), за допомогою 5 системного лікування мАт806. Клітини U87MG.EGFR (1×10 ) або клітини LN-Z308.ΔEGFR 5 (5×10 ) імплантували в головний мозок безтимусних мишей і тварин піддавали лікуванню або мАт806, PBS, або співпадаючим по ізотипу IgG з дня 0 по день 14 після імплантації. На фіг. 24C і 24D показано придушення зростання внутрішньочерепних пухлин за допомогою лікування мАт806. Безтимусних мишей (п'ять в кожній групі), підданих лікуванню або мАт806, або співпадаючим по ізотипу IgG як контролем, піддавали евтаназії в день 9 у випадку U87MG.EGFR (С) і в день 15 у випадку LN-Z308.ΔEGFR (D) і головний мозок витягували, фіксували і робили зрізи. Дані розраховували при прийнятті об'єму пухлини контролю за 100 %. Значення являють собою середнє значення ± стандартна помилка. ***, Р