Номер патенту: 105625

Опубліковано: 10.06.2014

Автори: Пападопулос Ніколас Дж., Фендл Джеймс П., Дейлі Томас Дж.

Є ще 27 сторінок.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Злитий поліпептид, який зв'язує і інгібує фактор росту ендотеліальних клітин судин (VEGF), що складається зі злиття ((R1R2)2) одного домену R1R2 з другим R1R2, де вказані домени злиті безпосередньо один з одним або за допомогою спейсерів, де R1 означає компонент рецептора VEGF у вигляді Ig-домену 2 Flt-1, і R2 означає Ig-домен 3 Flk-1, де амінокислотна послідовність злитого поліпептиду являє собою послідовність SEQ ID NO: 24.

2. Фармацевтична композиція, яка містить злитий поліпептид за п. 1 і фармацевтично прийнятний носій.

3. Злитий поліпептид, здатний зв'язувати і інгібувати VEGF, за п. 1 для застосування при лікуванні захворювання або стану, який поліпшується, стає ослабленим або пригніченим при видаленні або інгібуванні VEGF.

4. Злитий поліпептид, здатний зв'язувати і інгібувати VEGF, за п. 3 для застосування при лікуванні захворювання або стану, який являє собою захворювання або стан очей.

5. Злитий поліпептид, здатний зв'язувати і інгібувати VEGF, за п. 4 для застосування при лікуванні захворювання або стану очей, який являє собою пов'язану з віком дегенерацію жовтої плями.

Текст

Реферат: Винахід належить до злитого поліпептиду, який зв'язує і інгібує фактор росту ендотеліальних клітин судин (VEGF), що складається зі злиття ((R1R2)2) одного домену R1R2 з другим R1R2, де вказані домени злиті безпосередньо один з одним або за допомогою спейсерів, де R1 означає компонент рецептора VEGF у вигляді Ig-домену 2 Flt-1, і R2 означає Ig-домен 3 Flk-1, де амінокислотна послідовність злитого поліпептиду являє собою послідовність SEQ ID NO: 24. UA 105625 C2 (12) UA 105625 C2 UA 105625 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до злитих поліпептидів, здатних зв'язувати фактор росту ендотеліальних клітин судин (VEGF), представників сімейства VEGF, і варіанти сплайсингу з конкретними необхідними характеристиками, а також до терапевтичних способів застосування. Суть винаходу У першому аспекті відмітною ознакою винаходу є молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий поліпептид, що містить компоненти рецепторів (R1R2) X і/або (R1R3)Y, де R1 означає компонент рецептора фактора росту ендотеліальних клітин судин (VEGF) у вигляді Ig-домену 2 Flt-1 (Flt1D2), R2 означає компонент рецептора VEGF у вигляді Ig-домену 3 Flk-1 (Flk1D3) і R3 означає компонент рецептора VEGF у вигляді Ig-домену 3 Flt-4 (Flt1D3 або R3), і де Х≥1 і Y≥1. У пов'язаному другому аспекті відмітною ознакою винаходу є мономерна пастка VEGF або злитий поліпептид, який містить компоненти рецептора VEGF (R1R2) X і/або (R1R3)Y, де Х≥1, Y≥1 і R1, R2 і R3 мають значення, визначені вище. Компоненти рецептора VEGF R1, R2 і R3 можуть бути безпосередньо зв'язані один з одним або зв'язані за допомогою однієї або декількох спейсерних послідовностей. У одному конкретному варіанті мономерна пастка VEGF являє собою (R1R2)X, де Х=2. У більш конкретному варіанті мономерною пасткою VEGF є SEQ ID NO:24 або її функціонально еквівалентний амінокислотний варіант. Винахід належить до мономерної пастки VEGF, що головним чином складається з компонентів рецептора VEGF (R1R2)X і/або (R1R3)Y і їх функціонально еквівалентних амінокислотних варіантів. У третьому аспекті відмітною ознакою винаходу є ізольована молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий поліпептид, що містить компоненти рецептора VEGF (R1R2) X і/або (R1R3)Y і компонент, який є партнером в злитті (FP), вибраний з групи, яка складається з мультимеризуючого компонента (МС), сироваткового білка або молекули, здатної зв'язувати сироватковий білок. У переважному варіанті FP є мультимеризуючим компонентом (МС), здатним взаємодіяти з мультимеризуючим компонентом в іншому злитому поліпептиді з утворенням мультимерної структури, наприклад димеру або тримеру. Найбільш переважно, МС вибраний з групи, яка складається з (і) мультимеризуючого компонента, який містить область (С-область), що розщеплюється, (іі) укороченого мультимеризуючого компонента, (ііі) амінокислотної послідовності довжиною від 1 до приблизно 200 амінокислот, що має щонайменше один залишок цистеїну, (iv) лейцинової блискавки, (v) мотиву спіральної петлі, (vi) coil-coil мотиву і (vii) домену імуноглобуліну. Крім того пропонуються злиті поліпептиди, що по суті складаються з (R1R2)X і/або (R1R3)Y і FP. У переважному варіанті злитий поліпептид по суті складається з (R1R2)X і МС. У четвертому аспекті відмітною ознакою винаходу є злитий поліпептид, що містить компоненти рецептора VEGF (R1R2) X і/або (R1R3)Y і FP, які описані вище. Компоненти рецептора можуть бути розташовані в різному порядку, наприклад (R1R2) X-FP; (R1R2)X-FP(R1R2)X; FP-(R2R1)X і т.д. Компоненти злитого поліпептиду можуть бути безпосередньо зв'язані один з одним, або зв'язані за допомогою спейсерної послідовності. У п'ятому аспекті відмітною ознакою винаходу є пастка VEGF, яка містить мультимер з двох або більше злитих поліпептидів, що складаються з компонентів рецептора VEGF (R1R2) X і/або (R1R3)Y і FP, де компонент FP є мультимеризуючим компонентом (МС), що містить С-область. С-область може бути природного походження або штучною і може знаходиться в будь-якій точці в мультимеризуючому компоненті і функціонує, забезпечуючи розщеплення вихідного МС до укороченого МС. Пастка VEGF, яка складається з двох або більш злитих поліпептидів, що мають щонайменше один укорочений МС, називається "укороченою міні-пасткою". С-область може бути утворена в МС за допомогою інсерції, делеції або мутації так, щоб був утворений ферментативно або хімічно розщеплюваний сайт. С-область може бути утворена в будь-якому МС і в будь-якому положенні в МС; переважно С-область утворюють в повнорозмірному домені Fc або його фрагменті або домені СН3. С-область може бути сайтом, що розщеплюється ферментом, таким як тромбін, фіцин, пепсин, матрилізин або пролідаза, або що розщеплюється хімічно, наприклад мурашиною кислотою або СuСl2. У шостому пов'язаному аспекті відмітною ознакою винаходу є укорочена міні-пастка VEGF, яка є мультимерним білком, що містить два або більше злитих поліпептиди, що складаються з (R1R2)X і/або (R1R3)Y і мультимеризуючого компонента, який укорочений розщепленням вихідного МС, що містить С-область (tMC). У сьомому аспекті відмітною ознакою винаходу є злитий поліпептид, який складається з компонентів рецептора VEGF (R1R2)X і/або (R1R3)Y і МС, де МС являє собою амінокислотну послідовність довжиною від 1 до приблизно 200 амінокислот, що містить щонайменше один залишок цистеїну, де щонайменше один залишок цистеїну здатний утворювати дисульфідний зв'язок із залишком цистеїну, присутнім в МС іншого злитого поліпептиду (сМС). У переважному варіанті сМС являє собою амінокислотну послідовність довжиною 1-50 амінокислот, яка містить 1 UA 105625 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 щонайменше один залишок цистеїну. У більш переважному варіанті сМС є амінокислотною послідовністю довжиною 1-15 амінокислот, яка містить щонайменше один залишок цистеїну. У ще більш переважному варіанті сМС являє собою амінокислотну послідовність довжиною 1-10 амінокислот, яка містить 1-2 залишки цистеїну. Ілюстрація даного варіанта винаходу показана в SEQ ID NO:27, що має сигнальну послідовність (1-26), за якою ідуть компоненти R1 (27-129) і R2 (130-231), і далі іде послідовність з дев'яти амінокислот, яка закінчується залишком цистеїну. У іншому варіанті, показаному в SEQ ID NO:28, за сигнальною послідовністю (1-26) ідуть компоненти R1 (27-129) і R2 (130-231), за якими іде послідовність з шести амінокислот, яка закінчується залишком цистеїну. У восьмому аспекті відмітною ознакою винаходу є міні-пастка VEGF, яка містить мультимер з двох або більше злитих поліпептидів, що складаються з (R1R2)x і/або (R1R3)Y і сМС. У більш конкретному варіанті міні-пастка є димером. Ілюстрацією даного варіанта міні-пастки, згідно з винаходом, є димер злитого поліпептиду, показаного в SEQ ID NO:2, в якому кожний злитий поліпептид (R1R2-cMC) має молекулярну масу 23,0 кД і рI 9,22. У іншому варіанті сМС має 4 амінокислоти в довжину і включає два залишки цистеїну, наприклад ХСХС (SEQ ID NO:3). У одному ілюстративному прикладі даного варіанта винаходу міні-пастка складається з компонентів рецептора VEGF, згідно з винаходом, і сМС складається з ACGC (SEQ ID NO:4). Одним ілюстративним прикладом даного варіанта міні-пастки, згідно з винаходом, є димер злитого поліпептиду, показаного в SEQ ID NO:5, в якому кожний мономер має молекулярну масу 23,2 кД і рI 9,22. Інший ілюстративний приклад даного варіанта винаходу показаний в SEQ ID NO:26, що має сигнальну послідовність (1-26), за якою ідуть компоненти R1 (27-129) і R2 (130-231) з подальшою послідовністю з дев'яти амінокислот, яка закінчується СРРС. У всіх варіантах пастки VEGF, згідно з винаходом, (включаючи укорочену міні-пастку VEGF, міні-пастки VEGF і мономерні міні-пастки VEGF) сигнальна послідовність (S) може бути включена на початку (або на N-кінці) злитого поліпептиду, згідно з винаходом. Сигнальна послідовність може бути нативною для клітини, рекомбінантної або синтетичної. Якщо сигнальна послідовність зв'язана з N-кінцем першого рецепторного компонента, то злитий поліпептид може бути позначений, наприклад, як S-(R1R2)X. Компоненти злитого поліпептиду можуть бути безпосередньо зв'язані один з одним, або можуть бути зв'язані за допомогою спейсерів. У конкретних варіантах один або декілька рецепторних компонентів і/або компонентів, які є партнерами в злитті, в злитому поліпептиді безпосередньо зв'язані один з одним без спейсерів. У інших варіантах один або декілька рецепторних компонентів і/або компонентів, які є партнерами в злитті, зв'язані за допомогою спейсерів. Винахід належить до векторів, які містять молекули нуклеїнової кислоти, згідно з винаходом, включаючи експресуючі вектори, що містять молекулу нуклеїнової кислоти, функціонально зв'язану з послідовністю регуляції експресії. Винахід, крім того, належить до систем хазяїнвектор для одержання злитого поліпептиду, які містять експресуючий вектор у відповідній клітині-хазяїні; до систем хазяїн-вектор, в яких придатною клітиною-хазяїном є бактеріальна, дріжджова клітини, клітина комах, клітина ссавців; клітина Е. соlі або клітина COS або СНО. Крім того пропонуються пастки VEGF, згідно з винаходом, модифіковані ацетилюванням або пегилюванням. Способи ацетилювання або пегилювання білка добре відомі в даній галузі. У пов'язаному дев'ятому аспекті відмітною ознакою винаходу є спосіб одержання пастки VEGF, згідно з винаходом, який включає культивування клітини-хазяїна, трансфікованої вектором, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, згідно з винаходом, в умовах, придатних для експресії білка клітиною-хазяїном, і витягання одержаного таким чином злитого поліпептиду. Пастки VEGF, згідно з винаходом, терапевтично застосовні для лікування будь-якого захворювання або стану, який поліпшується, стає ослабленим або пригніченим при видаленні, інгібуванні або зменшенні кількості VEGF. Неповний список конкретних станів, які поліпшуються при інгібуванні або зменшенні кількості VEGF, включає, наприклад, небажане просочування плазми або проникність судин, небажаний ріст кровоносних судин, наприклад, такий як в пухлині, набряк, пов'язаний із запальними захворюваннями, такими як псоріаз або артрит, включаючи ревматоїдний артрит; астму; генералізований набряк, пов'язаний з опіками; асцит і плевральний випіт, пов'язаний з пухлинами, запаленням або травмою; хронічне запалення дихальних шляхів; астму; синдром капілярного витоку; сепсис; хворобу нирок, пов'язану з підвищеним просочуванням білка; аденокарциному проток підшлункової (PDAC) залоза і очні захворювання, такі як пов'язана з віком дегенерація жовтої плями і діабетична ретинопатія. Міні-пастка VEGF зокрема застосовна для лікування захворювань очей і як допоміжний засіб 2 UA 105625 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 при операціях на очах, включаючи операцію з приводу глаукоми; і лікування внутрішньоочних пухлин, наприклад, таких як увеальна меланома, ретинобластома, за допомогою доставки в склоподібне тіло. Відповідно в десятому аспекті відмітною ознакою винаходу є терапевтичний спосіб лікування пов'язаного з VEGF захворювання або стану, який включає введення пастки VEGF, згідно з винаходом, суб'єкту, що страждає на пов'язане з VEGF захворювання або стан. Хоч будь-якого ссавця можна лікувати терапевтичними способами, згідно з винаходом, суб'єктом переважно є хвора людина, що страждає або схильна до ризику розвитку стану або захворювання, яке може бути поліпшене, ослаблене, інгібоване або піддане лікуванню пасткою VEGF. У одинадцятому аспекті відмітною ознакою винаходу є способи діагностики і прогнозування, а також набори для виявлення, кількісного аналізу і/або стеження за VEGF з використанням міні-пасток, згідно з винаходом. У дванадцятому аспекті відмітною ознакою винаходу є фармацевтичні композиції, які містять пастку VEGF, згідно з винаходом, з фармацевтично прийнятним носієм. Такі фармацевтичні композиції можуть містити пастку з димерного злитого поліпептиду або нуклеїнові кислоти, що кодують злитий поліпептид. Міні-пастки, згідно з винаходом, знаходять конкретні застосування при станах, при яких потрібна пастка VEGF із зниженим часом напівжиття в сироватці (наприклад, більш швидкий кліренс) і/або підвищеним проникненням в тканині внаслідок меншого розміру. Конкретні застосування міні-пастки VEGF включають, наприклад, захворювання, при яких бажане локальне введення в конкретну тканину або клітину. Прикладами такого стану є офтальмологічні хвороби ока. Інші об'єкти і переваги стануть очевидними при ознайомленні з наступним докладним описом. Докладний опис винаходу Перед тим як ознайомитися з описом способів, які запропоновані, потрібно розуміти, що даний винахід не обмежено описаними конкретними способами і експериментальними умовами, як такі способи і умови можуть варіювати. Також потрібно розуміти, що термінологія, що використовується в даному описі, застосовується тільки з метою опису конкретних варіантів і не призначена для обмеження, оскільки об'єм даного винаходу буде обмежений тільки прикладеною формулою винаходу. У використовуваному в даному описі і прикладеній формулі винаходу значення форми однини включають посилання на множину, якщо контекст чітко не диктує зворотне. Таким чином, наприклад, посилання на "спосіб" включає один або декілька способів і/або стадій вказаного в даному описі типу і/або тих, які стануть очевидними фахівцям в даній області при читанні даного опису і т.д. Якщо не обумовлено особливо, всі технічні і наукові терміни, що використовуються в даному описі, мають таке ж значення, яке звичайно розуміється фахівцем в галузі, до якої даний винахід належить. Хоч на практиці або при перевірці даного винаходу можуть бути використані будь-які способи і речовини, схожі або еквівалентні речовинам, вказаним в даному описі, описані переважні способи і речовини. Всі публікації, що згадуються в даному описі, включені в нього у вигляді посилання, щоб описати способи і/або речовини в зв'язку з якими цитовані публікації. Загальний опис Винахід належить до пастки VEGF, здатної зв'язувати і інгібувати активність VEGF, яка є мономером або мультимером одного або декількох злитих поліпептидів. Молекули, згідно з винаходом, зв'язують і інгібують біологічну активність VEGF і/або фізіологічну реакцію або відповідь. Опис заснованих на рецепторі VEGF антагоністичних пасток VEGF Flt1D2.Flk1D3.FcΔCl(a) (SEQ ID-NO:7-8) і VEGFR1R2-FcΔCl(a) (SEQ ID NO:9-10) дивись в РСТ WO/0075319, зміст якої включений в даний опис у вигляді посилання в повному об'ємі. Міні-пастка, згідно з винаходом, менша, ніж повнорозмірна пастка, приблизно 50-60 кД в порівнянні з 120 кД вихідної пастки, і включає мономерні пастки, що складаються головним чином з доменів рецепторів VEGF (R1R2) X, (R1R3)Y або їх комбінацій, пастки, утворені відщеплюванням частини вихідної мультимерної пастки, яка має компонент, що є партнером в злитті, який являє собою мультимеризуючий компонент (МС), що містить область розщеплення (С-область); або зв'язуванням залишку цистеїну або амінокислотної послідовності, що містить один або декілька залишків цистеїну, з доменами рецепторного компонента або між доменами рецепторного компонента. У конкретних варіантах міні-пастка, згідно з винаходом, має молекулярну масу менше 60 кД, як виміряно за допомогою SDS-ПААГ-аналізу, більш переважно приблизно 50 кД, ще більш переважно приблизно 20-30 кД, або приблизно 25 кД, і здатна 3 UA 105625 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язувати VEGF з афінністю, порівняною з повнорозмірною вихідною пасткою, описаною в PCT/US00/14142. Конструкції нуклеїнової кислоти і експресія Даний винахід належить до конструкції молекул нуклеїнової кислоти, кодуючих окремий злитий поліпептид, здатний зв'язувати VEGF, або мультимерні пастки VEGF. Молекули нуклеїнової кислоти, згідно з винаходом, можуть кодувати компоненти рецепторів дикого типу R1, R2 і/або R3 або їх функціонально еквівалентні варіанти. Варіанти амінокислотної послідовності рецепторних компонентів R1, R2 і/або R3 пасток, згідно з винаходом, також можуть бути одержані внаслідок створення мутацій в кодуючих молекулах нуклеїнових кислот. Такі варіанти включають, наприклад, делеції або інсерції або заміни амінокислотних залишків в амінокислотній послідовності R1, R2 і/або R3. Може бути здійснена будь-яка комбінація делеції, інсерції і заміни, щоб одержати кінцеву конструкцію, за умови, що кінцева конструкція має здатність зв'язувати і інгібувати VEGF. Указані молекули нуклеїнових кислот вбудовують у вектор, який здатний експресувати злитий поліпептид при введенні у відповідну клітину-хазяїна. Відповідні клітини-хазяїни включають, але не обмежені вказаним, клітини бактерій, дріжджів, комах і ссавців. Можна застосовувати будь-які способи, відомі фахівцеві в даній галузі, для вбудовування фрагментів ДНК у вектор, щоб сконструювати експресуючі вектори, що кодують злитий поліпептид, згідно з винаходом, під контролем сигналів регуляції транскрипції/трансляції. Експресія молекул нуклеїнової кислоти, згідно з винаходом, може регулюватися другою послідовністю нуклеїнової кислоти так, щоб молекули експресувалися в хазяїні, трансформованому молекулою рекомбінантної ДНК. Наприклад експресія може регулюватися будь-яким промоторним/енхансерним елементом, відомим в даній галузі. Промотори, які можна використати для регуляції експресії химерних поліпептидних молекул, включають без обмеження довгий кінцевий повтор (Squinto et al. (1991) Cell 65:1-20); область раннього промотору SV40, промотор CMV, M-MuLV, промотор тимідинкінази, регуляторні послідовності гена металотіоніну; прокаріотичні експресуючі вектори, такі як промотор b-лактамази або промотор tac (дивись також Scientific American (1980) 242:74-94); промотор ні елементи дріжджів або інших грибів, такі як промотор Gal 4, ADH, PGK, промотор лужної фосфатази і області регуляції тканиноспецифічної транскрипції, одержані з таких генів, як еластаза І. Експресуючі вектори, здатні реплікуватися в бактерійному або еукаріотичному хазяїні, що містять молекули нуклеїнової кислоти, згідно з винаходом, використовують для трансфекції хазяїна і таким чином для керування експресією таких нуклеїнових кислот, щоб одержати злитий поліпептид, згідно з винаходом, який утворює пастки, здатні зв'язуватися з VEGF. Трансфіковані клітини можуть тимчасово або переважно конститутивно і постійно експресувати пастки VEGF, згідно з винаходом. Пастки, згідно з винаходом, можуть бути очищені будь-яким способом, який забезпечує подальше утворення стабільної біологічно активної пастки. Наприклад, але не з метою обмеження, фактори можуть бути витягнуті з клітин або у вигляді розчинних білків, або у вигляді тіл включення, з яких їх можна екстрагувати кількісно 8М гідрохлоридом гуанідинію і діалізом (дивись, наприклад, патент США № 5663304). Щоб додатково очистити фактори, можна використати звичайну іонообмінну хроматографію, хроматографію на основі гідрофобної взаємодії, хроматографію із оберненою фазою або гель-фільтрацію. Компоненти рецептора VEGF Компоненти рецептора VEGF в міні-пастках VEGF складаються з Ig-домену 2 Flt-1 (Flt1D2) (R1), Ig-домену 3 Flk-1 (Flk1D3) (R2) (разом, R1R2), і/або R1 і Ig-домену 3 Flt-4 (Flt1D-3) (R3) (разом R1R3). Мається на увазі, що термін "Ig-домен" Flt-1, Flt-4 або Flk-1 охоплює не тільки повний домен дикого типу, але також його варіанти з інсерціями, делеціями і/або замінами, які по суті зберігають функціональні властивості інтактного домену. Фахівцеві в даній галузі без великих зусиль буде зрозуміло, що можуть бути одержані численні варіанти вказаних вище Igдоменів, які будуть зберігати по суті такі ж функціональні властивості, як і домен дикого типу. Мається на увазі, що термін "функціональні еквіваленти" при використанні з посиланням на R1, R2 або R3, охоплює домен R1, R2 або R3 щонайменше з однією зміною, наприклад делецією, приєднанням і/або заміною, який зберігає по суті такі ж функціональні властивості, як і домен R1, R2 або R3 дикого типу, тобто по суті еквівалентне зв'язування з VEGF. Буде зрозуміло, що можуть бути зроблені різні амінокислотні заміни в R1, R2 або R3, не відходячи від суті винаходу відносно здатності вказаних рецепторних компонентів зв'язувати і інактивувати VEGF. Функціональні властивості пасток, згідно з винаходом, можна визначити будь-яким відповідним скринінговим аналізом, відомим в даній галузі для вимірювання необхідної характеристики. Приклади таких аналізів описані в експериментальному розділі нижче, які 4 UA 105625 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дозволяють визначати зв'язувальні властивості пасток для VEGF (Kd), а також час їх напівжиття у разі дисоціації комплексу пастка-ліганд (Т1/2). Інші аналізи, наприклад зміна здатності специфічно зв'язуватися з VEGF, можна виміряти в аналізі скріплення VEGF конкурентного типу. Модифікації властивостей білка, таких як термостабільність, гідрофобність, чутливість до протеолітичної деградації або тенденція до агрегації, можуть бути виміряні способами, відомими фахівцям в даній галузі. Компоненти злитого поліпептиду можуть бути безпосередньо зв'язані один з одним або можуть бути зв'язані за допомогою спейсерів. Загалом, термін "спейсер" (або лінкер) означає одну або декілька молекул, наприклад нуклеїнових кислот або амінокислот, або непептидних залишків, таких як поліетиленгліколь, які можуть бути вбудовані між одним або декількома складаючими доменами. Наприклад, спейсерні послідовності можуть бути використані для забезпечення потрібного сайта, що представляє інтерес, між компонентами для полегшення обробки. Спейсер також може бути введений, щоб посилити експресію злитого поліпептиду клітиною-хазяїном, щоб зменшити стеричні перешкоди, так щоб компонент міг приймати свою оптимальну третинну структуру і/або відповідним чином взаємодіяти зі своєю молекулоюмішенню. Спейсери і способи ідентифікації необхідних спейсерів дивись, наприклад, в роботі George et al. (2003) Protein Engineering 15:871-879, включеного в даний опис у вигляді посилання. Послідовність спейсера може містити одну або декілька амінокислот, зв'язаних в природі з рецепторним компонентом, або може являти собою додану послідовність, що використовується для посилення експресії злитого поліпептиду, забезпечення спеціальних потрібних сайтів, що представляють інтерес, забезпечення можливості для утворення складаючими доменами оптимальних третинних структур і/або для посилення взаємодії компонента з його молекулою-мішенню. У одному варіанті спейсер містить одну або декілька пептидних послідовностей між одним або декількома компонентами, які містять 1-100 амінокислот, переважне 1-25. У більш конкретних варіантах R1 являє собою амінокислоти 27-126 SEQ ID NO:8 або 1-126 SEQ ID NO:8 (включаючи сигнальну послідовність 1-26); або амінокислоти 27-129 SEQ ID NO:10, або 1-129 SEQ ID NO:10 (включаючи сигнальну послідовність в положенні 1-26). У більш конкретних варіантах R2 являє собою амінокислоти 127-228 SEQ ID NO:8 або амінокислоти 130231 SEQ ID NO:10. У більш конкретних варіантах R3 являє собою амінокислоти 127-225 SEQ ID NO:13 (без сигнальної послідовності). У тому випадку, коли наприклад R2 помішують на N-кінці злитого поліпептиду, може бути бажано, щоб сигнальна послідовність передувала рецепторному компоненту. Рецепторний компонент(и), пов'язаний з мультимеризуючим компонентом, крім того може містити спейсерний компонент, наприклад послідовність GPG з амінокислот 229-231 SEQ ID NO:7. Компоненти, які є партнерами в злитті, і мультимеризуючі компоненти. Партнером в злитті є будь-який компонент, який посилює функції злитого поліпептиду. Таким чином, наприклад, партнер в злитті може посилювати біологічну активність злитого поліпептиду, допомагати його продукуванню і/або витяганню, або посилювати фармакологічну властивість або фармакокінетичний профіль злитого поліпептиду, наприклад, за допомогою збільшення його часу напівжиття в сироватці, проникності в тканини, забезпечення відсутності імуногенності або забезпечення стабільності. У переважних варіантах партнер в злитті вибраний з групи, яка складається з мультимеризуючого компонента, сироваткового білка або молекули, здатної зв'язувати сироватковий білок. У тому випадку, коли партнер в злитті є сироватковим білком або його фрагментом, він вибраний з групи, яка складається з α-1-микроглобулина, AGP-1, орозомукоїду, α-1-кислого глікопротеїну, зв'язуючого вітамін D білка (DBP), гемопексину, сироваткового альбуміну людини (hSA), трансферину, феритину, афаміну, гаптоглобіну, α-фетопротеїну тироглобуліну, α-2-НSглікопротеїну, (3-2-глікопротеїну, гіалуронанзв'язувального білка, синтаксину, C1R, ланцюга Clq, зв'язуючого галектин 3-Мас2 білка, фібриногену, полімерного рецептора Ig (PIGR), α-2макроглобуліну, білка, що транспортує сечовину, гаптоглобіну, IGFBP, фагоцитарних рецепторів макрофагів, фібронектину, гіантину, Fc, α-1-антихімотрипсину, α-1-антитрипсину, антитромбіну III, аполіпопротеїну A-l, аполіпопротеїну В, β-2-мікоглобуліну, церулоплазміну, компонента комплементу С3 або С4, інгібітору естерази СІ, С-реактивного білка, цистатину С і білка С. В більш конкретному варіанті партнер в злитті вибраний з групи, яка складається з α-1мікроглобуліну, AGP-1, орозомукоїду, α-1-кислого глікопротеїну, зв'язуючого вітамін D білка (DBP), гемопексину, сироваткового альбуміну людини (hSA), афаміну і гаптоглобіну. Включення компонента, що є партнером в злитті, може при бажанні продовжувати час напівжиття злитого поліпептиду згідно з винаходом, в сироватці. Дивись, наприклад, патенти США № 6423512, 5876969, 6593295 і 6548653, спеціально включені в даний опис у вигляді посилання в повному 5 UA 105625 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 об'ємі, відносно прикладів поліпептиду, злитого з сироватковим альбуміном. hSA широко розподілений в організмі, особливо в кишечнику і компонентах крові, і грає важливу роль в підтримці осмолярності і об'єму плазми. Він повільно виводиться з печінки і у людей звичайно має час напівжиття in vivo 14-20 днів (Waldmann et al. (1977) Albumin, Structure Function and Uses; Pergamon Press; pp. 255-275). У тому випадку, коли партнером в злитті є молекула, здатна зв'язувати сироватковий білок, молекула може бути синтетичною малою молекулою, ліпідом або ліпосомою, нуклеїновою кислотою, включаючи синтетичну нуклеїнову кислоту, таку як аптомер, пептидом або олігосахаридом. Крім того, молекула може бути таким білком, як, наприклад, FcγR1, FcγR2, FcγR3, полімерний рецептор Ig (PIGR), ScFv і інші фрагменти антитіл, специфічні по відношенню до сироваткового білка. У тому випадку, коли партнером в злитті є мультимеризуючий компонент (МС), він являє собою будь-яку природну або синтетичну послідовність, здатну взаємодіяти з іншим МС з утворенням структури більш високого порядку, наприклад димеру, тримеру і т.д. Відповідні МС можуть включати лейцинові блискавку, включаючи домени лейцинової блискавки, одержані з cjun або c-fos; послідовності, одержані з константних областей легких ланцюгів каппа або лямбда; синтетичні послідовності, такі як мотиви спіраль-петля-спіраль (Muller et al. (1998) FEBS Lett. 432:45-49), coil-coil мотиви і т.д., або інші загальноприйняті мультимеризуючі домени, відомі в даній галузі. У деяких варіантах злитий компонент містить домен, одержаний з імуноглобуліну, наприклад з IgG, IgM або IgA людини. У конкретних варіантах одержаний з імуноглобуліну домен може бути вибраний з групи, яка складається з Fc-домену IgG, важкого ланцюга IgG і легкого ланцюга IgG. Fc-домен IgG може бути вибраний з ізотипів IgG1, IgG2, IgG3 і IgG4, а також будь-якого алотипу в кожній групі ізотипів. У одному прикладі пастки VEGF, згідно з винаходом, мультимеризуючим компонентом є Fc-домен IgG4 (SEQ ID NO:29). Створення укорочених міні-пасток VEGF У одному варіанті пастки, згідно з винаходом, укорочену міні-пастку VEGF, що містить два або більше злитих поліпептиди, згідно з винаходом, створюють, піддаючи вихідну пастку, яка має МС, що містять С-область, впливу умов, при яких відщеплюються один або декілька МС, що містять С-область. Одержана в результаті укорочена міні-пастка може бути продуктом повного і часткового розщеплення вихідної пастки. МС, що містить С-область, може являти собою будь-який МС, здатний взаємодіяти з іншим МС з утворенням структури більш високого порядку, наприклад димеру або тримеру. С-область може бути створена в МС в будь-якому необхідному положенні. У світлі інструкцій, представлених в прикладах нижче, фахівець в даній галузі зможе вибрати необхідний сайт для створення С-області на основі потрібних властивостей одержуваних в результаті укорочених пасток, наприклад молекулярної маси, мономерної або димерної структури і т.д. У конкретному варіанті С-область являє собою сайт розщеплення тромбіном (LVPRGS) (SEQ ID NO:6), вбудований в домен FcΔCl після N-кінцевої послідовності СРРС (SEQ ID NO:1). У даному варіанті конструкція повно розмірної вихідної пастки VEGF експресується в клітині у вигляді Fc-міченого білка, забезпечуючи таким чином уловлювання і очищення, наприклад, з використанням колонки з білком А. Після утворення димеру і ковалентного скріплення по одному або обома залишками цистеїну послідовності СРРС (SEQ ID NO:1) димер піддають впливу тромбіном в умовах, при яких відщеплюються один або обидва домени FcΔCl, так що утворюються укорочені димерні міні-пастки, що мають молекулярну масу приблизно 50 кД-90 кД, і володіють афінністю по відношенню до VEGF, порівнянної з афінністю вихідної пастки. Фахівець в даній галузі може регулювати умови розщеплення, щоб переважно утворювати продукт часткового розщеплення або продукт повного розщеплення, при цьому варіант умов розщеплення вибирають на основі потреби в конкретному продукті, що володіє конкретними властивостями, такими як молекулярна маса. У конкретному варіанті С-область є сайтом розщеплення тромбіном (LVPRGS) (SEQ ID NO:6), вбудованим в домен FcΔCl на N-кінці по відношенню до послідовності СРРС (SEQ ID NO:1). Після утворення димеру і ковалентного скріплення по одному або обом залишкам цистеїну послідовності СРРС (SEQ ID NO:1) димер піддають впливу тромбіну в умовах, при яких виникають один або обидва домени FcΔCl і утворюються укорочені мономерні міні-пастки. Мономерна укорочена міні-пастка, утворена таким чином, містить рецепторний компонент, невеликий фрагмент Fc і має розмір приблизно 25 кД, і проявляє знижену афінність по відношенню до VEGF в порівнянні з укороченою химерною пасткою і повнорозмірною вихідною пасткою. Показано, що подібна мономерна пастка, одержана у вигляді рекомбінантного білка, має KD приблизно 1 нМ. Створення міні-пасток VEGF 6 UA 105625 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В одному варіанті винахід належить до міні-пасток VEGF, які мають один або декілька доменів рецепторних компонентів (R1R2)X і/або (R1R3)Y, де Х1, Y1 і R1, R2 і R3 мають значення, визначені вище, і необов'язково партнер в злитті, який переважно є доменом МС, який являє собою амінокислотну послідовність довжиною від 1 до приблизно 200 амінокислот, що містить щонайменше один залишок цистеїну, де щонайменше один залишок цистеїну здатний утворювати дисульфідний зв'язок із залишком цистеїну, присутнім в МС іншого злитого поліпептиду (сМС). сМС може знаходитися на N-кінці або С-кінці злитого поліпептиду або між двома доменами рецепторних компонентів. У одному конкретному варіанті цистеїн додають до С-кінця компонента рецептора VEGF, наприклад R1R2C, який дозволяє злитому поліпептиду утворювати ковалентні димери за допомогою утворення ковалентного дисульфідного зв'язку між залишком цистеїну на С-кінці одного злитого поліпептиду і залишком цистеїну на С-кінці іншого злитого поліпептиду. У даному ілюстративному прикладі міні-пастка є димером злитого поліпептиду, показаного в SEQ ID NO:2, де кожний злитий поліпептид (R1R2-cMC або R1R2C) має молекулярну масу приблизно 23,0 кД. У іншому варіанті сМС є послідовністю 4 амінокислот (ХХХХ) (SEQ ID NO:11), де X означає будь-яку амінокислоту і послідовність містить щонайменше один залишок цистеїну. У конкретному варіанті сМС додають до С-кінця домену рецепторного компонента. У більш конкретному варіанті послідовність з 4 амінокислот являє собою ACGC (SEQ ID NO:4) і сМС утворює два дисульфідні зв'язки із залишками цистеїну, присутніми у другому злитому поліпептиді. Як показано нижче (таблиця 2), обидві наведені як приклад міні-пастки виявляють афінність по відношенню до VEGF, порівнянну з афінністю вихідної пастки. Терапевтичні застосування Міні-пастки VEGF, згідно з винаходом, терапевтично застосовні для лікування будь-якого захворювання або стану, який поліпшується, ослаблюється, придушується або запобігається при видаленні, інгібуванні або зменшенні кількості VEGF. Необмежувальний список конкретних станів, що поліпшуються інгібуванням або зменшенням кількості VEGF, включає клінічні стани, які характеризуються надмірною проліферацією ендотеліальних клітин судин, проникністю судин, набряком або запаленням, такі як набряк головного мозку, пов'язаний з ушкодженням, інсультом або пухлиною; набряк, пов'язаний із запальними захворюваннями, такими як псоріаз або артрит, включаючи ревматоїдний артрит; астму; генералізований набряк, пов'язаний з опіками; асцит і плевральний випіт, пов'язаний з пухлинами, запаленням або травмою; хронічне запалення дихальних шляхів; синдром капілярного витоку; сепсис; хворобу нирок, пов'язану з підвищеним просочуванням білка; і очні захворювання, такі як пов'язана з віком дегенерація жовтої плями і діабетична ретинопатія. Композиції, згідно з винаходом, терапевтично застосовні для лікування широкої безлічі захворювань, пов'язаних з підвищеними рівнями VEGF. Наприклад, запалення з аномальним підвищенням Th2 і ремоделюваня дихальних шляхів характерні для патогенезу астми (дивись наприклад Elias et al. (1999) J. Clin. Invest. 104:1001-6). Підвищені рівні VEGF виявлені в тканинах і біологічних зразках пацієнтів з астмою, які прямо корелюють з активністю захворювання (Lee et al. (2001) J. Allergy Clin. Immunol. 107:1106-1108) і зворотно корелюють з діаметром дихальних шляхів і чутливістю дихальних шляхів. Крім того, передбачалося, що VEGF робить внесок в набряк тканини при астмі. Іншим захворюванням, пов'язаним з підвищеним рівнем VEGF, є аденокарцинома протоків підшлункової залози (PDAC). Зазначена злоякісна пухлина часто має осередок посиленої проліферації ендотеліальних клітин і часто надекспресує VEGF (Ferrara (1999) J. Моl. Med. 77:527-543). PDAC є причиною більше 20 % смертельних випадків внаслідок злоякісних пухлин шлунково-кишкового тракту, що робить дане захворювання четвертим з найбільш поширених причин пов'язаної зі злоякісними пухлинами смертності в США і інших промислово розвинених країнах. Експериментальні дані свідчать про важливу роль VEGF в розвитку злоякісної пухлини підшлункової залози, таким чином, інгібітор VEGF є ефективним як терапевтичний засіб для ослаблення росту пухлини всередині підшлункової залози і регіональних і дистальних метастазів. Менша за розміром неглікозильована міні-пастка, експресована в Е. соlі (приклад 4), глікозильована міні-пастка, експресована в клітинах СНО (приклад 5), або заснована на рецепторі мономерна пастка (приклад 6) має оптимізовані характеристики для локальної/інтравітреальної доставки, тобто більш короткий час напівжиття в сироватці для більш швидкого кліренсу і міні-мізації небажаного системного впливу. Крім того, внаслідок свого меншого розміру міні-пастка має здатність проникати через внутрішню обмежувальну мембрану (ILM) в око і дифундувати через склоподібне тіло до сітківки/пігментного епітеліального шару сітківки (RPE), що допоможе лікувати хворобу сітківки. Крім того, міні-пастку можна використати 7 UA 105625 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 для локального введення при лікуванні такої очної хвороби, як неоваскуляризація судинної оболонки ока, діабетичний макулярний набряк, проліферативна діабетична ретинопатія, неоваскуляризація рогівки/відторгнення трансплантата. Крім того, міні-пастку можна застосовувати в будь-якій ситуації, коли потрібне тимчасове (короткочасне) блокування VEGF, наприклад, щоб уникнути хронічного впливу блокади VEGF, наприклад при лікуванні псоріазу. Серйозною проблемою, що призводить до несприятливого кінця після операції з приводу глаукоми, є раннє запалення і ангіогенез, а також дуже швидке загоєння рани. Відповідно пастки VEGF, згідно з винаходом, можуть бути ефективно використані як ад'юванти при оперуванні глаукоми, щоб запобігти ранньому гем- і лімфангіогенезу і рекрутуванню макрофагів до фільтраційної подушки після операції з приводу глаукоми і поліпшити результат операції. Комбінована терапія У численних варіантах пастка VEGF може бути введена в комбінації з одним або декількома додатковими сполуками або терапевтичними засобами, включаючи другу молекулу пастки VEGF, хемотерапевтичний засіб, хірургію, катетерні пристрої і опромінення. Комбінована терапія включає в себе введення одного фармацевтичного дозованого препарату, який містить пастку VEGF, і одного або декількох додаткових засобів; а також введення пастки VEGF і одного або декількох додаткових засобів в своїх окремих фармацевтичних дозованих препаратах. Наприклад, пастка VEGF і цитотоксичний засіб, хемотерапевтичний засіб або інгібуючий ріст засіб можуть бути введені пацієнту разом в одному дозованому препараті, такому як комбінований препарат, або кожний засіб може бути введений у вигляді окремого дозованого препарату. У тому випадку, коли використовують окремі дозовані препарати, VEGFспецифічний злитий поліпептид, згідно з винаходом, і один або декілька додаткових засобів можуть бути введені одночасно або в окремі періоди часу зі зсувом, наприклад послідовно. Термін "цитотоксичний засіб" в значенні, що використовується в даному описі, належить до речовини, яке інгібує або запобігає функціонуванню клітин і/або спричиняє руйнування клітин. 131 125 90 186 Мається на увазі, що термін включає радіоактивні ізотопи (наприклад, І , І , Y і Re ), хемотерапевтичні засоби і токсини, такі як ферментативно активні токсини з бактерій, грибів, рослин або тварин або їх фрагменти. "Хемотерапевтичним засобом" є хімічна сполука, застосовна для лікування злоякісної пухлини. Приклади хемотерапевтичних засобів включають алкілуючі агенти, такі як тіотепа і циклофосфамід (Cytoxan®); алкілсульфонати, такі як бусульфан, імпросульфан і піпосульфан; азиридини, такі як бензодопа, карбоквон, метуредопа і уредопа; етиленіміни і метилмеламіни, включаючи альтретамін, триетиленмеламін, триетиленфосфорамід, триетилентіофосфорамід і триметилолмеламін; азотисті іприти, такий як хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамід, естрамустин, іфосфамід, мехлоретамин, гідрохлорид оксиду мехлоретаміну, мелфалан, новембіхін, фенестерин, преднімустин, трофосфамід, урациловий іприт; нітрозосечовини, такі як кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, німустин, ранімустин; антибіотики, такі як аклациноміцин, актиноміцин, аутраміцин, азасерин, блеоміцини, кактиноміцин, каліхеаміцин, карабіцин, карміноміцин, карзинофілін, хромоміцини, дактиноміцин, даунорубіцин, деторубіцин, 6-діазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубіцин, епірубіцин, езорубіцин, ідарубіцин, марцеломіцин, мітоміцини, мікофенолова кислота, ногаламіцин, оливоміцини, пепломіцин, потфіроміцин, пуроміцин, квеламіцин, родорубіцин, стрептонігрин, стрептозоцин, туберцидин, убенімекс, зиностатин, зорубіцин; антиметаболіти, такі як метотрексат і 5-фторурацил (5-FU); аналоги Фотієвої кислоти, такі як деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурину, такі як флударабін, 6-меркаптопурин, тіаміприн, тіогуанін; аналоги піримідину, такі як анцитабін, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабін, дидезоксиуридин, доксифлуридин, еноцитабін, флоксуридин; андрогени, такі як калустерон, пропіонат дромостанолону, епітіостанол, мепітіостан, тестолактон; антиадренальні засоби, такі як аміноглютетимід, мітотан, трилостан; поповнював фолієвої кислоти, такий як фолінова кислота; ацеглатон; глікозид альдофосфаміду; амінолевулінова кислота; амсакрин; бестрабуцил; бісантрен; едатраксат; дефофамін; демекольцин; діазиквон; елфорнітин; ацетат еліптинія; етоглюцид; нітрат галію; гідроксисечовину; лентинан; лонідамін; мітогуазон; мітоксантрон; мопідамол; нітракрин; пентостатин; фенамет; пірарубіцин; подофілінова кислота; 2-етилгідразид; прокарбазин; PSK®; разоксан; сизофіран; спірогерманій; тенуазонова кислота; триазиквон; 2,2',2"трихлортриетиламін; уретан; віндезин; дакарбазин; маномустин; мітобронітол; мітолактол; піпоброман; гацитозин; арабінозид ("Ага-С"); циклофосфамід; тіотепа; таксани, наприклад паклітаксел (Taxol®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, і доцетаксел (Taxotere®; Aventis Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабін; 6-тіогуанін; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платини, такі як цисплатин і карбоплатин; вінбластин; платина; етопозид (VP-16); іфосфамід; мітоміцин С; мітоксантрон; вінкристин; вінорелбін; навелбін; новантрон; теніпозид; дауноміцин; 8 UA 105625 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 аміноптерин; кселода; ібандронат; СРТ-11; інгібітор топоізомерази RFS 2000; дифторметилорнітин (DMFO); ретіноєва кислота; еспераміцини; капецитабін; і фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-кого з вказаних вище засобів. Також в дане визначення включені антигормональні засоби, які діють, регулюючи або інгібуючи дію гормонів на пухлини, такі як антиестрогени, включаючи, наприклад, тамоксифен, ралоксифен, інгібуючі ароматазу 4(5)-імідазоли, 4-гідрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон і тореміфен (Fareston); і антиандрогени, такі як флутамід, нілутамід, бікалутамід, леупролід і госерелін; і фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-кого з вказаних вище засобів. "Інгібуючий ріст засіб" при використанні в даному описі належить до сполуки або композиції, яка інгібує ріст клітини, особливо клітини злоякісної пухлини, або in vitro, або in vivo. Приклади інгібуючих ріст засобів включають засоби, які блокують проходження клітинного циклу (в іншій фазі, відмінній від S-фази), такі як засоби, які індукують затримку в G1 і затримку в М-фазі. Класичні блокатори фази М включають алкалоїди барвінку (вінкристин і вінбластин), Taxol® і інгібітори топоізомерази II, такі як доксорубіцин, епірубіцин, даунорубіцин, етопозид і блеоміцин. Вказані засоби, які затримують G1, також розповсюджуються на затримку S-фази, наприклад ДНК-алкілуючі агенти, такі як тамоксифен, преднізон, дакарбазин, мехлоретамін, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил і Ага-С. Способи введення Винахід належить до способів лікування, які включають в себе введення суб'єкту ефективної кількості пастки VEGF, згідно з винаходом. У переважному аспекті пастка значною мірою очищена (наприклад, по суті не містить речовин, які обмежують її дію або дають небажані побічні ефекти). Суб'єктом переважно є ссавець і найбільш переважно людина. Відомі різні системи доставки, які можуть бути використані для введення засобу, згідно з винаходом, наприклад інкапсулювання в ліпосоми, мікрочастинки, мікрокапсули, рекомбінантні клітини, здатні експресувати сполуку, опосередкований рецепторами ендоцитоз (дивись наприклад Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), конструювання нуклеїнової кислоти у вигляді частини ретровірусного або іншого вектора і т.д. Способи введення можуть бути ентеральними або парентеральними і включають без обмеження інтрадермальний, внутрішньом'язовий, внутрішньочеревинний, внутрішньовенний, підшкірний, інтраназальний, внутрішньоочний і пероральний способи. Сполуки можуть бути введені будь-яким зручним способом, наприклад, за допомогою інфузії або болюсної ін'єкції, шляхом всмоктування через епітеліальні або шкірно-слизові вистильні (наприклад слизову оболонку ротової порожнини, слизову оболонку прямої кишки і кишечнику і т.д.), і можуть бути введені разом з іншими біологічно активними агентами. Введення може бути системним або локальним. Введення може бути терміновим або хронічним (наприклад, щодня, щотижня, щомісяця і т.д.) або в комбінації з іншими засобами. Також може бути застосоване легеневе введення, наприклад, з використанням інгалятора або розпилювача, і препарат з агентом для аерозолю. У іншому варіанті активний агент може бути доставлений у везикулах, зокрема ліпосомах, в системі контрольованого вивільнення або в насосі. У іншому варіанті, коли активним агентом, згідно з винаходом, є нуклеїнова кислота, що кодує білок, нуклеїнова кислота може бути введена in vivo, щоб підтримувати експресію білка, що кодується нею, за допомогою конструювання її у вигляді частини відповідного вектора для експресії нуклеїнової кислоти і введення його таким чином, щоб він став внутрішньоклітинним, наприклад, використовуючи ретровірусний вектор (дивись, наприклад, патент США № 4980286), прямою ін'єкцією або використовуючи бомбардування мікрочастинками, або покривання ліпідами, або за допомогою рецепторів клітинної поверхні або трансфікуючих агентів, або шляхом введення його у зв'язку з пептидом, подібним гомеобоксу, який, як відомо, проникає в ядро (дивись, наприклад, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868) і т.д. Альтернативно нуклеїнова кислота може бути введена всередину клітини і включена в ДНК клітини-хазяїна для експресії за допомогою гомологічної рекомбінації. У конкретному варіанті може бути бажаним введення фармацевтичних композицій, згідно з винаходом, локально в необхідну для лікування область; вказане можна здійснити, наприклад, без обмеження за допомогою локальної інфузії під час операції, місцевим застосуванням, наприклад, за допомогою ін'єкції, за допомогою катетера або з допомогою імплантату, при цьому імплантат є пористим, непористим або гелеподібним матеріалом, включаючи мембрани, такі як силіконові мембрани, волокна або промислові замінники шкіри. Композиція, застосовна при практичному здійсненні способів, згідно з винаходом, може бути рідиною, що містить агент, згідно з винаходом, в розчині, в суспензії або і в тому і в іншому. Термін "розчин/суспензія" належить до рідкої композиції, в якій перша частина активного агента 9 UA 105625 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 присутня в розчині, а друга частина активного агента присутня в формі частинок в суспензії в рідкому матриксі. Рідка композиція також включає гель. Рідка композиція може бути водною або в формі мазі. Крім того, композиція може приймати форму твердої частинки, яка може бути введена в око, наприклад між оком і віком або в кон'юнктивальний мішечок, де вивільняється пастка VEGF. Вивільнення з такої частки звичайно відбувається до рогівкової оболонки або через слізну рідину, або безпосередньо до самої рогівки, з якою тверда частинка звичайно знаходиться в прямому контакті. Тверді частинки, придатні для імплантації в око звичайно головним чином складаються з біозруйновний або небіозруйновний полімерів. Водний розчин і/або суспензія можуть бути в формі очних крапель. Необхідна доза активного агента може бути виміряна введенням відомої кількості крапель в око. Наприклад, у разі об'єму краплі 25 мкл введення 1-6 крапель буде доставляти 25-150 мкл композиції. Водна суспензія або розчин/суспензія, застосовні при практичному здійсненні способів, згідно з винаходом, можуть містити один або декілька полімерів як суспендуючих агентів. Застосовні полімери включають водорозчинні полімери, такі як полімери целюлози, і водонерозчинні полімери, такі як перехреснозшиті карбоксилвмісні полімери. Водна суспензія або розчин/суспензія, згідно з даним винаходом, переважно є в'язкими або мукоадгезивними або ще більш переважно як в'язкими, так і мукоадгезивними. У іншому варіанті композиція, застосовна при практичному здійсненні способів, згідно з винаходом, є желатинізованою in situ водною композицією. Така композиція містить желатинізуючий агент в концентрації, ефективній для стимулювання гелеутворення при контакті з оком або з слізною рідиною. Відповідні желатинізуючі агенти включають, але не обмежені вказаним, термоотверджувані полімери. Термін "желатинізуючий in situ" в значенні, що використовується в даному описі включає не тільки рідини з низькою в'язкістю, які утворюють гелі при контакті з оком або слізною рідиною, але також включає більш в'язкі рідини, такі як напіврідкі і тиксотропні гелі, які мають значною мірою підвищену в'язкість або густину гелю при введенні в око. Способи діагностики і скринінгу Пастки VEGF, згідно з винаходом, можна використати діагностично і/або в способах скринінгу. Наприклад, пастка може бути використана для спостереження за рівнями VEGF під час клінічного дослідження, щоб оцінити ефективність лікування. У іншому варіанті способи і композиції, згідно з даним винаходом, використовують для відбору індивідуумів для введення в клінічне дослідження, щоб ідентифікувати людей, що мають, наприклад, дуже високий або дуже низький рівень VEGF. Пастки можна використати в способах, відомих в даній галузі, пов'язаних з локалізацією і активністю VEGF, наприклад, при візуалізації, вимірюванні його рівнів у відповідних фізіологічних зразках, в діагностичних способах і т.д. Пастки, згідно з винаходом, можна використати в скринінговому аналізі in vivo і in vitro, щоб оцінити кількість присутнього незв'язаного VEGF, наприклад в скринінговому способі для ідентифікації агентів, що тестуються, здатних знижувати експресію VEGF. Більш широко пастки, згідно з винаходом, можна використовувати в будь-якому аналізі або способі, в якому потрібне кількісне вимірювання і/або виділення VEGF. Фармацевтичні композиції Даний винахід також належить до фармацевтичних композицій, які містять міні-пастку VEGF, згідно з винаходом. Такі композиції містять терапевтично ефективну кількість однієї або декількох міні-пасток і фармацевтично прийнятний носій. Термін "фармацевтично прийнятний" означає схвалений регулюючим відомством федерального уряду або уряду штату або вказаний в фармакопейному списку США або іншій загальновизнаній фармакопеї для застосування на тваринах, і більш конкретно на людині. Термін "носій" належить до розріджувача, ад'юванту, ексципієнта або наповнювача, з яким вводять терапевтичний засіб. Такими фармацевтичними носіями можуть бути стерильні рідини, такі як вода і масла, включаючи масла з нафти, масла і олії тваринного, рослинного або синтетичного походження, такі як арахісова олія, соєва олія, мінеральне масло, кунжутна олія і тому подібні. Відповідні фармацевтичні ексципієнти включають крохмаль, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, борошно, крейду, силікагель, стеарат натрію, моностеарат гліцерину, тальк, хлорид натрію, сухе знежирене молоко, гліцерин, пропіленгліколь, воду, етанол і тому подібне. Композиція при бажанні також може містити невеликі кількості зволожувачів або емульгаторів, або агентів для забуферення рН. Вказані композиції можуть мати форму розчинів, суспензій, емульсії, таблеток, пілюль, капсул, порошків, препаратів тривалого вивільнення і тому подібні. Приклади відповідних фармацевтичних носіїв описані в "Remington's Pharmaceutical Sciences", E.W. Martin. Міні-пастка VEGF, згідно з винаходом, може бути приготована у вигляді нейтральної або сольової форми. Фармацевтично прийнятні солі включають солі, утворені з вільними 10 UA 105625 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 аміногрупами, такі як солі, одержані з соляної, фосфорної, оцтової, щавлевої, винної кислот і т.д., і солі, утворені з вільними карбоксильними групами, такі як солі, одержані з гідроксидами натрію, калію, амонію, кальцію, заліза, ізопропіламіном, триетиламіном, 2-етиламіноетанолом, гістидином, прокатом і т.д. Крім того, водні композиції, застосовні для практичного здійснення способів, згідно з винаходом, мають сумісні з оком рН і осмотичний тиск. Один або декілька прийнятних для очей агентів для коректування рН і/або буферних агентів можуть бути введені в композицію, згідно з винаходом, включаючи кислоти, такі як оцтова, борна, лимонна, молочна, фосфорна і соляна кислоти; основи, такі як гідроксид натрію, фосфат натрію, борат натрію, цитрат натрію, ацетат натрію і лактат натрію; і буфери, такі як цитрат/декстроза, бікарбонат натрію і хлорид амонію. Такі кислоти, основи і буфери вводять в кількості, необхідній для підтримки рН композиції в прийнятних для ока межах. Одна або декілька прийнятних для ока солей можуть бути включені в композицію в кількості, достатній для доведення осмотичного тиску композиції до прийнятних для ока меж. До таких солей належать солі, що мають катіони натрію, калію або амонію і аніони хлориду, цитрату, аскорбату, борату, фосфату, бікарбонату, сульфату, тіосульфату або бісульфату. Кількість пастки, яка буде ефективною у разі її терапевтичного запланованого застосування можна визначити стандартними клінічними способами, заснованими на даному описі. Крім того, необов'язково можна використати аналізи in vitro, що допомагають ідентифікувати оптимальні межі доз. Загалом, відповідні межі доз для внутрішньовенного введення звичайно становлять приблизно 50-5000 мікрограм активної сполуки на кілограм маси тіла. Відповідні межі доз для інтраназального введення звичайно складають приблизно від 0,01 пг/кг маси тіла до 1 мг/кг маси тіла. Ефективні дози можуть бути екстрапольовані на основі кривих дозової залежності, одержаних в тесті-системах in vitro або в моделях на тваринах. Для системного введення терапевтично ефективна доза може бути спочатку визначена в аналізах in vitro. Наприклад, доза може бути розроблена в моделях на тваринах, щоб досягнути меж циркулюючої концентрації, які включають ІС50, визначену в культурі клітин. Таку інформацію можна використати для більш точного визначення доз, прийнятних для людини. Вихідні дози також можна оцінити на основі даних in vivo, наприклад, в моделях на тваринах, використовуючи способи, які добре відомі в даній галузі. Фахівець в даній галузі без великих зусиль може оптимізувати введення людині на основі даних, одержаних на тваринах. Дозова кількість і інтервал можна коректувати індивідуально, щоб забезпечити рівні сполук в плазмі, які є достатніми для підтримки терапевтичного ефекту. У разах локального введення або вибіркового поглинання ефективна локальна концентрація сполук може бути не пов'язана з концентрацією в плазмі. Фахівець в даній галузі зможе оптимізувати терапевтично ефективні локальні дози без надмірного експериментування. Кількість сполуки, що вводиться, звичайно, буде варіювати в залежності від суб'єкта, що піддається лікуванню, маси суб'єкта, тяжкості хвороби, способу введення і рішення лікаря. Терапію можна повторювати періодично поки симптоми виявляються або навіть коли вони не реєструються. Терапія може проводитися окремо або в комбінації з іншими лікарськими засобами. Трансфекція клітин і генна терапія Даний винахід належить до застосування нуклеїнових кислот, що кодують злитий поліпептид, згідно з винаходом, для трансфекції клітин in vitro і in vivo. Вказані нуклеїнові кислоти можуть бути вбудовані в будь-який з ряду добре відомих векторів для трансфекції клітин-мішеней і організмів. Нуклеїнові кислоти трансфікують в клітини ex vivo і in vivo за допомогою взаємодії вектора і клітини-мішені. Композиції вводять (наприклад, за допомогою ін'єкції в м'яз) суб'єкту в кількості, достатній, щоб викликати терапевтичну відповідь. Кількість, адекватну для здійснення вказаного, визначають як "терапевтично ефективну дозу або кількість". У іншому аспекті винахід належить до способу зниження рівнів VEGF у людини або іншої тварини, який включає в себе трансфекцію клітини нуклеїновою кислотою, що кодує злитий поліпептид, згідно з винаходом, при цьому нуклеїнова кислота містить промотор, що індукується, функціонально зв'язаний з нуклеїновою кислотою, що кодує злитий поліпептид або міні-пастку. Способи генної терапії при лікуванні або профілактиці хвороби людини дивись, наприклад, у Van Brant (1998) Biotechnology 6:1149-1154. Набори Винахід також належить до предметів виробництва, що містять пакувальний матеріал і фармацевтичний засіб, який знаходиться в пакувальному матеріалі, при цьому фармацевтичний засіб містить щонайменше одну пастку VEGF, що складається з двох або 11 UA 105625 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 більше злитих поліпептидів, згідно з винаходом, і пакувальний матеріал містить етикетку або вкладиш в упаковку, на якому указано, що VEGF-специфічний злитий поліпептид можна застосовувати для лікування опосередкованого VEGF захворювання або стану. Трансгенні тварини Винахід включає трансгенних тварин, відмінних від людини, які експресують пастку, згідно з винаходом. Трансгенна тварина може бути одержана введенням нуклеїнової кислоти в чоловічий пронуклеус заплідненої яйцеклітини, наприклад мікроін'єкцією, ретровірусною інфекцією, і забезпеченням можливості для розвитку яйцеклітини у псевдовагітної приймальної самиці. Будь-які регуляторні або інші послідовності, що застосовуються в експресуючих векторах, можуть утворювати частину трансгенної послідовності. Тканинноспецифічна регуляторна послідовність(ті) можуть бути оперативно зв'язані з трансгеном, щоб керувати експресією трансгену в конкретних клітинах. Трансгенна тварина, відмінна від людини, що експресує злитий поліпептид або міні-пастку, згідно з винаходом, придатна для безлічі застосувань, включаючи застосування як засобів одержання такого злитого поліпептиду. Крім того, трансген може бути поміщений під контроль промотору, що індукується так, щоб експресію злитого поліпептиду або міні-пастки можна було регулювати, наприклад, введенням малої молекули. Конкретні варіанти У описаних нижче експериментах створювали менші за розміром пастки VEGF і досліджували їх здатність зв'язувати VEGF. Такі міні-пастки переважно використовуються в конкретних застосуваннях. Наприклад, деякі стани або захворювання переважно можна лікувати за допомогою локального введення пастки VEGF до конкретного органа, тканини або клітини, а не системним введенням. У одному ілюстративному прикладі міні-пасток, згідно з винаходом, створювали меншу за розміром пастку VEGF прямим розщепленням димеризованої пастки VEGF, що має область розщеплення (С-область), створену в домені Fc (приклад 2). Укорочена пастка виявляла порівнянну афінність по відношенню до VEGF і час напівжиття як і повнорозмірна вихідна пастка. У прикладах 3-5 описана конструкція злитого поліпептиду, що має компонент рецептора VEGF і мультимеризуючий компонент, що складається з одного або двох залишків цистеїну. Вимірювання афінності показали, що неглікозильований злитий поліпептид, експресований в Е. соlі або глікозильований поліпептид, експресований в клітинах СНО, мали порівнянну афінність скріплення для VEGF, як і повнорозмірна вихідна пастка. Приклад 6, крім того, ілюструє мономерну пастку VEGF, що складається з (R1R2) 2, яка здатна зв'язувати і інгібувати VEGF. У прикладі 7 описана конструкція міні-пастки VEGF (SEQ ID NO:26), що має високу афінність скріплення VEGF в порівнянні з повнорозмірною пасткою (SEQ ID NO:10). Інші відмітні ознаки винаходу будуть очевидними в ході подальшого опису зразкових варіантів, які наведені для ілюстрації винаходу і не призначені для його обмеження. Приклади Наступні приклади наведені з тим, щоб представити фахівцям в даній галузі повне розкриття і опис того, як одержувати і застосовувати способи і композиції, згідно з винаходом, і не призначені для обмеження об'єму того, що автори винаходу розглядають як свій винахід. Були зроблені зусилля для того, щоб забезпечити точність відносно використовуваних числових значень (наприклад, кількостей, температури і т.д.), але потрібно брати до уваги деякі експериментальні помилки і відхилення. Якщо не обумовлено особливо, частини є частинами по масі, молекулярна маса являє собою середню молекулярну масу, температура наведена в градусах по Цельсію і тиск є атмосферним або близьким до атмосферного. Приклад 1. Конструкція Flt1D2.Flk1D3.FcΔCl(a) Конструкція вихідної пастки VEGF Flt1D2.Flk1D3.FcΔCl(a) (SEQ ID NO:7-8), VEGFR1R2.FcΔCl(a) (SEQ. ID NO:9-10) і Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) (SEQ ID NO:12-13) детально описана в публікації РСТ WO/0075319, спеціально включеній в даний опис у вигляді посилання в повному об'ємі. Також в WO/0075319 описані способи конструювання і експресії конструкцій нуклеїнової кислоти, що кодують пастки VEGF, способи реєстрації і вимірювання скріплення пастки VEGF з VEGF, способи визначення стехіометрії скріплення VEGF з використанням аналізу ВІАсоrе і фармакокінетичні аналізи. Приклад 2. Розщеплена тромбіном димерна міні-пастка VEGF Конструкцію VEGFR1R2.FcΔCl(a) (SEQ ID NO:9-10) модифікували інерцією сайта розщеплення тромбіном після СРРС (SEQ ID NO:1) домену Fc. Очищену пастку VEGF (5 мкг) інкубували з тромбіном (Novagen) в 20 мМ тріс-НСl, рН 8,4, 50 мМ NaCl, 2,5 мМ СаСl2 протягом 16 година при 37 °C. Контролі включали білок для контролю розщеплення (ССР) і білок вихідної 12 UA 105625 C2 5 10 15 пастки VEGF, інкубований без тромбіну. SDS-ПААГ-аналіз (тріс-гліциновий 4-20 % гель; 5 мкг білка на доріжку) підтвердив правильне розщеплення (результати не показані). Визначення афінності. Kd зв'язування кожної пастки VEGF з hVEGF165 визначали, як описано в WO/0075319, для вихідної пастки VEGF, нерозщепленої пастки VEGF, що містить сайт розщеплення тромбіном ("нерозщеплена пастка VEGF"), розщепленої міні-пастки VEGF і рекомбінантної мономерної R1R2-myc myc his. Більш конкретно здатність пасток блокувати VEGF165-залежне фосфорилування рецептора визначали, використовуючи первинні ендотеліальні клітини людини (HUVEC). VEGF165 інкубували в присутності різних концентрацій пасток, що тестуються і суміш додавали до HUVEC, щоб стимулювати фосфорилування тирозину VEGFR2. При субстехіометричних концентраціях пастки VEGF, незв'язаний VEGF індукував фосфорилування рецептора. Однак при молярному відношенні 1:1 або більше пастки VEGF до ліганду спостерігали повне блокування передачі сигналу рецептором, встановивши, що одна молекула димерної пастки здатна блокувати одну молекулу VEGF165 людини. Таким чином, висока афінність скріплення пастки VEGF у відношенні VEGF приводить до утворення комплексу, який запобігає взаємодії VEGF з рецепторами клітинної поверхні. Еквівалентні результати одержали у разі ідентичних експериментів по інгібуванню фосфорилування для вихідної пастки VEGF, нерозщепленої пастки VEGF і розщепленої міні-пастки VEGF. Результати показані в таблиці 1. Таблиця 1 Пастка Вихідна пастка VEGF Нерозщеплена пастка VEGF Розщеплена міні-пастка VEGF Мономер R1R2-myc myc his Кінетична швидкість дисоціації (1/сек.) -5± 5,51 × 10 0,94 % -5± 4,93 × 10 0,70 % -5± 5,46 × 10 0,62 % -3± 6,74 × 10 0,38 % Т1/2(год.) 3,5 3,9 3,53 0,028 20 25 30 35 40 45 50 Приклад 3. Конструкція плазмід, що кодують міні-пастки VEGF Міні-пастки VEGF конструювали з попередника вихідної пастки VEGF, VEGFR1R2. FcΔCl(a) (SEQ ID NO:9-10), в якому три амінокислоти гліцин-аланін-пролін служили як лінкер між Flk1 D3 і FcΔCl(a). Дану плазміду рТЕ115 використали для конструювання міні-пасток VEGF оскільки лінкерна послідовність ДНК містила послідовність упізнавання ендонуклеазної рестрикції Srf І, що полегшувало конструювання пастки VEGF. У всіх інших відношеннях пастка VEGF, що кодується рТЕ115, ідентична пастці VEGF VEGFR1R2.FcΔCl(a) (SEQ ID NO:9-10), детально описаної в публікації РСТ WO/0075319. Конструювали дві міні-пастки VEGF з доменами для мультимеризації, що складаються або з одного залишку цистеїну (R1R2C) (SEQ ID NO:2), або амінокислот ACGC (SEQ ID NO:4) (R1R2ACGC) (SEQ ID NO:5), рецепторних компонентів, що додаються до С-кінця, Fit1D2. Flk1D3. Обидві одержані конструкції здатні утворювати гомодимерні молекули, стабілізовані однією (R1R2C) або двома (R1R2ACGC) міжмолекулярними дисульфідними зв'язками. Плазміду рТЕ517 одержували видаленням фрагмента довжиною 690 п.о., викликаного розщепленням ДНК рТЕ115 з допомогою Srf І і Not І, і вбудовуванням фрагмента синтетичної ДНК, утвореного відпалом олігонуклеотидів R1R2NC (SEQ ID NO:14) і R1R2CC (SEQ ID NO:15). Одержана в результаті плазміда кодує R1R2C, яка складається з доменів Flt1D2.Flk1D3, за якими іде залишок цистеїну (SEQ ID NO:23). Подібним чином одержували плазміду рТЕ518 видаленням фрагмента довжиною 690 п.о., викликаного розщепленням ДНК рТЕ115 з допомогою Srf І і Not І, з подальшим лігуваннням фрагмента синтетичної ДНК, утвореного відпалом олігонуклеотидів R1R2NACGC (SEQ ID NO:16) і R1R2CACGC (SEQ ID NO:17). Одержана в результаті плазміда кодує R1R2ACGC, яка складається з доменів Flt1D2. Flk1D3, за якими ідуть амінокислоти ACGC (SEQ ID NO:25). Також конструювали плазміди для керування експресією вказаних міні-пасток в Е. соlі. Використали праймери R1R2N-Ncol (SEQ ID NO:18) і R1R2Cnot1 (SEQ ID NO:19), щоб ампліфікувати фрагмент ДНК рТЕ115, який кодує амінокислоти з G30 по К231 відносно вихідної пастки VEGF (SEQ ID NO:10). Ампліфікація даної послідовності приводила до злиття вихідного кодону метіоніну на 5'-кінці і злиття кодону цистеїну з подальшим стоп-кодоном на 3'-кінці (SEQ ID NO:2). Потім одержаний фрагмент ДНК клонували в сайтах Nco І і Not І експресуючої плазміни E. coli pRG663, одержуючи pRG1102, так щоб експресія R1R2 C була залежна від транскрипції з промотору Ф1.1 фага Т7. Індукція генної експресії з pRG1102 приводить до накопичення R1R2cys в цитоплазмі штаму-хазяїна Е. coli RFJ238. Подібним чином праймери R1R2N-Ncol (SEQ ID NO:18) і R1R2ACGC-Notl (SEQ ID NO:20) використали для ампліфікації 13 UA 105625 C2 5 10 15 20 25 фрагмента ДНК з рТЕ115, який кодує амінокислоти з G30 по К231 (SEQ ID NO:10), одержуючи в результаті злиття вихідного кодону метіоніну на 5'-кінці і злиття кодонів ACGC (SEQ ID NO:4) з подальшим стоп-кодоном на 3'-кінці (SEQ ID NO:5). Потім одержаний фрагмент клонували в сайтах Nco І і Not І експресуючої плазміди Е. coli pRG663, одержуючи pRG1103, так щоб експресія R1R2ACGC залежала від транскрипції з промотору Ф1.1. фага Т7. Індукція генної експресії як з pRG1102, так і з pRG1103 приводила до накопичення R1R2 C або R1R2ACGC відповідно в цитоплазмі штаму-хазяїна Е. coli RFJ238. Приклад 4. Очищення і характеристика міні-пасток YEGF з Е. coli І R1R2C, і R1R2ACGC експресували у вигляді цитоплазматичних білків в Е. coli і очищали одним і тим же способом. Індукція промотору Ф1.1 фага Т7 або в pRG1102, або в pRG1103 в Е. coli K12 штаму RFJ238 приводила до накопичення білка в цитоплазмі. Після індукції клітини збирали центрифугуванням, ресуспендували в 50 мМ тріс-НСl, рН 7,5, 20 мМ EDTA і лізували пропущенням через гомогенізатор для клітин Niro-Soavi. Тільця включення збирали з лізованих клітин центрифугуванням, один раз промивали дистильованої Н20, потім розчиняли в 8М гуанідиній-НСl, 50 мМ тріс-НСl, рН 8,5, 100 мМ сульфіті натрію, 10 мМ тетратіонаті натрію і інкубували при кімнатній температурі протягом 16 годин. Просвітлений надосад фракціонували на колонці S300, зрівноваженій 6М гуанідинієм-НСl, 50 мМ тріс-НСl, рН 7,5. Фракції, що містять R1R2C об'єднували і діалізували проти 6М сечовини, 50 мМ тріс-НСl, рН 7,5. Діалізований білок розбавляли до 2М сечовини, 50 мМ тріс-НСl, рН 8,5, 2 мМ цистеїн, потім повільно перемішували протягом 7 днів при 4 °C. Підданий рефолдингу білок діалізували проти 50 мМ тріс-НСl, рН 7,5, потім наносили на колонку з SP-сефарозою, зрівноважену 50 мМ тріс-НСl, рН 7,5, і елюювали градієнтом NaCl від 0 до 1М в 50 мМ тріс-НСl, рН 7,5. Фракції, що містять R1R2C, об'єднували, концентрували і наносили на колонку Superdex 200, зрівноважену 50 мМ тріс-НСl, рН 7,5, 150 мМ NaCl. Фракції, що містять димер міні-пастки, збирали і об'єднували. За допомогою SDSПААГ визначили молекулярну масу очищеної міні-пастки, що становить приблизно 46 кД. Проводили аналіз ВІАсоrе (як описано в WO/0075319), щоб визначити афінність пастки по відношенню до VEGF, і результати показали, що міні-пастки R1R2C і R1R2ACGC мали афінність до VEGF, порівнянну з афінністю повнорозмірної пастки VEGF (таблиця 2). Таблиця 2 Пастка Пастка VEGF R1R2C R1R2ACGC Кінетична швидкість дисоціації (1/сек.) 5 4,23 × 105 3,39 × 105 3,41 × 10 Ті/2(год.) 4,53 5,68 5,65 30 35 40 45 50 Приклад 5. Експресія міні-пасток VEGF в СНО К1 Експресія міні-пасток VEGF, що кодуються рТЕ517 і рТЕ518 залежить від транскрипції з промотору CMV-MIE людини і приводить до секреції міні-пасток в культуральне середовище при експресії в клітинах СНО. При експресії у вигляді секретованих білків в СНО К1 обидві мініпастки виявляли в кондиціонованих середовищах, і визначення їх молекулярної маси в SDSПААГ свідчило, як і очікувалося, що білки були глікозильовані. Аналіз в SDS-ПААГ також показав, що міні-пастки здатні утворювати гомодимерні молекули, стабілізовані міжмолекулярним дисульфідним зв'язком(ами) між С-кінцевими цистеїнами. Зокрема міні-пастка R1R2C ефективно утворювала ковалентні димери при експресії у вигляді секретованого білка в клітинах СНО. Приклад 6. Конструювання і експресія одноланцюгової міні-пастки VEGF Також конструювали міні-пастку VEGF, в якій не потрібний домен для мультимеризації (SEQ ID NO:24). Дану міні-пастку конструювали безпосереднім злиттям одного домену Flt1D2.Flk1D3 (R1R2) (амінокислоти 30-231 SEQ ID NO:24) з другим доменом Flt1D2.Flk1D3 (R1R2) (амінокислоти 234-435 SEQ ID NO:24) за допомогою лінкера Gly-Pro між рецепторними доменами тандема (амінокислоти 232-233 SEQ ID NO:24). Щоб сконструювати ген, що кодує тандемні домени Flt1D2.Flk1D3, синтезували фрагмент ДНК (Blue Heron Biotechnology), який кодував один домен Flt1D2.Flk1D3, який мінімізував гомологію ДHС з ДНК, що кодує домен Flt1D2.Flk1D3, виявленої в рТЕ115. Одержаний синтезований фрагмент ДНК клонували у вигляді фрагмента Srf I-Not І в сайтах Srf I-Not I pTE115, щоб одержати рТЕ570, яка експресує міні-пастку VEGF R1R2-R1R2 з промотору CMVМІЕ. Коли дану плазміду трансфікують в клітини СНО К1 міні-пастка VEGF R1R2-R1R2 накопичується в культуральному середовищі. Приклад 7. Конструювання і експресія міні-пастки VEGF 14 UA 105625 C2 5 10 Міні-пастку VEGF конструювали, як описано вище, безпосереднім злиттям одного домену Flt1D2.Flk1D3 (R1R2) (амінокислоти 30-231 SEQ ID NO:26) з С-кінцевою послідовністю з дев'яти амінокислот, що закінчується СРРС. Коли таку плазміду трансфікують в клітини СНО К1, мініпастка VEGF з SEQ ID NO:26 секретується в культуральне середовище. Подальше очищення електрофорезом в невідновному SDS-ПААГ, а також простий аналіз світлорозсіяння виявляли молекулу пастки з молекулярною масою приблизно 64 кД. Вказана молекулярна маса свідчить, що був утворений ковалентний димер між двома злитими поліпептидами з SEQ ID NO:26. Схожі експерименти проводили з плазмідами, що кодують злиті поліпептиди з SEQ ID NO:27 і 28, і подібним чином показали, що вказані молекули утворювали гомодимерні пастки. Визначення афінності для зв'язування VEGF-165 людини з пастками EGF, що складаються з димерів з SEQ ID NO:10 і SEQ ID NO:26, показані в таблиці 3. Таблиця 3 Пастка VEGF SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:26 kd (1/сек.) -5 1,79 × 10 -6 6,56 × 10 -6 5,77 × 10 ka (1/Ms) +7 2,73 × 10 +7 2,00 × 10 +7 2,61 × 10 СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ 15 15 KD (M) -13 6,55 × 10 -13 3,28 × 10 -13 2,21 × 10 UA 105625 C2 16 UA 105625 C2 17 UA 105625 C2 18 UA 105625 C2 19 UA 105625 C2 20 UA 105625 C2 21 UA 105625 C2 22 UA 105625 C2 23 UA 105625 C2 24 UA 105625 C2 5 25 UA 105625 C2 5 26 UA 105625 C2 27 UA 105625 C2 28

Дивитися

Додаткова інформація

Автори англійською

Daly Thomas J., Fandl James P., Papadopoulos Nicholas J.

Автори російською

Дейли Томас Дж., Пападопулос Николас Дж.

МПК / Мітки

МПК: A61P 27/02, C12N 15/62, C07K 19/00, A61K 38/18

Мітки: терапевтичне, застосування, пастка

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/35-105625-pastka-vegf-i-terapevtichne-zastosuvannya.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Пастка vegf і її терапевтичне застосування</a>

Подібні патенти