Специфічні для насіння льону промотори

1. Спосіб експресії представляючої інтерес послідовності нуклеїнової кислоти в насінні льону, що включає: (a) одержання химерної конструкції нуклеїнової кислоти, що містить в 5' ® 3' -напрямі транскрипції у вигляді функціонально пов'язаних компонентів: (1) насіннєспецифічний промотор, одержаний з льону; і (2) вказану представляючу інтерес послідовність нуклеїнової кислоти, причому вказана представляюча інтерес нуклеїнова кислота є неприродною відносно вказаного насіннєспецифічного промотору льону; (b) введення вказаної химерної конструкції нуклеїнової кислоти в клітину рослини льону; і (c) вирощування вказаної клітини рослини льону в зрілу рослину льону, здатну зав'язувати насіння, причому вказана представляюча інтерес послідовність нуклеїнової кислоти експресується в насінні під контролем вказаного насіннєспецифічного промотору, де вказаний насіннєспецифічний промотор вибраний з групи промоторів, що включає промотори олеозину, промотори запасного білка 2S і промотори бобово-подібного запасного білка насіння. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що щонайменше один параметр експресії, що додається 2 (19) 1 3 87431 4 (a) послідовність нуклеїнової кислоти, що включає (с) послідовність нуклеїнової кислоти, яка має щонуклеотиди 1-2023, як показано на фігурі 1 (SEQ найменше 65 % ідентичність послідовності з поID NO:1), де Т може бути також U; слідовністю нуклеїнової кислоти (а) або (b); або (b) послідовність нуклеїнової кислоти, яка компле(d) послідовність нуклеїнової кислоти, яка гібридиментарна послідовності нуклеїнової кислоти (а); зується з послідовністю нуклеїнової кислоти (а), (b) (c) послідовність нуклеїнової кислоти, яка має щоабо (с) при жорстких умовах гібридизації. найменше 65 % ідентичність послідовності нуклеї7. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що вканової кислоти (а) або (b); або заний насіннєспецифічний промотор льону міс(d) послідовність нуклеїнової кислоти, яка гібридитить: зується з послідовністю нуклеїнової кислоти (а), (b) (a) послідовність нуклеїнової кислоти, що включає або (с) при жорстких умовах гібридизації. нуклеотиди 1-2034, як показано на фігурі 3 (SEQ 14. Трансгенне насіння льону за п. 10, яке відрізID NO:8), де Т може бути також U; няється тим, що вказаний насіннєспецифічний (b) послідовність нуклеїнової кислоти, яка комплепромотор містить: ментарна послідовності нуклеїнової кислоти (а); (a) послідовність нуклеїнової кислоти, що включає (c) послідовність нуклеїнової кислоти, яка має щонуклеотиди 21-1852, як показано на фігурі 2 (SEQ найменше 65 % ідентичність послідовності з поID NO:4), де Т може бути також U; слідовністю нуклеїнової кислоти (а) або (b); або (b) послідовність нуклеїнової кислоти, яка компле(d) послідовність нуклеїнової кислоти, яка гібридиментарна послідовності нуклеїнової кислоти (а); зується з послідовністю нуклеїнової кислоти (а), (b) (c) послідовність нуклеїнової кислоти, яка має щоабо (с) при жорстких умовах гібридизації. найменше 65 % ідентичність послідовності нуклеї8. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що екснової кислоти (а) або (b); або пресія вказаної представляючої інтерес нуклеїно(d) послідовність нуклеїнової кислоти, яка гібридивої кислоти приводить до зміни в складі білків або зується з послідовністю нуклеїнової кислоти (а), (b) жирних кислот у вказаному насінні. або (с) при жорстких умовах гібридизації. 9. Трансгенне насіння льону, одержане відповідно 15. Трансгенне насіння льону за п. 10, яке відріздо способу, що включає: няється тим, що вказаний насіннєспецифічний (a) одержання химерної конструкції нуклеїнової промотор містить: кислоти, що містить в 5' ® 3' -напрямі транскрипції (a) послідовність нуклеїнової кислоти, що включає у вигляді функціонально пов'язаних компонентів: нуклеотиди 1-400, як показано на фігурі 3 (SEQ ID (1) насіннєспецифічний промотор, одержаний з NO:6), де Т може бути також U; льону; і (b) послідовність нуклеїнової кислоти, яка компле(2) представляючу інтерес послідовність нуклеїноментарна послідовності нуклеїнової кислоти (а); вої кислоти, причому вказана представляюча інте(c) послідовність нуклеїнової кислоти, яка має щорес нуклеїнова кислота є неприродною відносно найменше 65 % ідентичність послідовності нуклеївказаного насіннєспецифічного промотору; нової кислоти (а) або (b); або (b) введення вказаної химерної конструкції нуклеї(d) послідовність нуклеїнової кислоти, яка гібридинової кислоти в клітину рослини льону; і зується з послідовністю нуклеїнової кислоти (а), (b) (c) вирощування вказаної клітини рослини льону в або (с) при жорстких умовах гібридизації. зрілу рослину льону, здатну зав'язувати насіння, 16. Трансгенне насіння льону за п. 10, яке відрізпричому вказана представляюча інтерес послідоняється тим, що вказаний насіннєспецифічний вність нуклеїнової кислоти експресується в насінні промотор містить: під контролем вказаного насіннєспецифічного (a) послідовність нуклеїнової кислоти, що включає промотору, де вказаний насіннєспецифічний пронуклеотиди 1-2034, як показано на фігурі 4 (SEQ мотор є промотором запасного білка насіння, проID NO:8), де Т може бути також U; мотором олеозину, промотором запасного білка (b) послідовність нуклеїнової кислоти, яка компле2S або промотором бобово-подібного запасного ментарна послідовності нуклеїнової кислоти (а); білка насіння. (c) послідовність нуклеїнової кислоти, яка має що10. Трансгенне насіння льону за п. 9, яке відрізнайменше 65 % ідентичність послідовності нуклеїняється тим, що щонайменше один параметр нової кислоти (а) або (b); або експресії, що додається вказаним насіннєспецифі(d) послідовність нуклеїнової кислоти, яка гібридичним промотором його природної послідовності зується з послідовністю нуклеїнової кислоти (а), (b) нуклеїнової кислоти, додається вказаній неприроабо (с) при жорстких умовах гібридизації. дній послідовності нуклеїнової кислоти. 17. Трансгенне насіння льону за п. 10, яке відріз11. Трансгенне насіння льону за п. 10, яке відрізняється тим, що експресія вказаного представляняється тим, що вказаним параметром експресії є ючого інтерес неприродного гена приводить до таймінг експресії або рівень експресії. зміни в складі білків і жирних кислот насіння. 12. Трансгенне насіння льону за п. 10, яке відріз18. Трансгенна рослина льону, здатна до зав'язуняється тим, що вказаний насіннєспецифічний вання насіння, одержана способом, що включає: промотор є промотором запасного білка насіння, (а) одержання химерної конструкції нуклеїнової промотором олеозину, промотором запасного білкислоти, що містить в 5' ® 3' -напрямі транскрипції ка 2S або промотором бобово-подібного запасного у вигляді функціонально пов'язаних компонентів: білка насіння. (1) насіннєспецифічний промотор, одержаний з 13. Трансгенне насіння льону за п. 10, яке відрізльону; і няється тим, що вказаний насіннєспецифічний (2) представляючу інтерес послідовність нуклеїнопромотор містить: вої кислоти, причому вказана представляюча інте 5 87431 6 рес нуклеїнова кислота є неприродною відносно 21. Спосіб експресії представляючої інтерес повказаного насіннєспецифічного промотору; слідовності нуклеїнової кислоти в насінні льону, (b) введення вказаної химерної конструкції нуклеїщо включає: нової кислоти в клітину рослини льону; і (a) введення химерної послідовності нуклеїнової (c) вирощування вказаної клітини рослини льону в кислоти за п. 20 в клітину рослини; і зрілу рослину льону, здатну зав'язувати насіння, (b) вирощування вказаної клітини рослини в зрілу причому вказана представляюча інтерес послідорослину, здатну до зав'язування насіння, вність нуклеїнової кислоти експресується в насінні причому друга послідовність нуклеїнової кислоти під контролем вказаного насіннєспецифічного експресується в насінні під контролем насіннєспепромотору, де вказаний насіннєспецифічний процифічного промотору. мотор є промотором запасного білка насіння, про22. Спосіб за п. 20, який відрізняється тим, що мотором олеозину, промотором запасного білка вказана клітина рослини вибрана з групи рослин, 2S або промотором бобово-подібного запасного що складається з сої (Glycine max), рапсу (Brassica білка насіння. napus, Brassica campestris), соняшника (Helianthus 19. Виділена послідовність нуклеїнової кислоти, annuus), бавовнику (Gossypium hirsutum), кукуруздатна направляти насіннєспецифічну експресію в дзи (Zea mays), тютюну (Nicotiana tobacum), люцерослині, що містить: рни (Medicago sativa), пшениці (Triticum sp.), ячме(a) послідовність нуклеїнової кислоти, включаючу ню (Hordeum vulgare), вівса (Avena sativa L.), сорго нуклеотиди 1-2023, як показано на фігурі 1 (SEQ (Sorghum bicolor), Arabidopsis thaliana, картоплі ID NO:1), нуклеотиди 21-1852, як показано на фі(Solanum sp.), льону/льону звичайного (Linum гурі 2 (SEQ ID NO:4), нуклеотиди 1-400, як показаusitatissimum), сафлору (Carthamus tinctorius), гвіно на фігурі 3 (SEQ ID NO:6), або нуклеотиди 1нейської олійної пальми (Eleais guineeis), земляно2034, як показано на фігурі 4 (SEQ ID NO:8), де Т го горіха (Arachis hypogaea), американського горіха може бути також U; (Berthollettia excelsa), кокосового горіха (Cocus (b) послідовність нуклеїнової кислоти, яка комплеnucifera), кліщовини (Ricinus comrrmnis), коріандру ментарна послідовності нуклеїнової кислоти (а); (Coriandrum sativum), гарбуза крупноплідного сто(c) послідовність нуклеїнової кислоти, яка має щолового (Cucurbita maxima), жожоба (Simmondsia найменше 65 % ідентичність послідовності нуклеїchinensis) і рису (Oryza sativa). нової кислоти (а) або (b); або 23. Рослина, одержана способом за п. 21. (d) послідовність нуклеїнової кислоти, яка гібриди24. Рослинна клітина, що містить химерну послізується з послідовністю нуклеїнової кислоти (а), (b) довність нуклеїнової кислоти за п. 20. або (с) при жорстких умовах гібридизації. 25. Насіння рослини, що містить химерну послідо20. Виділена химерна послідовність нуклеїнової вність нуклеїнової кислоти за п. 20. кислоти, що містить: 26. Насіння рослини, одержане з рослини, отри(а) першу послідовність нуклеїнової кислоти, що маної способом за п. 21. включає насіннєспецифічний промотор, отриманий 27. Рекомбінантний експресуючий вектор, що місз льону, який містить: тить послідовність нуклеїнової кислоти за п. 19. (1) послідовність нуклеїнової кислоти, що включає 28. Рекомбінантний експресуючий вектор, що міснуклеотиди 1-2023, як показано на фігурі 1 (SEQ тить послідовність нуклеїнової кислоти за п. 20. ID NO:1), нуклеотиди 21-1852, як показано на фі29. Виділена послідовність нуклеїнової кислоти, гурі 2 (SEQ ID NO:4), нуклеотиди 1-400, як показащо містить: но на фігурі 3 (SEQ ID NO:6), або нуклеотиди 1(a) послідовність нуклеїнової кислоти, як показано 2034, як показано на фігурі 4 (SEQ ID NO:8), де Т на фігурі 1 (SEQ ID NO:1), фігурі 2 (SEQ ID NO:4), може бути також U; фігурі 3 (SEQ ID NO:6) або фігурі 4 (SEQ ID NO:8), (2) послідовність нуклеїнової кислоти, яка гібридиде Т може бути також U; зується з послідовністю нуклеїнової кислоти (а) (b) послідовність нуклеїнової кислоти, яка комплепри жорстких умовах гібридизації; ментарна послідовності нуклеїнової кислоти (а); (3) послідовність нуклеїнової кислоти, яка компле(c) послідовність нуклеїнової кислоти, яка має щоментарна послідовності нуклеїнової кислоти (а); найменше 65 % ідентичність послідовності нуклеїабо нової кислоти (а) або (b); або (4) послідовність нуклеїнової кислоти, яка має що(d) послідовність нуклеїнової кислоти, яка гібридинайменше 65 % ідентичність послідовності нуклеїзується з послідовністю нуклеїнової кислоти (а), (b) нової кислоти (а); і або (с) при жорстких умовах гібридизації. (b) другу послідовність нуклеїнової кислоти, неприродну відносно вказаного насіннєспецифічного промотору льону. Даний винахід відноситься до способів генетичної інженерії рослин, застосовних для зміни компонентів сім'я рослин. Більш конкретно, даний винахід відноситься до промоторів, які були одержані з льону і здатні управляти експресією неприродних генів в сім'ї льону, а також сім'ї інших рослин. Льон або льон звичайний (Linum usitatissimum) є комерційно важливою олійною культурою. Льняна олія і кормова мука з макухи льняного сім'я є 7 87431 8 цінними сировинними матеріалами, що отримутори, такі як сім'яспецифічні промотори, наприються з сім'я льону. Додатковий економічно важклад, промотор фазеоліну (Sengupta-Gopalan et ливий сировинний матеріал, льняне волокно, al., (1985), PNAS USA 82: 3320-3324), і промотори, отримують з стеблини цієї рослини. Олійну фракщо індукуються, як такі, що індукуються теплом цію льону використовують для нехарчових цілей, (Czamencka et al., (1989), Mol. Cell. Biol. 9 (8): 3457наприклад, у виробництві лака і фарби, і нещода3464), ультрафіолетовим світлом (УФ), еліситоравно цю фракцію стали застосовувати у виробництми і пошкодженням (Lois et al., (1989) EMBO J. 8 ві ряду придатних в їжу продуктів, таких як марга(6): 1641-1648), або хімікаліями, наприклад, ендорини і олії і заправки для салатів, завдяки генними гормонами (Skriver et al., (1991), Proc. нещодавно виведеним так званим сортам Linola Natl. Acad. Sei. USA 88(16): 7266-7270). Інші фак(Green (1986) Can. J. Plant Sei, 66: 499-503). Льнятори, якими можна маніпулювати для регуляції ну муку використовують передусім як компонент параметрів експресії неприродного гена в росликормів жуйних тварин, тоді як льняне волокно винах, включають в себе фактори модифікації транскористовують у виробництві льняних тканин. Внакрипції, такі як інтрони, сайти поліаденілювання і слідок економічної важливості льону як джерела сайти термінації транскрипції. Можна також манісировинних матеріалів, бажано було б додатково пулювати параметрами експресії неприродного поліпшувати і різноманітити "портфель" сортів гена за допомогою чинників, які впливають на льону як відносно агрономічної продуктивності, трансляцію, таких як сайти скріплення рибосоми і наприклад, урожаю сім'я, стійкості до патогенів і зміщення кодонів, яка виявляється господарем. низьких кліматичних температур, так і відносно Крім того, сам неприродний ген може впливати на виходу і якості сировинних матеріалів для задовожиттєздатність трансгенної рослини, зокрема, на лення подальших застосувань. Хоча можна одерможливі рівні експресії. У деяких випадках можна жувати покращені сорти льону шляхом загальноподолати цю проблему, експресією білка тканесприйнятої селекції рослин, як це доводиться пецифічним образом, наприклад, в листі або сім'ї, розвитком сортів Linola, виведення елітної лінії або обмеженням накопичення білка в різних субагрономічної рослини вимагає великих інвестицій клітинних компартментах, таких як, наприклад, в селекцію рослин через тривалість часу, необхідцитоплазма, ендоплазматичний ретикулум або ного для селекції. Технологія генетичної інженерії вакуолі, звичайно в присутності; або за відсутності рослин дозволяє виділяти гени безпосередньо з специфічних націлюючих послідовностей, здатних неродинних видів і перености ці гени в елітні агронаправляти даний білок в ці компартменти. Іншим номічні попередні культури, значно зменшуючи чинником, який буде впливати на параметри екстим самим час, необхідний для виведення нових пресії, є місцеположення, в якому конструкція вбусортів. Крім того, генетична інженерія рослин родована в хромосому господаря. Цей ефект міг би бить можливою виробництво продуктів, що не дати пояснення тому, чому різні рослини, трансодержуються природно з льону, наприклад, тераформовані однією і тією ж рекомбінантною конспевтичних агентів. трукцією, можуть мати рівні експресії рекомбінантДля виведення нових сортів льону за допомоного білка, що коливаються. гою генетичної інженерії рослин вирішальне знаНаскільки відомо авторам винаходу, експресія чення має регуляція експресії чужорідного або неприродних генів в сім'ї льону документована неприродного гена, що вводиться. Бажані характільки в Патентній заявці РСТ WO 98/18948. Ця теристики експресії для неприродного гена, такі як заявка описує два гени, що кодують стеароїлрівень експресії неприродного гена, конкретні ткаацильний білок-носій десатурази (SAD), одержані нина або орган рослини, в яких експресується цей з льону. Асоційовані з SAD промоторні послідовнеприродний ген, і конкретний час в циклі росту ності застосовні для модифікації льону і інших ророслини, в який цей неприродний ген експресуєтьслин для експресії ендогенних або чужорідних ся, буде варіюватися в залежності від застосувангенів. Однак, способи, описані WO 98/18948, обня, для якого розробляється дана лінія рослини. межується тим фактом, що промотори SAD не є Наприклад, модифікація складу олії сім'я може сім'яспецифічними у льоні і забезпечують експревимагати низьких рівнів сім'я специфічної експресії сію в листі, стеблинах, квітках і сім'ї. Таким чином, ферменту, що бере участь в метаболізмі жирних експресія неприродних генів може приводити до кислот на ранній стадії розвитку сім'я (див., напринебажаних побічних ефектів в тканинах, що не є клад, патент США 5 420 034). З іншого боку, екстканиною сім'я. Крім того, застосування промотопресія фармацевтичного білка може переважно рів SAD дозволяє регулювати рівень експресії і вимагати високих рівнів листя специфічної. екстаймінг експресії в обмежених межах. пресії при зборі листя рослин (див., наприклад, Існує необхідність подальшого поліпшення патент США 5 929 304). способів експресії неприродних генів в сім'ї льону і Для маніпулювання характеристиками експресім'ї інших рослин. сії неприродних генів можна впливати на численні Даний винахід відноситься до поліпшених спофактори. Одним чинником є вибір промотору собів для сім'яспецифічної експресії неприродних транскрипції, що використовується. У цей час догенів в рослинах. Зокрема, даний винахід відноступний широкий спектр сумісних з рослинами ситься до вдосконалених способів сім'яспецифічпромоторів, і деякі з кращих задокументованих ної експресії неприродних генів у льоні. промоторів включають в себе конститутивні проТаким чином, в одному аспекті даний винахід мотори, такі як промотор 3.5-S CaMV (Rothstein et представляє спосіб експресії представляючої інтеal. (1987), Gene 53:153-161) і промотор убікитину рес послідовності нуклеїнової кислоти в сім'ї льо(Патент США 5 614 399), тканеспецифічні промону, що включає: 9 87431 10 (a) одержання химерної конструкції нуклеїносім'я, причому вказана представляюча інтерес послідовність нуклеїнової кислоти експресується в вої кислоти, що містить в 5’ ® 3’ -напрямі транссім'ї під контролем вказаного сім'яспецифічного крипції у вигляді функціонально пов'язаних компопромотору. нентів Ще в одному додатковому аспекті, даний ви(1) сім'яспецифічний промотор, одержаний з нахід представляє нові сім'яспецифічні промотори льону; і льону, застосовні для експресії неприродних генів (2) представляючу інтерес послідовність нукв сім'ї льону і сім'ї інших видів рослин, застосовні, леїнової кислоти, причому вказана представляюча наприклад, для модифікації складу білка або олії інтерес нуклеїнова кислота є неприродною відносцього сім'я. но вказаного сім'яспецифічного промотору льону; У переважному варіанті сім'яспецифічний (b) введення, вказаної химерної конструкції нупромотор включає: клеїнової кислоти в клітину рослини льону; і (а) послідовність нуклеїнової кислоти, показа(c) вирощування, вказаної клітини рослини ну на фігурі 1 (SEQ ID ΝО:1), фігурі 2 (SEQ ID льону в зрілу рослину льону, здатну зав'язувати NО:4), фігурі 3 (SEQ ID NО:6) або фігурі 4 (SEQ ID сім'я, причому вказана представляюча інтерес NО:8), де Τ може бути також U; послідовність нуклеїнової кислоти експресується в (b) послідовність нуклеїнової кислоти, яка комсім'ї під контролем вказаного сім'яспецифічного плементарна послідовності нуклеїнової кислоти промотору льону. (а); У переважному варіанті даного винаходу, що(c) послідовність нуклеїнової кислоти, яка має найменше одна характеристика експресії, наприістотну гомологію послідовності з послідовністю клад, таймінг експресії в життєвому циклі рослини, нуклеїнової кислоти (а) або (b); що забезпечується промотором неприродної по(d) послідовність нуклеїнової кислоти, яка є слідовності нуклеїнової кислоти, є схожою з хараканалогом послідовності нуклеїнової кислоти (а), (b) теристикою експресії, яка надається природній або (с); або послідовності нуклеїнової кислоти. У додаткових (e) послідовність нуклеїнової кислоти, яка гібпереважних варіантах, сім'яспецифічним промоторидизується з послідовністю нуклеїнової кислоти ром льону є промотор олеозину, промотор запас(а), (b), (с) і (d) при жорстких умовах гібридизації. ного білка 2S або промотор бобово-подібного заВ іншому аспекті даний винахід включає химепасного білка сім'я. рні послідовності нуклеїнових кислот, що містять У наступному аспекті даний винахід представпершу послідовність нуклеїнової кислоти, отрималяє трансгенне сім'я льону, одержане у відповідну з льону, функціонально пов'язану з другою поності до способу, що включає: слідовністю нуклеїнової кислоти, неприродною (a) одержання химерної конструкції нуклеїновідносно вказаної першої послідовності нуклеїнової кислоти, що містить в 5' ® 3' -напрямі трансвої кислоти, причому вказана перша послідовність крипції у вигляді функціонально пов'язаних компонуклеїнової кислоти містить новий сім'я специфічнентів ний промотор льону. (1) сім'яспецифічний промотор, одержаний з Інші ознаки і переваги даного винаходу стальону; і нуть легко зрозумілими з наступного докладного (2) представляючу інтерес послідовність нукопису. Повинне бути зрозуміло, що докладний леїнової кислоти, причому вказана представляюча опис і конкретні приклади, що показують переважні інтерес нуклеїнова кислота є неприродною відносваріанти даного винаходу, приводяться тільки як но вказаного сім'яспецифічного промотору; ілюстрація, оскільки різноманітні зміни і модифіка(b) введення вказаної химерної конструкції нуції в рамках ідеї і об'єму даного винаходу будуть клеїнової кислоти в клітину рослини льону; і очевидними фахівцям в даній області з даного (c) вирощування вказаної клітини рослини докладного опису. льону в зрілу рослину льону, здатну зав'язувати Тепер даний винахід буде описаний з посисім'я, причому вказана представляюча інтерес ланням на малюнки, на яких: послідовність нуклеїнової кислоти експресується в Фігура 1 показує послідовність ДНК (SEQ ID сім'ї під контролем вказаного сім'яспецифічного NO:1) геномного клону льону, що кодує білок олепромотору. У наступному аспекті даний винахід озин 16,0 кД (SEQ ID NO:2 ІЗ). представляє рослини льону здатні зав'язувати Фігура 2 показує послідовність ДНК (SEQ ID сім'я, одержане способом, що включає: NO:4) геномного клону льону, що кодує білок оле(a) одержання химерної конструкції нуклеїноозин 18,6 кД (SEQ ID NO:5). вої кислоти, що містить в 5' ® 3' - напрямі трансФігура 3 показує послідовність ДНК (SEQ ID крипції у вигляді функціонально пов'язаних компоNO:6) геномного клону льону, що кодує запасний нентів білок 2S (SEQ ID NO:7). (1) сім'яспецифічний промотор, одержаний з Фігура 4 показує послідовність ДНК (SEQ ID льону; і NO:8) геномного клону льону, що кодує бобово(2) представляючу інтерес послідовність нукподібний запасний білок 54,5 кД (SEQ ID NO:9-12). леїнової кислоти, причому вказана представляюча Фігура 5 показує Саузерн-блот-аналіз геномної інтерес нуклеїнова кислота є неприродною відносДНК льону, зондованої послідовностями ДНК олено вказаного сім'яспецифічного промотору; озину льону. (b) введення вказаної химерної конструкції нуФігура 6 показує Нозерн-блот-аналіз сім'яспеклеїнової кислоти в клітину рослини льону; і цифічної експресії олеозинів льону. (c) вирощування вказаної клітини рослини льону в зрілу рослина льону, здатне зав'язувати 11 87431 12 Фігура 7 показує Нозерн-блот-аналіз експресії сім'ї під контролем вказаного сім'яспецифічного в процесі розвитку олеозинів льону під час розвитпромотору льону. ку сім'я. У застосуванні тут, термін "неприродний" відФігура 8 показує активність GUS зародків льоноситься до будь-якої послідовності нуклеїнової ну, бомбардованих генними конструкціями промокислоти, в тому числі послідовності РНК або ДНК, тор олеозину льону-GUS-термінатоp. яка звичайно не асоційована з сім'яспецифічним Фігура 9 показує експресію GUS в зародках промотором. Цей термін включає в себе гетеролольону, що розвиваються і сім'ї Arabidopsis рослин, гічні послідовності нуклеїнових кислот, які одержатрансформованих гібридом промотор гена білка ні з іншого виду рослини, ніж промотор, а також 2S-GUS. гомологічні послідовності нуклеїнових кислот, які Фігура 10 показує тканеспецифічну експресію одержані з того ж самого виду рослини, що і проGUS в трансгенних рослинах льону, трансформомотор, але не є пов'язаними з цим промотором в ваних генною конструкцією промотор лініну-GUSрослині дикого типу (нетрансгеннійрослині). термінатор лініну. Неприродна послідовність нуклеїнової кислоти Фігура 11 показує часову експресію GUS в при скріпленні з сім'яспецифічним промотором, трансгенних рослинах льону, трансформованих отриманим з льону, приводить до утворення хигенною конструкцією промотор лініну- GUS мерної конструкції. Цю химерну конструкцію ввотермінатор лініну. дять в клітину рослини льону для створення Фігура 12 показує експресію GUS в трансгентрансгенної клітини рослини льону, що приводить них рослинах Brassica napus (L1-L9), трансформодо детектовано відмінному фенотипу даної клітини ваних генною конструкцією промотор лініну-GUSрослини льону або рослини льону, вирощеної з термінатор лініну. неї, в порівнянні з нетрансгенною клітиною рослиФігура 13 показує експресію GUS в трансгенни льону або рослиною льону, вирощеною з неї. них рослинах Arabidopsis, трансформованих генБезперервна послідовність нуклеїнової кислоти, ною конструкцією промотор лініну-GUS-термінатор ідентична послідовності нуклеїнової кислоти цієї лініну, на різних стадіях розвитку сім'я. химерної конструкції, не присутня в нетрансфорЯк згадувалося вище, даний винахід відномованих клітині рослини льону або рослині льону, ситься до вдосконалених способів експресії невирощеній з неї. У цьому відношенні, химерні моприродних генів в рослинах, зокрема, льоні. Даний лекули нуклеїнових кислот включають ті послідоввинахід представляє способи, що роблять можлиності, які містять промотор льону, пов'язаний з вою сім'яспецифічну експресію неприродних генів послідовністю нуклеїнової кислоти, одержаною з у льоні. Способи даного винаходу є вигідними тоіншого виду рослини, або послідовністю нуклеїному, що досягається поліпшена регуляція експресії вої кислоти з льону, але звичайно не пов'язаної з неприродних генів в сім'ї льону. Експресія неприданим промотором. Химерні послідовності нуклеїродного гена обмежується сім'ям, що обмежує нових кислот, в застосуванні тут, включають в сепотенціал небажаних побічних ефектів, що винибе також послідовності, що містять промотор льокають з експресії в інших органах і тканинах росну і послідовність нуклеїнової кислоти, яка лини. Крім того, забезпечена методологія дозвозвичайно пов'язана з цим промотором, але додатляє удосконалити контроль над параметрами ково що містять неприродну послідовність нуклеїекспресії, такими як рівень експресії неприродного нової кислоти. Наприклад, якщо промотор являє гена і таймінг експресії неприродного гена в циклі собою специфічний для сім'я льону промотор олерозвитку рослини. Способи даного винаходу особозину, послідовності, "неприродні" для промотору ливо корисні завдяки тому, що відповідно до даноолеозину льону, включають в себе також послідого винаходу склад сім'я відносно цінних сировинвність, що містить гібрид гена олеозину льону, них матеріалів, таких як олія, білок і полісахариди, природно пов'язаного з промотором олеозину, з може бути змінений як якісно, так і кількісно. представляючою інтерес кодуючою послідовністю, Таким чином, в одному аспекті даний винахід яка природно не пов'язана з цим промотором. Тепредставляє спосіб експресії представляючої інтермін "неприродний" включає в себе також гібридрес послідовності нуклеїнової кислоти, що вклюний ген, описаний вище, який додатково включає в чає: себе послідовність розщеплення, що розділяє по(а) одержання химерної конструкції нуклеїнослідовність нуклеїнової кислоти, яка звичайно пов'язана з промоторною послідовністю, і ген, що вої кислоти, що містить в 5’ ® 3’ -напрямі транскодує представляючий інтерес білок. крипції у вигляді функціонально пов'язаних компоТермін "послідовність нуклеїнової кислоти" нентів означає послідовність нуклеотидних або нуклео(1) сім'яспецифічний промотор, одержаний з зидних мономерів, що складаються з основ, цукрів льону; і і міжцукрових (каркасних) зв'язків що природно (2) представляючу інтерес послідовність нукзустрічаються. Цей термін включає в себе також леїнової кислоти, причому вказана представляюча модифіковані або заміщені послідовності, що місінтерес нуклеїнова кислота є неприродною відностять ті, що не зустрічаються в природі мономери но вказаного сім'яспецифічного промотору льону; або їх частини, які функціонують схожим образом; (b) введення вказаної химерної конструкції нуПослідовності нуклеїнових кислот даного винаходу клеїнової кислоти в клітину рослини льону і· можуть бути рибонуклеїновими (РНК) або дезо(c) вирощування вказаної клітини рослини, ксирибонуклеїновими (ДНК), кислотами і можуть льону в зрілу рослину льону, здатне зав'язувати містити основи, що природно зустрічаються, в тосім'я, причому вказана представляюча інтерес му числі аденін, гуанін, цитозин, тимідин і урацил. послідовність нуклеїнової кислоти експресується в 13 87431 14 Ці послідовності можуть також містити модифікоабо можуть бути знайдені в Current Protocols in вані основи, такі як ксантин, гіпоксантин, 2Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), аміноаденін, 6-метил-, 2-пропіл- і інші алкіладені6.3.1-6.3.6. Наприклад, можуть використовуватися ни, 5-галогенурацил, 5-галогенцитозин, 6наступні умови: 6,0 x хлорид натрію/цитрат натрію азаурацил, 6-азацитозин і 6-азатимін, псевдоура(SSC) при приблизно 45°С з подальшою промивцил, 4-тіоурацил, 8-галогенаденін, 8-аміноаденін, кою 2,0 x SSC при 50°С. Жорсткість може бути 8-тіоладенін, 8-тіоалкіладеніни, 8-гідроксиладенін і вибрана на основі умов, що використовуються в інші 8-заміщені аденіни, 8-галогенгуаніни, 8стадії промивки. Наприклад, концентрація солі в аміногуанін, 8-тіолгуанін, 8-тіоалкілгуаніни, 8стадії промивки може бути вибрана з високої жоргідроксилгуанін і інші 8-заміщені-гуаніни інші аза- і сткості близько 0,2 x SSC при 50°С. деазаурацили, тимідини, цитозини, аденіни або Крім того, температура в стадії промивки може гуаніни, 5-трифторметилурацил і 5бути при умовах високої жорсткості, при близько трифторцитозин. 65°С. Термін "сім'яспецифічний" промотор означає, Термін "послідовність нуклеїнової кислоти, яка що ген, який експресується під контролем промоє аналогом" означає послідовність нуклеїнової тору, переважно експресується в сім'ї рослини при кислоти, яка була модифікована в порівнянні з відсутності експресії або без істотної експресії, послідовністю (а), (b) або (с), причому ця модифізвичайне менше за 5% від загального рівня екскація не змінює застосовність цієї послідовності пресії, в інших тканинах рослини. (тобто як сім'яспецифічного промотору), описану У наступному аспекті даний винахід представтут. Модифікована послідовність або аналог моляє нові сім'яспецифічні промотори льону, застожуть мати поліпшені властивості в порівнянні з совні для експресії неприродних генів в сім'ї льону послідовністю, показаною в (а), (b) або (с). Одним і сім'ї інших видів рослин. Ці промотори можуть прикладом модифікації для одержання аналога є бути використані для модифікації, наприклад, заміна однієї з основ, що природно зустрічаються складу білка, олії або полісахаридів цього сім'я. У (тобто аденіну, гуаніну, цитозину або тимідину) переважному варіанті, сім'яспецифічний промотор послідовності, показаної на фігурі 1, фігурі 2, фігурі включає: 3 або фігурі 4, модифікованим основою, такою як (а) послідовність нуклеїнової кислоти, показаксантин, гіпоксантин, 2-аміноаденін, 6-метил-, 2ну на фігурі 1 (SEQ ID NO:1), фігурі 2 (SEQ ID пропіл- і інші алкіладеніни, 5-галогенурацил, 5NO:4), фігурі 3 (SEQ ID NO:6) або фігурі 4 (SEQ ID галогенцитозин, 6-азаурацил, 6-азацитозин і 6NO:8), де Τ може бути також U; азатимін, псевдоурацил, 4-тіоурацил, 8(b) послідовність нуклеїнової кислоти, яка комгалогенаденін, 8-аміноаденін, 8-тіоладенін, 8плементарна послідовності нуклеїнової кислоти тіоалкіладеніни,8-гідроксиладенін і інші 8-заміщені (а); аденіни, 8-галогенгуаніни, 8-аміногуанін, 8(c) послідовність нуклеїнової кислоти, яка має тіолгуанін, 8-тіоалкілгуаніни, 8-гідроксилгуанін і істотну гомологію послідовності з послідовністю інші 8-заміщені гуаніни, інші аза- і деазаурацили, нуклеїнової кислоти (а) або (b); тимідини, цитозини, аденіни або гуаніни, 5(d) послідовність нуклеїнової кислоти, яка є трифторметилурацил і 5-трифторцитозин. аналогом послідовності нуклеїнової кислоти (а), (b) Інший приклад модифікації включає в себе або (с); або модифіковані гетероатоми фосфору або кисню в (e) послідовність нуклеїнової кислоти, яка гібфосфатному скелеті, коротколанцюгові алкільні ридизується з послідовністю нуклеїнової кислоти або циклоалкільні міжцукрові зв'язки або коротко(а), (b), (с) і (d) при жорстких умовах гібридизації. ланцюгові гетероатомні або гетероциклічні міжцукТермін "послідовність, яка має істотну гомолорові зв'язку в молекулі нуклеїнової кислоти, покагію послідовності" означає ті послідовності нуклеїзаній на фігурі 1, фігурі 2, фігурі 3 або фігурі 4. нових кислот, які мають незначні або неістотні зміНаприклад, послідовності нуклеїнових кислот мони послідовності від послідовностей, описаних в жуть містити фосфоротіоати, фосфотриефіри, (а) або (b), тобто послідовності, які функціонують метилфосфонати і фосфородитіоати. по суті таким же чином і здатні направляти сім'ясДодатковим прикладом аналога молекули нукпецифічну експресію неприродних послідовностей леїнової кислоти даного винаходу є пептиднуклеїнуклеїнових кислот. Ці зміни можуть бути пов'язані нова кислота (ПНК), в якої дезоксирибоза- (або з локальними мутаціями або структурними модирибоза-)-фосфатний скелет в ДНК (або РНК) заміфікаціями. Послідовності нуклеїнових кислот, які нений поліамідним скелетом, який схожий зі скемають істотну гомологію, включають в себе послілетом, що виявляється в пептидах (P.E. Nielsen, et довності нуклеїнових кислот, що мають щонаймеal. Science 1991, 254, 1497). Було показано, що нше 65%-ну, більш переважно щонайменше 85%ПНК-аналоги є стійкими до деградації ферментами ну і найбільш переважно 90-95%-ну ідентичність з і мають пролонговане існування in vivo і in vitro. послідовностями нуклеїнових кислот, показаними ПНК також сильніше зв'язуються з комплементарна фігурі 1 (SEQ ID NO:1), фігурі 2 (SEQ ID NO:4), ною послідовністю ДНК внаслідок відсутності, зуфігурі 3 (SEQ ID NO:6) або фігурі 4 (SEQ ID NO:8). мовленої зарядом відштовхування між ланцюгами Термін "послідовність, яка гібридизується" ПНК і ДНК. Інші аналоги нуклеїнових кислот моозначає послідовність нуклеїнової кислоти, яка жуть містити нуклеотиди, що містять полімерні може гібридизуватися з послідовністю (а), (b), (с) скелети, циклічні скелети або ациклічні скелети. або (d) при жорстких умовах гібридизації. ВідповіНаприклад, ці нуклеотиди можуть мати структури дні "жорсткі умови гібридизації", які стимулюють морфоліно-скелету (Патент США 5 034 506). Анагібридизацію ДНК, відомі фахівцям в даній області логи можуть, також містити групи, наприклад, ре 15 87431 16 портерні групи, групу для поліпшення фармакокіСпособи експресії неприродних генів в сім'ї нетичних або фармакодинамічних властивостей льону відповідно до даного винаходу можуть здійпослідовності нуклеїнової кислоти. снюватися з використанням будь-якого сім'яспеВ іншому аспекті даний винахід представляє цифічного промотору льону і не обмежуються конхимерні послідовності нуклеїнових кислот, що міскретним вибраним сім'яспецифічним промотором тять першу послідовність нуклеїнової кислоти, льону. У переважних варіантах даного винаходу отриману з льону, функціонально пов'язану з друсім'яспецифічний промотор льону додає неприрогою послідовністю нуклеїнової кислоти, неприроддній послідовності нуклеїнової кислоти, щонайменою відносно вказаної першої послідовності нукленше, один параметр експресії, який схожий або їнової кислоти, причому вказана перша ідентичний параметру експресії, що додається послідовність нуклеїнової кислоти містить новий природній послідовності нуклеїнової кислоти присім'яспецифічний промотор льону. Переважно, цей родним·промотором. Термін "параметр експресії" в промотор вибраний з групи промоторів, фігури 1, застосуванні тут означає будь-яку вимірну властифігури 2, фігури 3 або фігури 4 або послідовність вість або дію, що додається сім'яспецифічним нуклеїнової кислоти, що гібридизується з ними при промотором льону послідовності нуклеїнової кисжорстких умовах. лоти, функціонально пов'язаної з цим сім'яспециВідповідно до даного винаходу, химерні посліфічним промотором льону. Таким чином, в передовності нуклеїнових кислот можуть бути включені важних варіантах, таймінг експресії в життєвому відомим образом в рекомбінантний експресуючий циклі рослини неприродної послідовності нуклеївектор, який забезпечує хорошу експресію в клітинової кислоти є схожим або ідентичним з таймінні сім'я. Таким чином, даний винахід включає в гом експресії природної послідовності нуклеїнової себе рекомбінантний експресуючий вектор, що кислоти. У додаткових переважних варіантах, рімістить химерну послідовність нуклеїнової кислоти вень експресії гетерологічної послідовності нуклеїданого винаходу, придатний для експресії в клітині нової кислоти є схожим або ідентичним рівню екссім'я. пресії природної послідовності нуклеїнової Термін "відповідний для експресії в клітині сікислоти. У додаткових характерних варіантах, рем'я" означає, що рекомбінантні експресуючі вектоакція неприродного гена на зміни в умовах освітри містять химерну послідовність нуклеїнової кислення, змінах в довжині хвилі або інтенсивності лоти даного винаходу, регуляторну дільницю і світла, наприклад, на зміни температури, пошкодільницю термінації, вибрану на основі клітини дження тканини, зміни· в концентрації хімічних сім'я, яка повинна використовуватися для експреагентів, наприклад, фітогормонів і - пестицидів, є сії, яка функціонально пов'язана з послідовністю східною з реакцією природної послідовності нукленуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид бажаноїнової кислоти на ці стимули. Інші бажані параметго амінокислотного складу. Термін "функціонально ри експресії, що додаються сім'яспецифічним пов'язаний" означає, що химерна послідовність промотором льону, можуть бути відомі фахівцям в нуклеїнової кислоти, яка кодує цей поліпептид, даній область, і сім'яспецифічний промотор льону пов'язана з регуляторною послідовністю і дільниможе бути вибраний відповідно до цього. цею термінації, які роблять можливою експресію в Сім'яспецифічні промотори льону, які можуть клітині сім'я. Типова конструкція складається, в бути використані відповідно до даного винаходу, включають в себе промотори, пов'язані із запаснапрямі 5’ ® 3’, з регуляторної дільниці, що закінними білками сім'я, такими як все альбуміни і глочується промотором, здатним направляти експребуліни, в тому числі віцилін- і бобово-подібні білки, сію в рослині, дільницею, що кодує поліпептид, і а також сім'яспецифічні промотори, не пов'язані із дільницею термінації транскрипції, функціональзапасними білками сім'я, такі як промотори олеоними в клітинах рослин. Ці конструкції можуть бути зинів. Особливий інтерес представляють також одержані відповідно до методології, добре відомої промотори, асоційовані з метаболізмом жирних фахівцям в області молекулярної біології (див., кислот, наприклад, промотори білка-носія ацилу наприклад, Sambrook et al. (1990), Molecular (АСР), сатураз, десатураз, елонгаз і т.п. Cloning, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press). ОдерУ переважних варіантах даного винаходу сіжання конструкцій може включати в себе такі спом'яспецифічним промотором, що використовуєтьсоби, як рестрикційне розщеплення, лігування, ся є промотор олеозину, промотор бобовогель-електрофорез, секвенування ДНК і ПЛР. Веподібного запасного білка сім'я або промотор залика різноманітність клонуючих векторів доступна пасного білка 2S. В особливо переважних варіандля виконання необхідних стадій клонування. тах сім'яспецифічний промотор має послідовність, Особливо відповідними для цієї, мети є клонуючі показану на фігурі 1, фігурі 2, фігурі 3 або фігурі 4, вектори з системою реплікації, яка є функціональабо будь-які інші послідовності, одержані з льону і ною в Eseherichia coli, такі як pBR322, серія pUC, які гібридизуються з будь-якою з цих чотирьох посерія М13mр, pACYC184, pBluescript і т.д. Посліслідовностей нуклеїнових кислот при жорстких довності нуклеїнових кислот можуть бути введені в умовах. ці вектори, і ці вектори можуть бути використані Додаткові сім'яспецифічні промотори можуть для трансформації Е.соlі, яка може вирощуватися бути використані відповідно до даного винаходу. у відповідному середовищі. Плазміди можуть бути Ці промотори можуть бути одержані різними сповитягнуті з цих клітин при зборі і лізісі клітин. Кінсобами. Якщо був виділений білок сім'я льону, він цеві конструкції можуть бути введені в рослинні може бути частково секвенований, так що може вектори, сумісні по інтеграції в рослину, такі як Ті-і бути сконструйований нуклеїновокислотний зонд Ri-плазміди. для ідентифікації РНК,специфічної для цього сі 17 87431 18 м'я. Для додаткового посилення РНК, специфічно тливою каталітичною функцією або цінний білок, пов'язаної з сім'ям, може бути одержана кДНК з який буде нагромаджуватися до високих рівнів і клітин сім'я, і з цієї кДНК можуть бути відняті мРНК екстрагуватися, якщо бажано. Білки з каталітичабо кДНК з клітин не сім'я (з інших тканин). Потім ною функцією включають в себе, але не обмежукДНК сім'я, що залишилася можна використати ються ними, білки, які додають новий біохімічний для зондування бібліотеки геномної ДНК на комфенотип сім'ю, що розвивається. Нові фенотипи плементарні послідовності. Послідовності, які гібможуть включати в себе такі модифікації, як змінеридизуються з цією кДНК, можуть бути потім одений склад білків сім'я або олії сім'я або склад поліржані, і асоційована з ними промоторна дільниця сахаридів сім'я, підвищене продукування попереможе бути виділена. Можна також піддати скриніндньо існуючих бажаних продуктів або гу бібліотеки геномної ДНК, одержані з тканин сім'я властивостей і зменшення або навіть супресію льону, з використанням відомих сім'яспецифічних небажаного генного продукту з використанням генів з інших видів рослин і потім виділити їх асоантисмислової технології, рибозиму або технологій ційовані промотори. Через відносну велику кілько-супресії (Izant and Weintraub (1984) Cell 26: кість запасних білків сім'я в сім'ї можна також 1007-1015, антисмислові; Hazelhoff and Gerlach отримати інформацію про послідовність за допо(1988) Nature 334: 585-591, рибозим; Napoli et al. могою випадкового секвенування бібліотек кДНК (1990) Plant Cell 2: 279-289, ко-супресія). сім'я льону. Ці послідовності кДНК, відповідні поОчікується, що бажані білки могли б експресуслідовності відомих запасних білків льону, можуть ватися у всіх зародкових тканинах, хоч в різних бути використані для ідентифікації, асоційованого зародкових тканинах, таких як зародкова вісь і з ними промотору. Бази даних, що містять інфорсім'ядолі, може бути виявлена різна клітинна ексмацію про послідовність з великомасштабного пресія. Представляюча інтерес послідовність нуксеквенування, наприклад, з Arabidopsis і кукурулеїнової кислоти може експресуватися на будьдзи, можуть бути піддані пошуку на відомі сім'ясякій стадії в розвитку сім'я. Таймінг експресії може пецифічні білки і/або промотори, і ця інформація залежати від конкретної застосовності даного виможе бути використана для ідентифікації промонаходу. Експресія ферментів, що беруть участь в торних послідовностей в льоні, які мають схожість модифікації олії, може бути бажаною на ранній послідовності. Можуть бути використані альтернастадії розвитку сім'я, наприклад, перед накопичентивні способи, для виділення додаткових сім'яспеням запасного білка сім'я. цифічних промоторів льону, і фахівцями в даній Крім промоторної дільниці і представляючої області можуть бути виявлені і використані відпоінтерес послідовності нуклеїнової кислоти, послівідно до даного винаходу нові сім'яспецифічні довність нуклеїнової кислоти, здатну термінувати промотори льону. транскрипцію, звичайно включають в експресуючі Представляюча інтерес послідовність нуклеївектори. Термінатори транскрипції переважно явнової кислоти, пов'язана з промотором, може бути ляють собою близько 200 - 1000 пар нуклеотидних будь-якою представляючою інтерес послідовністю основ і можуть містити будь-які такі послідовності, нуклеїнової кислоти, в тому числі будь-якою РНКфункціональні в рослинах, такі як дільниця терміабо ДНК-послідовністю, що кодує представляючий нації нопалінсинтази (Bevan et al., (1983) Nucl. інтерес пептид або білок, наприклад, фермент, Acid. Res. 11: 369-385), термінатор фазеоліну (van або послідовністю, комплементарною геномній der Geest et al., (1994) Plant J. 6(3): 413-423), терпослідовності, причому ця геномна послідовність мінатор гена октопінсинтази Agrobacterium може бути щонайменше однією з відкритих рамок tumefaciens або інші подібним образом функціопрочитання, нітроном, некодируючою лідерною нуючі елементи. Ці дільниці термінації транскриппослідовністю або будь-якою послідовністю, приції можуть бути одержані, як описане An (1987), чому ця комплементарна послідовність буде інгіMethods in Enzym. 153: 292, або можуть вже бути бувати транскрипцію, процесінг месенджер-РНК, присутніми в плазмідах, доступних з комерційних наприклад, сплайсінг або трансляцію. Представджерел, таких як ClonTech, Palo Alto, California. ляюча інтерес послідовність нуклеїнової кислоти Вибір відповідного термінатора впливає на швидможе бути синтетичною, природно виділеною або кість транскрипції. їх комбінацією. Представляюча інтерес послідовХимерна конструкція може додатково містити ність нуклеїнової кислоти могла б бути фрагмененхансери, такі як лідер AMV (Jobling and Gehrke том природної послідовності, наприклад, включати (1987), Nature 325: 622-625), або інтрони. Повинно тільки каталітичний домен або структуру особлибути зрозуміло, що конструкція експресуючого вої важливості. У залежності від природи представектора може залежати від таких чинників, як вивляючої інтерес нуклеїнової кислоти може бути бір виду рослини і/або типу поліпептиду, який ексбажаним синтез цієї послідовності з переважними пресується. для рослин кодонами. Переважні для рослин коЕкспресуючі вектори звичайно містять також дони можуть бути визначені з кодонів найвищої маркерний генів. Маркерні гени включають в себе частоти зустрічності в білках, експресованих в всі гени, які дозволяють відрізнити трансформованайбільшій кількості представляючих інтерес конкні клітини рослини від нетрансформованих клітин, ретних видів рослин. в тому числі селектовані і придатні для скринінгу Представляюча інтерес послідовність нуклеїмаркерні гени. Зручно, коли маркер може бути нової кислоти може кодувати будь-який з різномамаркером стійкості до гербіциду, наприклад, глінітних рекомбінантних білків. Приклади рекомбінафозату або фосфінотрицину, або до антибіотика, нтних білків, які можуть експресуватися способами такого як канаміцин, G418, блеоміцин, гігроміцин, даного винаходу, включають в себе білки з сприяхлорамфенікол і т.п., які додають ознаку, на яку 19 87431 20 може бути проведений відбір за допомогою хімічпецифічних промоторів льону, що складається з них засобів. Маркери, що скринуються, можуть промотору запасного білка 2S, промотору глобулібути використані для ідентифікації трансформанну, промотору олеозину і промотору бобовотів за допомогою спостереження. Вони включають подібного запасного білка сім'я. Специфічні промоторні послідовності показані на фігурі 1 (SEQ ID в себе, але не обмежуються ними, b-глюкуронідазу NO:1), фігурі 2 (SEQ ID NO:4), фігурі 3 (SEQ ID або геном uidA, ген b-лактамази або зелений флуNO:6) і фігурі 4 (SEQ ID NO:8). оресцентний білок (Niedz et al. (1995) Plant Cell Далі, даний винахід представляє рослини льоRep. 14: 403). ну, здатні зав'язувати сім'я, одержане способом, Для введення послідовностей нуклеїнових кищо включає: слот в клітини рослин для фахівця загалом досту(а) одержання химерної конструкції нуклеїнопні різні способи. Повідомлялося про опосередкової кислоти, що містить в 5’®3’ -напрямі транскривану Agrobacterium трансформацію клітин рослин пції у вигляді функціонально пов'язаних компоненльону, і трансформанти льону можуть бути одертів жані у відповідності до способів, описаними Dong (1) сім'яспецифічний промотор, одержаний з and McHughen (1993) Plant Science 88: 61-77, хоча льону; і багато які інші способи (див. нижче) можуть бути (2) представляючу інтерес послідовність нуктакож використані для введення химерних конслеїнової кислоти, причому вказана представляюча трукцій ДНК в клітини льону, якщо бажано. інтерес нуклеїнова кислота є неприродною відносТрансформованим рослинам льону, вирощено вказаного сім'яспецифічного промотору; ним відповідно до загальноприйнятих сільськогос(b) введення вказаної химерної конструкції нуподарських способів, відомих особі з кваліфікацією клеїнової кислоти в клітину рослини льону; і в даній області, дають зав'язати сім'я. Потім сім'я (c) вирощування вказаної клітини рослини льону може бути одержане із зрілих рослин льону і льону в зрілу рослину льону, здатну зав'язувати аналізовані на бажані змінені властивості в порівсім'я, причому вказана представляюча інтерес нянні з сім'ям дикого типу. послідовність нуклеїнової кислоти експресується в Два або більше поколінь рослин можуть бути сім'ї під контролем вказаного сім'яспецифічного вирощені і або перехресно запилені, або самозапромотору. пилені для ідентифікації рослин і штамів з бажаДалі даний винахід представляє способи заними фенотипічними характеристиками, включаюстосування нових промоторів, показаних на фігурі чи вироблення рекомбінантного поліпептиду. 1 (SEQ ID NO:1), фігурі 2 (SEQ ID NO:4), фігурі 3 Може бути бажаним забезпечення гомозиготності (SEQ ID NO:6) і фігурі 4 (SEQ ID NO:8), у видах в рослинах для гарантії безперервного успадкурослин, інших, чим льон. Таким чином, даний вивання рекомбінантної ознаки. Способи відбору нахід включає в себе також одержання химерних гомозиготних рослин добре відомі фахівцям в обконструкцій нуклеїнових кислот, що містять промоласті селекції рослин і включають в себе періодитор, вибраний з групи промоторів, показаних на чне самозапилення і відбір і культивування пильофігурі 1, фігурі 2, фігурі 3 і фігурі 4, і представляювиків і мікроспор. Гомозиготні рослини можуть чу інтерес послідовність нуклеїнової кислоти, і також бути одержані шляхом трансформації гаплоекспресію послідовності нуклеїнової кислоти сім'яїдних клітин або тканин з подальшою регенераціспецифічним образом у видах рослин, інших, чим єю гаплоїдних паростків, що потім перетворюютьльон, під контролем промотору льону. ся в диплоїдні рослини будь-яким числом відомих В іншому аспекті даного винаходу представспособів (наприклад, обробкою колхіцином або лений спосіб експресії представляючої інтерес іншими руйнуючими мікротрубочки агентами). нуклеїнової кислоти в сім'ї рослин, що включає: Даний винахід включає в себе також трансген(а) одержання химерної конструкції нуклеїноне сім'я льону, одержане у відповідності до спосової кислоти, що містить в 5’ ® 3’ -напрямі трансбу, що передбачає: (a) одержання химерної конструкції нуклеїнокрипції у вигляді функціонально пов'язаних компонентів вої кислоти, що містить в 5’ ® 3’ -напрямі транс(1) сім'яспецифічний промотор, вибраний з крипції у вигляді функціонально пов'язаних компогрупи сім'яспецифічних промоторів, що складаєтьнентів ся з (1) сім'яспецифічний промотор, одержаний з (і) послідовності нуклеїнової кислоти, показальону; і ної на фігурі 1 (SEQ ID NO:1), фігурі 2 (SEQ ID (2) представляючу інтерес послідовність нукNO:4), фігурі 3 (SEQ ID NO:6) або фігурі 4 (SEQ ID леїнової кислоти, причому вказана представляюча NO:8), де Τ може бути також U; інтерес нуклеїнова кислота є неприродною віднос(іі) послідовності нуклеїнової кислоти, яка комно вказаного сім'яспецифічного промотору; плементарна послідовності нуклеїнової кислоти (b) введення вказаної химерної конструкції ну(а); клеїнової кислоти в клітину рослини льону; і (ііі) послідовності нуклеїнової кислоти, яка має (c) вирощування вказаної клітини рослини істотну гомологію послідовності з послідовністю льону в зрілу рослину льону, здатну зав'язувати нуклеїнової кислоти (1) або (іі); і сім'я, причому вказана представляюча інтерес (iv) послідовності нуклеїнової кислоти, яка є послідовність нуклеїнової кислоти експресується в аналогом послідовності нуклеїнової кислоти (і), (іі) сім'ї під контролем вказаного сім'яспецифічного або (ііі); промотору. (ν) послідовності нуклеїнової кислоти, яка гібУ переважних варіантах даного винаходу сіридизується з послідовністю нуклеїнової кислоти м'яспецифічний промотор вибраний з групи сім'яс 21 87431 22 (і), (іі), (ііі) або (iv) при жорстких умовах гібридизаУ наступних, конкретних додатках, наприклад, ції; і (2) вказана представляюча інтерес послідовдля В. napus, клітини-господарі, націлені на приність нуклеїнової кислоти; йом рекомбінантних конструкцій ДНК, звичайно (b) введення химерної конструкції нуклеїнової отримують з черешків сім'ядоль, як описане кислоти в клітину рослини; Moloney et al. (1989), Plant Cell Rep. 8: 238-242. (c) вирощування вказаної клітини рослини в Інші приклади з використанням комерційного олійзрілу рослину, здатну зав'язувати сім'я, причому ного сім'я включають в себе трансформацію сім'явказана представляюча інтерес послідовність нукдоль в експлантатах сої (Hinchee et al. (1988) леїнової кислоти експресується в сім'ї під контроBio/Technol. 6: 915-922) і трансформацію стеблин лем вказаного сім'яспецифічного промотору. бавовнику (Umbeck et al., (1987) Bio/Techn. 5: 263Різні способи доступні для введення послідов266). ностей нуклеїнових кислот, зокрема, ДНК, в росПісля трансформації клітини, наприклад, лислинні клітини-господарі, загалом. Наприклад, хитові диски, вирощують в селективному середовимерні конструкції ДНК можуть бути введені в щі. Як тільки починають проростати паростки, їх клітини-господарі, одержані з дводольних рослин, відрізають і вміщують на вкоріняюче середовище. таких як тютюн, і олійних видів, таких як Brassiea Після утворення достатньої кількості коріння, ці napus, з використанням стандартних векторів рослини переносять в грунт. Потім передбачувані Agrobacterium за допомогою протоколу трансфортрансформовані рослини випробовують на присумації, наприклад, описаного Moloney et al, (1989), тність маркера. Саузерн-блотінг виконують на геPlant Cell Rep. 8: 238-242 або Hinchee et al. (1988) номній ДНК з використанням відповідного зонда, Bio/Technol. 6: 915-922; або інших способів, відощоб показати інтеграцію в геном клітинимих фахівцям з кваліфікацією в даній області. Нагосподаря. приклад, застосування Т-ДНК для трансформації Способи, представлені в даному винаході, рослинних клітин отримало інтенсивне дослідженможуть бути використані в поєднанні з великим ня і досить повно описано в Європейському патенспектром видів рослин. Особливо переважні клітиті ЕР 0 120 516, Hoekema et al., (1985), Chapter V ни рослин, що застосовуються відповідно до даноIn: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij го винаходу, включають в себе клітини з наступних Kanters BV, Alblasserdam); Knauf et al. (1983), рослин: сої (Glycine max), рапсу (Brassica napus, Genetic Analysis of Host Expression by Brassica campestris), соняшника (Helianthus Agrobacterium, p. 245, In: Molecular Genetics of annuus), бавовнику (Gossypium hirsutum), кукуруBacteria-Plant Interaction, Puhler, A. ed. Springerдзи (Zea mays), тютюну (Niсotiana tobacum), люцеVerlag NY); and An et al., (1985), (EMBO J., 4: 277рни (Medicago sativa), пшениці (Triticum sp.), ячме284). Трансформація Agrobacterium може бути ню (Hordeum vulgare), вівса (Avena sativa L.), сорго також використана для трансформації однодоль(Sorghum bicolor), Arabidopsis thaliana, картоплі них видів рослин (Патент США 5 591 616). (Solanum sp.), льону/льону звичайного (Linum Зручним образом, експлантати можуть кульusitatissimum), сафлору (Carthamus tinctorius), гвітивуватися з Agrobacterium tumefaciens або нейскої олійної пальми (Eleais guineeis), земляного Agrobacterium rhizogenes для створення можливогоріха (Arachis hypogaea), американського горіха сті перенесення транскрипційної конструкції в рос(Bertholletia excelsa), кокосового горіха (Cocus линну клітину-господаря. Після трансформації з nucifera), кліщовини (Ricinus communis), коріандру використанням Agrobacterium клітини рослин дис(Coriandrum sativum), гарбуза крупноплодного стопергують у відповідне середовище для відбору, лового (Cucurbita maxima), жожоба (Simmondsia потім витягують калус, паростки і зрештою рослиchinensis) і рису (Oryza sativa). ни. Agrobacterium-господар буде нести плазміду, Даний винахід має численні застосування, які що містить гени vir, необхідні для перенесення Твключають в себе поліпшення внутрішньої цінності ДНК в клітини рослин. Для ін'єкції і електропорації сім'я рослин за допомогою накопичення ними змі(див. нижче) "роззброєні" Ті-плазміди (що не манених поліпептидів або нових рекомбінантних пепють пухлинних генів, зокрема, дільниці Т-ДНК) мотидів або за допомогою включення або усунення жуть бути введені в рослинну клітину. метаболічної стадії. Застосування даного винахоЗастосування способів без використання ду може приводити до поліпшеної якості білка (наAgrobacterium дозволяє застосовувати конструкції, приклад, збільшеним концентраціям незамінних описані тут, для одержання трансформації і ексабо рідких амінокислот), поліпшеної якості ліпідів пресії у великій різноманітності однодольних і за допомогою модифікації складу жирних кислот дводольних видів рослин. Ці способи особливо або поліпшеному або збільшеному складу вуглезастосовні для трансформації видів рослин, які є водів. Приклади включають в себе експресію баганеподатливими в системі трансформації з тих сіркою білків, таких як білки, виявлені в люпині Agrobacterium. Інші способи для перенесення генів і американському горісі, в сім'ї, з сірко-невмісними включають в себе бомбардування частками амінокислотами. Поліпшена якість білків могла б (Sanford (1988), Trends in Biotechn.6: 299-302), також досягатися експресією білка або фрагмента електропорацію (Fromm et al., (1985), PNAS USA, білка, який збагачений незамінними амінокисло82: 5824-5828; Riggs and Bates, (1986), PNAS USA тами, в тому числі лізином, цистеїном, метіоніном і 83:5602-5606), опосередковане ПЕГ поглинання триптофаном. Альтернативно, міг би експресуваДНК (Potrykus et al., (1985). Mol. Gen. Genetics, тися (жирний ацил)-кофермент А-трансферазний 199: 169-177), мікроін'єкцію (Reich et al., Bio/Techn. фермент, здатний модифікувати співвідношення (1986) 4:1001-1004) і карборундові віскери жирних кислот в тригліцеридах (запасних ліпідах). (Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Rep. 9:415-418). У випадках, коли рекомбінантному білку дозволя 23 87431 24 лотна, послідовність декількох з виділених кДНК ють нагромаджуватися в сім'ї, цей білок міг би бути мала високу міру схожості з олеозинами як низьтакож пептидом, який має фармацевтичну або комолекулярного, так і високомолекулярного клапромислову цінність. У цьому випадку цей пептид су, альбуміном 2S і бобово-подібними запасними можна було б екстрагувати з сім'я і використовувабілками. Отримували зонди індивідуально з (части в неочищеному або очищеному вигляді, в залетин) кДНК, що кодують олеозини, альбумін 2S і жності від того, як це потрібно для передбачуванобобово-подібні запасні білки, і їх використовували го використання. Поліпептиди, які експресуються в для скринінгу геномної бібліотеки, отриманої з лінії сім'ї, можуть бути також фрагментами або похідForge льону, яка є гомозиготною відносно чотиними природного білка. Фармацевтично застосовні рьох генів стійкості до іржі (Anderson et al. (1997), білки можуть включати в себе, але не обмежуютьThe Plant Cell 9: 641-651). Після скринінгу з висося ними, антикоагулянти, такі як гірудин, антитіла, кою жорсткістю були ідентифіковані декілька позив тому числі моноклональні антитіла і фрагменти тивних лямбда-клонів для кожного зонда. Вставки антитіл, вакцини, цитокіни або фактори росту, такі субклонували в плазмідний вектор pBluescript і як бичачий фактор росту, холінергічний фактор секвенували. Інформація послідовності виявила, диференціювання (CDF), циліарний нейротрофічщо автори виділили, геномні копії кДНК олеозинів, ний фактор (CNTF), фактор росту фібробластів альбуміну 2S і бобово-подібних білків. Інформація (FGF), фактор росту риб, гонадотропін, колонієспослідовності геномних клонів, що містять послітимулюючий фактор гранулоцитів (G-GSF), колодовності, що кодують високо- і низькомолекулярні нієстимулюючий фактор гранулоцитів і макрофагів ізоформи олеозинів, альбумін 2S, і гена бобово(GM-CSF), гормон росту людини, інтерферон альподібного білка представлені на фігурах 1-4, відфа (IFN-a), інтерферон бета (IFN-b), інтерферон повідно. гамма (IFN-g), інтерлейкін 1-альфа (ILI-a), інтерФігура 1 і SEQ ID NO:1 показують ДНКлейкін 1-бета (ILlb), інтерлейкін-2 (IL-2), інтерлейпослідовність геномного клону льону, що кодує кін-3 (IL-3), інтерлейкін-4 (IL-4), інтерлейкін-5 (IL-5), білок олеозину 16,0 кД (низькомолекулярного або інтерлейкін-6 (IL-6), інтерлейкін-10 (IL-10), інгібуюL-ізоформи). Ідентифіковані і вказані передбачучій фактор лейкозу (LIF), тіоредоксин, колонієстивані регуляторні елементи. Вони включають в себе мулюючий фактор макрофагів (M-CSF), фактор інвертовані повтори (пари основ 805-813 і 821-829; росту мієломоноцитів, фактор росту нервової ткапари основ 1858-1866 і 1877-1885), прямі повтори нини (NGF), онкостатин М, фактор росту тромбо(пари основ 184-193 і 1102 і 1111); пари основ 393цитів (PDGF), пролактин, що трансформує фактор 402 і 1701-1710); пари основ 683-692 і 1546-1555; росту альфа (TGF-a), трансформуючий фактор пари основ 770-781 і 799-810; пари основ 955-964 і росту бета2 (TGF-b2), фактор некрозу, пухлин 1936-1945; пари основ 1483-1496 і 1513-1526; чутальфа (TNF-a) і фактор некрозу пухлин бета (TNFливий до абсцизової кислоти елемент (ABRE) (паb). Фармацевтично корисні білки можуть також ри основ 1859-1866), САСА-бокс (пари основ 1933включати в себе білки ссавців, наприклад, але не 1936), ТАТА-бокс (пари основ 1925-1931) і САТтільки, а-1-антитрипсин, білки, діючі проти ожирінбокс (пари основ 1989-1993). Вказаний також сигня, білки крові, колаген, колагеназу, еластин, еланал поліаденілювання (пари основ 3020-3025). стазу, ентеропептидазу, фібриноген, гемоглобін, Відкрита рамка прочитання уривається 1 коротким сироватковий альбумін людини, інсулін, лактофенітроном (який відмічений), і 2 екзону транслюютьрин, міоглобін і білки легеневого сурфактанту. ся і вказані в однобуквених амінокислотних кодах Застосовні в промисловості пептиди можуть IUPAC. включати, але не обмежуються ними, a-амілазу Фігура 2 і SEQ ID NO:4 показують ДНКабо інші амілази, амілоглюкозидазу, арабіназу, послідовність геномного клону льону, що кодує каталазу, целобіогідролазу, целюлази, хітинази, білок олеозину 18,6 кД (високомолекулярного або хімотрипсин, дегідрогенази, ендоглюканазу, химоН-ізоформи). Ідентифіковані і вказані передбачузин, ендогалактаназу, естерази, b-галактозидазу, вані регуляторні елементи. Вони включають в себе a-галактозидазу або інші галактозидази, шлункові прямі повтори (пари основ 14-25 і 1427-1438; пари ліпази, глюканази, глюкозоізомеразу, геміцелюлаоснов 80-89 і 1242-1251; пари основ 177-1.86 і 837зи, гідролази, ізомеразу, лігнінази, ліпази, ліази, 846; пари основ 1281-1290 і 1242-1251; пари основ лиіоцими, оксидази, оксидоредуктазу, папаїн, пек1591-1600 і 1678-1687). Відкрита: рамка прочитантинази, пектинліазу, пероксидази, фосфатази, ня не уривається нітронами і транслюється і покафітазу, протеази, пулуланази, редуктази, серинові зана в однобуквених амінокислотних кодах IUPAG. протеази, тіоредоксин, трансферазу, трипсин і Фігура 3 і SEQ ID NO:6 показують ДНКксиланазу. послідовність геномного клону льону, що кодує Приведені далі необмежувальні приклади є запасний білок 2S. Нуклеотидне секвенування такими, що ілюструють даний винахід. цього клону виявило, що він має відкриту рамку Приклад 1 прочитання з 174 амінокислот, яка показує гомолоВиділення сім'яспецифічних промоторов льону гію з групою рослинних запасних білків 2S. Ця поСім'яспецифічні кДНК-клони виділяли з бібліослідовність кодує відкриту рамку прочитання із теки сім'яспецифічних кДНК льону. Ці кДНК-клони 38% загальною схожістю із запасним білком 2S секвенували і використовували BLAST (спрощений Brassica oleracea, в тому, числі володіє абсолютінструмент пошуку з локальним зіставленням) для ним консерватизмом багатого глутаміном відрізка порівняння цих послідовностей з іншими в загальQQQGQQQGQQQ (SEQ ID NO:13). Крім того, пронодоступних базах даних, таких як Genbank. Це мотор гена запасного білка 2S містив передбачупорівняння виявило, що розшифрована амінокисвані промоторні регуляторні елементи. Вони вклю 25 87431 26 чають в себе багаті AT повтори (пари основ 25-36, вали (А) кДНК, що кодує високомолекулярну (Н) 97-108 і 167-190), RY-подібний повтор (пари основ ізоформу (ідентичної кодуючій послідовності, 240-247), G-бокс-подібний елемент (пари основ представленої на фігурі 2), і (В) кДНК, що кодує 274-280), сім'яспецифічний бокс-подібний мотив низькомолекулярну (L) ізоформу (ідентичної коду(пари основ 285-290) і ТАТА-бокс (пари основ 327ючої послідовності, представленої на фігурі 1). 333). Обидва транскрипту експресуються тільки в зароФігура 4 і SEQ ID NO:8 показують ДНКдку і насіннєвій капсулі, яка містить зародки. послідовність геномного клону льону, що кодує Приклад 3 бобово-подібний запасний білок сім'я льону 54,4 Експресія генів олеозину льону під час розвиткД. Цей ген бобово-подібного. запасного білка сіку сім'я м'я буде називатися також "лініном". РозшифроФігура 7 показує Нозерн-блот-аналіз експресії вану амінокислотну послідовність гена лініну поріолеозинів льону під час розвитку сім'я. 15 мкг на внювали з бобово-подібним білком з R. communis, доріжку загальної РНК наносили в кожну доріжку попередником бобових з М. salicifolia, Q. robur і G. на агарозному/формальдегідному гелі і блотували hirsutum, попередником глутеліну з О. sativa і зана мембрану HybondN+. 10J: Цю мембрану зондупасним білком сім'я 12 S з А. thaliana. Ген лініну вали з використанням 32Р-dCТР-міченої кДНК олепоказує ідентичність/схожість послідовності з відозину льону (низькомолекулярної ізоформи). Вкаповідними білками з R. communis, Μ. saliсifolia, Q. зані стадії представляють число днів після, robur, G. hirsutum, O. sativa і A. thaliana 59/15, цвітіння (DPA). 3Т) 15 мкг на доріжку загальної 47/16, 50/17, 45/17, 43/18 і 43/18 процентів, відпоРНК наносили в кожну доріжку на агарозновідно. Ідентифіковані і вказані передбачувані регуму/формальдегідному гелі і блотували на мембраляторні елементи промоторної дільниці. Вони ну HybondN+. 3T: Цю мембрану зондували з виковключають в себе інвертовані повтори (пари основ ристанням 32Р-dСТР-міченою кДНК олеозину 265-276 і 281-292; пари основ 513-524 і 535-545), льону (високомолекулярної ізоформи). Обидва повтори (пари основ 1349-1360 і 1367-1378; пари транскрипти експресувалися на ранній стадії розоснов 1513-1529 і 1554-1572), чутливий до абсцивитку (6 DPA, рання стадія сім'ядоль). Експресія є зової кислоти елемент (ABRE) (пари основ 1223 і максимальною при 16-20 DPA (пізня стадія сім'я1231), бокс бобових (RY-повтори) (між парами осдоль) і знижується при 22 DPA (зрілі зародки). нов 1223 і 1231), можлива дільниця боксу віціліну Приклад 4 (пари основ 1887-1894), СААТ-бокс (пари основ Тимчасова сім'яспецифічна експресія b1782-1785) і ТАТА-бокс (пари основ 1966-1970). глюкуронідази (GUS) під регуляторним контролем Показаний також сигнальний пептид для націлюрегуляторних послідовностей олеозину льону вання на мембрану ЕР (пари основ 2034-2080). Дві конструкції отримували з використанням Відкрита рамка прочитання уривається 3 короткистандартних способів молекулярної біології (нами нітронами (які відмічені), і 4 екзони транслюприклад, див. Sambrook et al. (1990), Molecular ються і вказані в однобуквених амінокислотних Cloning, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press), в тому кодах IUPАC. числі розщеплень рестриктазами, лігування і поліФігура 5 показує Саузерн-блот-аналіз геномної меразної ланцюгової реакції (ПЛР). ДНК льону. 60 мкг геномної ДНК льону виділяли з Конструкція pSC54: Репортерну кодуючу полистя, розщеплювали EcoRI (доріжка 1), Hindlll слідовність р-глюкуронідази з вектора GUSN358>S (доріжка 2) і ВаmНІ(доріжка 3) і наносили на відпо(Clontech Laboratories) вміщували між промоторвідні доріжки. А) Гібридизації виконували з випадною послідовністю від нуклеотиду 21 до нуклеотиковим образом праймованою 32Р-міченою 3Т-кДНК ду 1852 і термінаторною послідовністю від 2395 до (високомолекулярної ізоформи олеозину льону). 3501 (як описано на фігурі 1). Цю вставку клонуваВ) Гібридизації виконували з випадковим образом ли в pBluescript і одержаний вектор названий праймованою 32Р-міченою 7R-кДHK (низькомолеpSC54. кулярної ізоформи олеозину льону). Ці результати Конструкція pSG60: Репортерну кодуючу попоказують, що кДНК леозину 3Т (високомолекуляслідовність р-глюкуронідази з вектора GUSN358>S рної ізоформи олеозину), і 7R (низькомолекуляр(Clontech Laboratories) вміщували між промоторної ізоформи олеозину) гібридизуються з геномної ною послідовністю від нуклеотиду 1 до нуклеотиду ДНК льону. Більш конкретно, ці результати пока2023 і термінаторною послідовністю від 2867 до зують, що 3Т, мабуть, представляє 2-копійний ген 3925 (як описано на фігурі 2). Цю вставку клонував льоні, як видно з двох смуг в кожній доріжці розли в pBluescript і одержаний вектор названий щеплення. Подібним образом, 7R, мабуть, предpSC60. ставляє мультигенне сімейство льону, оскільки pSC54, pSC60 і не утримуючу промотору консбули виявлені численні смуги для кожного розщетрукцію GUS (контроль) вводили в зародки льону з плення. використанням бомбардування частками за допоПриклад 2 могою стандартних протоколів (наприклад, див. Сім'яспецифічна експресія генів олеозину Abenes et al. (1997) Plant Cell reports 17:1-7). Фігура льону 8 показує активність GUS зародків льону, бомбарФігура 6 показує Нозерн-блот-аналіз сім'яспедованих pSC54, pSC60 і не утримуючою промотоцифічної експресії олеозинів льону. Здійснювали ру конструкцією GUS, виміряну через 48 годин Нозерн-гібридизацію мРНК двох олеозинів в різних після бомбардування частками. Як можна бачити, тканинах. Десять мкг загальної РНК екстрагували з регуляторні послідовності олеозину льону є достарізних тканин, R, корінь; С, сім'ядоля; L, лист; S, тніми для напряму експресії GUS в зародках льонасіннєва капсула; Е, зародок. Мембрану зондуну. 27 87431 28 Приклад 5 Стабільна сім'яспецифічна експресія bСтабільна сім'яспецифічна експресія bглюкуронідази (GUS) у льоні, Arabidopsis і Brassica глюкуронідази (GUS) в льоні і Arabidopsis під регуnapus під регуляторним контролем регуляторних ляторним контролем промотору гена запасного послідовностей гена бобово-подібного запасного білка 2S білка льону Конструкцію репортерного гена GUS отримуКонструкцію отримували з використанням ставали шляхом вбудовування 5’ і 3’ дільниць фрагндартних способів молекулярної біології, в тому мента ДНК, описаного на фігурі 3, в не утримуючислі розщеплень рестриктазами, лігування і полічий промотору вектор GUS pBI101 таким чином. меразної ланцюгової реакції (ПЛР). Для одержанАмплікон 400 п.н. з 5'-кінця ДНК-фрагмента, ня ДНК-фрагменту, що містить приблизно 2 т.п. н. описаного на фігурі 3, ампліфіцкували з викорисз 5'-дільниці ініціації транскрипції бобово-подібного танням ПЛР із застосуванням наступних праймерів запасного білка сім'я льону, в конфігурації, відпо(місцеположення показано на Фіг.3): відній для лігування в кодуючу GUS послідовність, 5’ праймер (1): 5'-TCCACTATGTAGGTCATA-3' використали підхід на основі ПЛР. Він включав в (SEQ ID NO:14) себе застосування полімеразної ланцюгової реак3’ праймер (1): 5'-CTTTAAGGTGTGAGAGTC-3’ ції для ампліфікації точної послідовності, бажаної (SEQ ID NO:15) для експресійного аналізу. Для виконання необЦі ПЛР-праймери містили також сайти рестрихідної ПЛР-ампліфікації синтезували два олігонуккції для HindIll і ВаmНІ, які використовували для леотидних праймери (Beckman Oligo 1000М ДНКклонування 5'UТR-амплікону 400 п.н. в сайти синтезатор), які мають наступні послідовності: Hindlll/BamHI вектора рВІ101 попереду репортер5’праймер: ного гену GUS. Амплікон 736 п.н. з 3'5'TATCTAGACTCAAGCATACGGACAAGGGT 3' нетрансльованої дільниці (3'-UTR) ДНК(SJ-634) (SEQ ID NO:18) фрагменту, описаної на фігурі 3, ампліфікували з Зображені курсивом основи відповідають нуквикористанням ПЛР із застосуванням наступних леотидним положенням 1-21 в послідовності, праймерів (місцеположення показано на Фіг.3): представленій на фігурі 4. Додаткові 5'-нуклеотиди 5’ праймер (2): 5’-AGGGGTGATCGATTAцієї послідовності в праймері не є ідентичними 3'(SEQ ID NO:16) промоторній послідовності, але були включені для 3' праймер (2): 5’- GATAGAACCCACACGAGCвміщення сайту Xbal в 5'-кінці продукту ампліфіка3’ (SEQ ID NO:17) ції. Сайт Xbal (5’-TCTAGA-3’) (SEQ ID NO: 19) підЦі ПЛР-праймери містили також сайти рестрикреслений. кції для SacI і EcoRI. Дільницю термінації NOS векСинтезували другий праймер (3’), який мав натора рВІ101 вирізали розщепленням SacI/EcoRI і ступну послідовність: замінювали подібним образом розщепленим амп3'-праймер: 5'GGTTATCATTGTATGAACTGA 3' ліконом 3'UTR 736 п.н. ДНК-фрагменту, описаного (SJ-618) (SEQ ID NO:20) на фігурі 3. Потім репортерну конструкцію GUS Цей праймер містить точний комплемент (поелектропорували в штам Agrobacterium казаний курсивом) послідовності, показаної на tumefaciens AGLI і трансформацію льону (Finnegan фігурі 4 від основи 2343 до основи 2363. Цей et al. (1993) Plant Mol Biol. 22(4): 625-633) і праймер сконструйований без додаткового сайта Arabidopsis (Valvekens et al. Proc. Natl. Acad. Sсi. рестриктази внаслідок того, що природний сайт 85: 5536-5540) проводили відповідно до описаних Ncol (5'-ССАТGG-3’) (SEQ ID NO:21) охоплює стараніше протоколів. ртовий кодон між парами основ 2034 і 2039, робРізні тканини з рослин льону і Arabidopsis, нелячи тим самим можливою вставку промотору сучі репортерну конструкцію GUS, аналізували запасного білка у відповідний клонуючий вектор. гістологічно на виявлення активності GUS. У випаЦі два праймери використали вреакції ПЛРдку льону, тканину листа, тканину кореня і зародки ампліфікації з одержанням ДНК-фрагменту, що середньої зрілості, вирізані з сім'я, що розвиваєтьмістить послідовність між нуклеотидом 1 і нуклеося, забарвлювали на активність GUS. Для тидом 2342 гена запасного білка сім'я льону з сайArabidopsis, із сім'я, що розвивається забарвлюватом Xbal на 5'-кінці і сайтом Ncol на відстані 302 ли на GUS in situ в їх стручках. п.н. від 3'-кінця. ПЛР-ампліфікацію виконували з Забарвлення GUS проводили зануренням ткавикористанням ферменту Pfu (Stratagene) із застонин в гістохімічний буфер, що містить 0,5 мМ Хсуванням умов, що рекомендуються виробником глюк, 0,5 Μ калій-фосфатний буфер (pH 7,0), 1 мМ ферменту, і програми температур 94°С (денатураЕДТА, 0,5Μ сорбітал, 0,5 мМ фериціанід калію і 0,5 ція) протягом 1 хв., 55°С (відпал) протягом 1 хв. і мМ фероціанід калію. Реакцію фарбування прово72°С (подовження) протягом 3,5 хв. Матрицею був дили протягом 12-16 годин при 37°С і цю реакцію геномний клон запасного білка сім'я бобових, позупиняли додаванням 95% етанолу. Тканини потім казаний на фігурі 4. освітлювали звільненням від хлорофілу промивПотім одержаний продукт ампліфікації розщекою в 95% етанолі перед фотографуванням. Фігуплювали Xbal і Ncol для видалення бажаної прора 9 показує явний доказ сильної активності GUS в моторної дільниці 2 т.п. н. Цей промоторний фрагзародках льону, що розвиваються і сім'ї мент клонували в сайти Xbal і Ncol розщепленої Arabidopsis і відсутність доказу експресії репортеXbal і Ncol плазміди, названої pGUS1318 (плазміду рного гена GUS в корінні або листі льону або в pGUSN358S (Clontech Laboratories) розрізали Ncol стінках стручків Arabidopsis. і EcoRl і вставку GUS клонували в pBluescriptKS+ Приклад 6 (Stratagene), яка була пристосована для змісту сайту Ncol в сайті множинного клонування). Одер 29 87431 30 жана плазміда, що містить гібрид промотор-GUS, яка додає стійкість до антибіотика канаміцину)). була названа pPGUS1318. Термінатор запасного Одержаний вектор був названий pSBS2083. Плазбілка сім'я бобового з льону також ампліфікували з міди pSBS2089 і pSBS2083 електропорували в вищезазначеного геномного клону. Для виконання штам Agrobacterium EHA101. Штам Agrobacterium необхідної ПЛР-ампліфікації синтезували олігонуEHA101 (pSBS2089) використали для трансфорклеотидні праймери, що мають наступні послідовмації льону і Arabidopsis, штам Agrobacterium ності: ЕНА101 (pSBS2083) використали для трансфор5'праймер: 5’ мації Brassica napus. Трансформацію льону викоGCAAGCTTAATGTGACGGTGAAATAATAACGG 3’ нували по суті, як описано в Jordan and McHughen (SJ-620) (SEQ ID NO:22) (1988) Plant cell reports 7: 281-284, за винятком Зображені курсивом основи відповідають нуктого, що трансгенні паростки відбирали на 10 мкМ леотидним положенням 3780-3803 в послідовносL-фосфінотрицині, замість канаміцину. Трансфорті, представленій на фігурі 4. Додаткові 5'мацію Arabidopsis виконували по суті, як описано в нуклеотиди від цієї послідовності в даному прай"Arabidopsis Protocols; Methods in Molecular мері не є ідентичними даній промоторній послідоBiology" Vol. 82. Edited by Martinez-Zapater IM and вності, але були включені для вміщення сайту Salinas J. ISBN 0-89603-391-0 pg. 259-266 (1988), Hindlll в 5'-кінці продукту ампліфікації. Сайт Hindlll за винятком того, що гадані трансгенні рослини (5'-ААGСТТ-3') (SEQ ID NO:23) підкреслений. відбирали на агарозних чашках, що містять 80 мкМ Синтезували другий праймер (3’), який мав наL-фосфінотрицин. Трансформацію Brassica napus ступну послідовність: виконували по суті, як описано в Moloney et al. 3'-праймер: (1989), Plant Cell Reports, 8:238-242. 5’TAGGTACCTGGCAGGTAAAGACTCTGCTC 3' Фігура 10 показує тканеспецифічну експресію (SJ-618) (SEQ ID NO:24) GUS в трансгенних рослинах льону, трансформоЦей праймер містить точний комплемент (пованих генною конструкцією лінін-GUS (pSBS2089). казаний курсивом) послідовності, показаної на Експресію GUS вимірювали в корінні (R), стеблах фігурі 4 від основи 4311 до основи 4290. Додаткові (S), листі (L), бруньках (В) і зародку (Е). Деяка екс5’-нуклеотиди від цієї послідовності в праймері не пресія спостерігалася в бруньках і маскимальна є ідентичними промоторній послідовності, але буекспресія досягалася в тканинах зародка. Не було ли включені для вміщення сайту КрnІ на 5'-кінці детектованої експресії в жодній з нетрансформопродукту ампліфікації. Сайт КрnІ (5’-GGTACC-3’) ваних тканин (дикого типу, WT). (SEQ ID NO:25) підкреслений. Фігура 11 показує тимчасову експресію GUS в Ці два праймeри використали в реакції ПЛРтрансгенних рослинах льону, трансформованих ампліфікації з одержанням ДНК-фрагменту, що конструкцією лінін-GUS (pSBS2089). Як можна містить послідовність між нуклеотидом 3779 і нукбачити, максимальна експресія досягалася в зрілеотидом 4311 термінатора гена запасного білка лих (заздалегідь висушених) зародках льону. сім'я льону з сайтом Hindlll на 5'-кінці і сайтом КрnІ Фігура 12 показує абсолютну експресію GUS в на 3'-кінці. ПЛР-ампліфікацію виконували, як опитрансгенних рослинах Brassica napus (L1-L9), сано вище. Вищезгаданий вектор pPGUS1318, трансформованих генною конструкцією лінін-GUS який містить ампліфікований промотор, розщеп(pSBS2083). Як можна бачити, в рослинах Brassica лювали Xhol і обробляли фрагментом Кленова napus може бути досягнутий високий рівень ексдля створення тупого кінця. Потім цей вектор розпресії. При порівнянні індивідуальних трансгенних щеплювали КрnІ і ампліфіковану, як описано вирослин можна також бачити типову варіацію в ексще, термінаторну послідовність вбудовували тапресії, зумовлену ефектом позиціонування. ким чином, що вона була розташована 3’ Фігура 13 показує експресію GUS в трансген(праворуч) від кодуючої GUS послідовності. Одерних стручках Arabidopsis (трансформованих генжаний вектор, що містить промотор запасного білною конструкцією лінін-GUS (pSBS2089)) під час ка сім'я льону, GUS і термінатор запасного білка розвитку сім'я. Як можна бачити, в тканинах сім'я сім'я льону, названий pPGUST. Arabidopsis може бути досягнутий високий рівень Вставку Xbal-Kpnl pPGUST, яка містить консекспресії. Максимальна експресія досягається на трукцію промотор лініну-кодуюча GUS послідостадії 4 (зрілі, але не повністю висохлі) розвитку ність-термінаторна послідовність лініну, лігували в сім'я. Не спостерігали детектованої експресії в сайти Xbal-Kpnl pSBS3000 (Цей вектор є похідним тканинах, що не відносяться до сім'я, таких як лисбінарної плазміди рΡΖΡ221 Agrobacterium тя, стебла, коріння і стінки стручків (результати не (Hajdukiewicz et al., 1994, Plant Molec. Biol. 25: 989показані). 994). В pSBS3000 рослинний ген стійкості до генХоч даний винахід був описаний з посиланням таміцину pPZP221 був замінений конструкцією на переважні приклади, повинне бути зрозуміле, промотор убікитину петрушки-ген фосфінотрицинщо даний винахід не обмежується описаними приацетилтрансферази-послідовність термінації убікладами. китину петрушки для придання стійкості до гербіНавпаки, передбачається, що даний винахід циду глюфозинату амонію). Одержаний вектор включає в себе різні модифікації і еквіваленти, що названий pSBS2089. Крім того, вставка Xbal-Kpnl знаходяться в рамках ідеї і об'єму прикладеної pPGUST, яка містить конструкцію промотор лінінуформули винаходу. Всі публікації, патенти і патенкодуюча GUS послідовність-термінаторна послідотні заявки включені тут як посилання в повному вність лініну, лігували в сайти Xbal-Kpnl бінарної об'ємі, в такій же мірі, як якби кожна окрема публіплазміди pCGN1559 Agrobacterium (MacBride and кація, патент або патентна заявка були особливо і Summerfield, 1990, Plant Molec. Biol. 14: 269-276, 31 87431 індивідуально вказані як включені в якості посилання в повному об'ємі. 32 33 87431 34 35 87431 36 37 87431 38 39 87431 40 41 87431 42 43 87431 44 45 87431 46 47 87431 48 49 87431 50 51 87431 52 53 87431 54 55 87431 56 57 87431 58 59 87431 60