Модифікований зв’язуючий протеїн, що інгібує взаємодію vegf-а-рецептора

Реферат: Винахід стосується рекомбінантних зв'язуючих протеїнів, що містять поліетиленгліколевий фрагмент з молекулярною масою від 1 до 100 кДа та зв'язуючий анкіриновий домен, що повторюється, з SEQ ID NО: 1-7, які інгібують зв'язування VEGF-Axxx з VEGFR-2. UA 111820 C2 (12) UA 111820 C2 UA 111820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь винаходу Представлений винахід стосується модифікованих рекомбінантних протеїнів специфічних до VEGF-A, а також фармацевтичних композицій, що містять такі протеїни, та застосування таких протеїнів в лікуванні пухлин та захворювань очей. Передумови створення винаходу Ангіогенез, ріст нових кровоносних судин з вже існуючих судин, є ключовим процесом при деяких патологічних станах, в тому числі, рості пухлин та захворюваннях очей, зокрема, при очних неоваскулярних захворюваннях, таких як вікова дегенерація жовтої плями (AMD) або діабетичний макулярний набряк (DME) (Carmeliet, P., Nature 438, 932–936, 2005). Фактори росту ендотелію судин (VEGFs) стимулюють ангіогенез и лімфоангіогенез шляхом активації рецептора VEGF (VEGFR) тирозинкіназ в клітинах ендотелію (Ferrara, N., Gerber, H. P. and LeCouter, J., Nature Med. 9, 669-676, 2003). Родина VEGF ссавців складається з п'яти глікопротеїнів, що мають назви VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D (також відомі як FIGF) та фактор росту плаценти (PlGF, також відомий як PGF). Було показано, що VEGF-A є ефективною мішенню для антиангіогенної терапії (Ellis, L. M. and Hicklin, D. J., Nature Rev. Cancer 8, 579-591, 2008). Ліганди VEGF-A зв'язуються з та активують три структурно подібні типи III рецептора тирозинкіназ, які називаються VEGFR-1 (також відомий як FLT1), VEGFR-2 (також відомий як KDR) та VEGFR-3 (також відомий як FLT4). Ліганди VEGF мають відмінні особливості, які притаманні для кожного з цих рецепторів тирозинкінази, які сприяють різноманітності їх функцій. У відповідь на зв'язування лігандів, VEGFR тирозинкінази активують мережу різних низхідних сигнальних шляхів. VEGFR-1 та VEGFR-2 є, в першу чергу, знайденими на ендотелії судин, тоді як VEGFR-3 зустрічається в основному на лімфатичному ендотелії. У всіх даних рецепторів є позаклітинний домен, одна трансмембранна ділянка та загальний типовий елемент структури послідовності тирозинкіназ, перерваний за рахунок домену вставки кінази. Зовсім недавно нейропілін (NRP-1), спочатку визначений як рецептор для родини семафорин/коллапсин нейрональних медіаторів введення, був показаний як ізоформний специфічний рецептор VEGF-A. Різні ізоформи VEGF-A, як відомо, є утвореними альтернативним сплайсингом з восьми екзонів з VEGF-A геном. Все ізоформи містять екзони 1-5 та термінальний екзон, екзон 8. Екзони 6 та 7, які кодують гепарин-зв'зуючі домени, можуть бути включеними або виключеними. Це дає початок родині протеїнів, названих у відповідності з їх амінокислотним порядковим номером: VEGF-A165, VEGF-A121, VEGF-A189, і так далі. Екзон 8, однак, містить два 3" сайти сплайсування в нуклеотидних послідовностях, які можуть бути використані клітиною для створення двох родин ізоформ з однаковою довжиною, але які відрізняються С-термінальними амінокислотними послідовностями (Varey, A.H.R. et al., British J. Cancer 98, 1366-1379, 2008). VEGF-Axxx ("XXX" означає порядковий номер амінокислоти зрілий протеїн), проангіогенна родина ізоформ, є створеною шляхом використання найбільш проксимальної послідовності в екзоні 8 (в результаті включення екзона 8а). Зовсім недавно описані антиангіогенні VEGF-Axxxb ізоформи створюються шляхом використання дистального сайту сплайсування, 66 базова точка далі за геном від проксимального сайту сплайсування. Це в результаті призводить до сплайсинга екзона 8а та продукування послідовності мРНК, яка кодує VEGF-Axxxb родину. VEGF-A165 є домінуючою проангіогенною ізоформою та, як правило, надлишково експресується в різних солідних пухлинах людини. VEGF-A165b був першим з визначених екзон-8b-кодованих ізоформ, та було показано, що вони мають антиангіогенні ефекти (Varey et al., в цитованому місці; Konopatskaya, O. et al., Molecular Vision 12, 626-632, 2006). Це є ендогенною інгібуючою формою VEGF-A, яка зменшує VEGF-А, що індукує проліферацію та міграцію ендотеліальних клітин. Незважаючи на те, що він може зв'язуватися з VEGFR-2, VEGFA165b, зв'язування в результаті не призводить до фосфорилювання рецептора або активації низхідних сигнальних шляхів. Існує декілька підходів до інгібування VEGF-A сигнальної системи, в тому числі нейтралізація ліганду або рецептора антитіл, та блокування активації VEGF-рецептора та сигнальної системи інгібіторами тирозинкінази. Показано, що VEGF-направлена терапія є ефективною як іонотерапія при AMD, DME, нирково-клітинній карциномі та гепатоцеллюлярній карциномі, виходячи з того, що це є перевагою тільки в поєднанні з хіміотерапією у пацієнтів з метастатичним коло-ректальним раком, не-дрібноклітинним раком легенів та метастатичним раком молочної залози (Narayanan, R. et al., Nat Rev. Drug Discov. 5, 815-816, 2005; Ellis and Hicklin, в цитованому місці). Крім антитіл, інші зв'язуючі домени можуть бути застосовані для нейтралізації ліганду або рецептора (Skerra, A., J. Mol. Recog. 13, 167-187, 2000; Binz, H. K., Amstutz, P. and Plückthun, A., Nat. Biotechnol. 23, 1257-1268, 2005). Один такий новий клас зв'язуючих доменів ґрунтується на 1 UA 111820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сконструйованих доменах, що повторюються (WO 02/20565; Binz, H. K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, M. T., Briand, C., Forrer, P., Grütter, M. G., and Plückthun, A., Nat. Biotechnol. 22, 575-582, 2004). WO 02/20565 описує, як можуть бути сконструйовані великі бібліотеки протеїнів, що повторюються, та їх загальне застосування. Однак, WO 02/20565 зовсім не розкриває вибір доменів, що повторюються, зі специфічністю зв'язування для VEGF-Axxx, ні конкретних мотивів послідовності, що повторюються, доменів, що повторюються, які специфічно зв'язуються з VEGF-Axxx. Направлений VEGF-A з поточною доступною терапією не є ефективним у всіх хворих, або для всіх захворювань (наприклад, EGFR-експресуючого раку). Стало навіть очевидним все в більшій степені, що терапевтичний ефект, пов'язаний з VEGF-направленою терапією, є складним та, вірогідно, включає різноманітні механізми (Ellis and Hicklin, в цитованому місці). Наприклад, існуючі на ринку анти-VEGF лікарські засоби, такі як бевацизумаб (Авастин ®) або ранибізумаб (Луцентис ®) (дивись WO 96/030046, WO 98/045331 та WO 98/045332) або лікарські засоби, що знаходяться в клінічній розробці, такі як VEGF-Trap® (WO 00/075319) не роблять відмінностей між про- та анти-ангіогенними формами VEGF-A, таким чином вони інгібують обидві форми. В результаті, вони інгібують ангіогенез, але, крім того, залишають здорові тканини суттєвого фактора виживання, а саме VEGF-Axxxb, що в результаті призводить до цитотоксичності та побічним ефектам, що обмежують дозу, які, в свою чергу, обмежують ефективність. Побічними ефектами, загальними для існуючих анти-VEGF терапій, є шлунковокишкові перфорації, кровотечі, артеріальна гіпертензія, випадки тромбоемболії и протеїнурії (Kamba, T. and McDonald, D.M., Br. J. Cancer 96, 1788-95, 2007). Іншим існуючим на ринку антиVEGF лікарським засобом для лікування AMD є пегаптаніб (WO 98/018480; Макуген®, зареєстрована торгівельна марка компанії Pfizer). Пегаптаніб є пегильованим анти-VEGF аптамером, один молекулярний ланцюг нуклеїнової кислоти, яка специфічно зв'язується з протеїном-мішенню. Для лікування неоваскулярної AMD існує достатньо доказів того, що результати, що спостерігаються з Луцентисом® перевершують ті, що з Макугеном®, та немає певних доказів, які припускають різницю в безпеці між препаратами. В результаті, Макуген® не є таким, що часто застосовують в терапії даного захворювання. В цілому, існує необхідність в покращених анти-ангіогенних агентах для лікування рака та інших патологічних станів. Технічною проблемою, що лежить в основі представленого винаходу, є визначення нових анти-ангіогенних агентів, таких як доменів, що повторюються зі специфічністю зв'язування з VEGF-Axxx, для покращення лікування раку та інших патологічних станів, наприклад, очних захворювань, таких як AMD або DME. Вирішення даної технічної проблеми досягається шляхом забезпечення варіантів здійснення, представлених в формулі винаходу. Коротке викладення суті винаходу Представлений винахід стосується рекомбінантних зв'язуючих протеїнів, які містять анкіриновий домен, що повторюється, та частину поліетиленгліколю молекулярною масою не -9 менше 5 кДа, в якому вказаний анкіриновий домен зв'язує VEGF-Axxx з Kd менше 10 M та інгібує VEGF-Axxx зв'язування з VEGFR-2. В переважному втіленні винаходу, частина поліетиленгліколю є зв'язаною з одним залишком Cys зв'язуючого домену. Крім того, винахід стосується фармацевтичної композиції, що містить один або більше з вказаних вище зв'язуючих протеїнів або молекул нуклеїнових кислот. Крім того, винахід стосується способу лікування раку та інших патологічних станів, наприклад, очних захворювань, таких як AMD або DME, із застосуванням зв'язуючих протеїнів винаходу. Короткий опис фігур Фігура 1. Специфічний VEGF-A164 собаки зв'язування вибраних сконструйованих анкіринових протеїнів, що повторюються. Взаємодію вибраних клонів з VEGF-A164 (VEGF) собаки та негативним контрольним протеїном (MBP, Escherichia coli мальтоза зв'язуючий протеїн) демонструють за допомогою сирого екстрактного ІФА. Біотинільовані VEGF-A164 та MBP собаки були іммобілізовані на нейтравидині. Числа відносяться до одиничних DARPin клонів, вибраних в рибосомі, що проявляються по відношенню до VEGF-A164 собаки або відповідного VEGF-A165 людини. А = Поглинання. Білі стовбці показують зв'язування з VEGF-A164 собаки, чорні стовбці показують неспецифічний фон зв'язування з MBP. Фігура 2. Інгібування розростання сфероїда за допомогою вибраних DARPin. Довжина відростків при інгібуванні розростання сфероїду демонструється в присутності різних концентрацій (а) DARPin # 30 (амінокислоти з 1 по 126 з SEQ ID NO: 4), DARPin зі 2 UA 111820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 специфічністю до VEGF-Axxx, або (b) DARPin NC, негативного контролю DARPin без специфічності до VEGF-Axxx. Фігура 3. Специфічне розпізнання VEGF-A ізоформ. Поверхнево-плазмонний резонансний (SPR) аналіз зв'язуючих протеїнів на VEGF-A ізоформи. (а) і (b): SPR аналіз Авастину®. 250 нМ Авастину® застосовували до проточної комірки з іммобілізованими VEGF-A164 собаки (а) або VEGF-A164b собаки (b) протягом 100 секунд, з наступним промиванням буферним потоком. (c) і (d): SPR аналіз DARPin # 27 (амінокислоти з 1 по 159 з SEQ ID NO: 1). 250 нМ DARPin # 27 застосовували до проточної комірки з іммобілізованими VEGF-A164 собаки (с) або VEGFA164b собаки (г) протягом 100 секунд, з наступним промиванням буферним потоком. РО = резонансні одиниці. Фігура 4. Ефективне інгібування VEGF-A165 людини в оці кролика. Судинні моделі блокування біохімічного процесу мутацією на кроликах, щоб продемонструвати ефективність DARPin в інгібуванні VEGF-A165 людини в оці в порівнянні з Луцетисом®. В 1-й день або PBS, DARPin # 30 або Луцетис® застосовують шляхом ін'єкції в скловидне тіло в одне око кожного кролика (оброблене око). На 4-й день або на 30 день робили ін'єкції в скловидне тіло обох очей кожного кролика по 500 нг VEGF-A165 людини. Всі очі оцінювали через 48 годин після ін'єкцій VEGF-A165 шляхом вимірювання вмісту флуоресцеїну в скловидному тілі та сітківці всіх очей через одну годину після внутрішньовенного ін'єкційного введення флуоресцеїну натрію. R = відношення виміряної кількості флуоресцеїну в обробленому оці/ необробленому оці. Стандартні відхилення показані за допомогою величини похибки. 4-PBS = співвідношення через 4 дні після ін'єкції PBS (контроль); 4-D = співвідношення через 4 дні після ін'єкції DARPin # 30, 30-D = співвідношення через 30 днів після ін'єкції DARPin # 30, 4-Л = співвідношення через 4 дні після введення Луцетиса®; 30-Л = співвідношення через 30 днів після ін'єкції Луцетиса®. Детальний опис винаходу VEGF-A ссавців існує у вигляді двох родин альтернативних сплайсованих ізоформ: (i) проангіогенних "VEGF-Axxx" ізоформ, утворених шляхом проксимального сплайсинга екзона 8 та (ii) анти-ангіогенних "VEGF-Axxxb" ізоформ, утворених шляхом дистального сплайсинга екзона 8. Переважно, зв'язуючий домен у відповідності з винаходом є специфічним для про-ангіогенних VEGF-Axxx, що походять від собаки, кролика, мавпи або людини. Більш переважно, зв'язуючий домен у відповідності з винаходом є специфічним для про-ангіогенних VEGF-Axxx людського походження. Найбільш переважно, зв'язуючий домен у відповідності з винаходом є специфічним для VEGF-A165 людини. Термін "протеїн" стосується поліпептиду, в якому щонайменше, частина поліпептиду має, або здатна набувати певне трьохвимірне розташування шляхом утворення вторинних, третинних або четвертинних структур всередині та/або між його поліпептидного(ими) ланцюга(ами). Якщо протеїн містить два або більше поліпептида, окремі поліпептидні ланцюги можуть бути нековалентно або ковалентно зв'язані, наприклад, за рахунок дисульфідного зв'язку між двома поліпептидами. Частина протеїну, кожна з яких індивідуально має або здатна набути певне трьохвимірне розташування шляхом утворення вторинних або третинних структур, називається "доменом протеїну". Такі домени протеїну добре відомі практикуючим кваліфікованим спеціалістам в даній галузі з рівня техніки. Термін "рекомбінантний", як наприклад, в словосполученнях рекомбінантний протеїн, рекомбінантний домен протеїну і тому подобних, означає, що вказані поліпептиди продукуються шляхом застосування технологій рекомбінантних ДНК, добре відомих практикуючим кваліфікованим спеціалістам в даній галузі з рівня техніки. Наприклад, рекомбінантні молекули ДНК (наприклад, продуковані шляхом генного синтезу), що кодують поліпептиди, можуть бути клоновані в бактеріальний експресійний плазмід (наприклад, pQE30, Qiagen). Коли такий сконструйований рекомбінантний експресійний плазмід вводиться в бактерії (наприклад, E. coli), ці бактерії можуть продукувати поліпептид, що кодується цією рекомбінантною ДНК. Відповідно, продукований поліпептид називається рекомбінантним поліпептидом. Термін "поліпептидна мітка" стосується амінокислотної послідовності, приєднаної до поліпептиду/протеїну, в якому вказану амінокислотну послідовність застосовують для очистки, виявлення або націлювання вказаного поліпептиду/протеїну, або в якому у вказаній амінокислотній послідовності вдосконалюють фізико-хімічну поведінку поліпептиду/протеїну, або в якому вказана амінокислотна послідовність демонструє ефекторну функцію. Окремі поліпептидні мітки, фрагменти та/або домени зв'язуючого протеїну можуть бути зв'язані один з одним безпосередньо або через поліпептидні лінкери. Дані поліпептидні мітки всебічно добре 3 UA 111820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 відомі в даній галузі з рівня техніки та є широко доступними для кваліфікованого спеціаліста в даній галузі з рівня техніки. Прикладами поліпептидних міток є невеликі поліпептидні послідовності, наприклад, His, myc, FLAG або Strep-мітки або фрагменти, такі як ферменти (наприклад, ферменти, такі як лужна фосфатаза), які дозволяють виявити вказаний поліпептид/протеїн, або фрагменти, які можуть бути використані для маркування (наприклад, імуноглобуліни або їх фрагменти) та/або як ефекторні молекули. Термін "поліпептидний лінкер" стосується амінокислотної послідовності, яка є здатною зв'язувати, наприклад, два протеїнових домени, поліпептидну мітку та протеїновий домен, протеїновий домен та неполіпептидний фрагмент, такий як поліетиленгліколь, або дві мітки послідовностей. Такі додаткові домени, мітки, неполіпептидні фрагменти та лінкери відомі кваліфікованим спеціалістам в даній галузі з рівня техніки. Перелік прикладів наводиться в описі патентної заявки WO 02/20565. Конкретними прикладами таких лінкерів є гліцин-серин-лінкери та пролін-треонин-лінкери змінної довжини, переважно, вказані лінкери мають довжину від 2 до 24 амінокислот, більш переважно, вказані лінкери мають довжину від 2 до 16 амінокислот. В контексті представленого винаходу термін "поліпептид" стосується молекули, що складається з однієї або декількох ланцюгів зі складною структурою, тобто дві або більше амінокислоти, зв'язані шляхом пептидних зв'язків. Переважно, поліпептид складається з більше, ніж восьми амінокислот, зв'язаних шляхом пептидних зв'язків. Термін "полімерний фрагмент" стосується або протеїнового полімерного фрагменту або непротеїнового полімерного фрагменту. "Протеїновий полімерний фрагмент" переважно представляє собою поліпептид, який не утворює стабільної третинної структури, в той же час не утворює більш ніж на 10 % (переважно, не більш ніж на 5 %, також переважно, не більш ніж на 2 %, ще більш переважно, не більше 1 %, та найбільш переважно, кількості, які не виявляються, як визначено за допомогою розмірної ексклюзійної хроматографії (гель-хроматографії SEC)), олігомерів або агрегатів в процесі зберігання при концентрації близько 0,1 мм в PBS при кімнатній температурі протягом одного місяця. Такі протеїнові полімерні фрагменти протікають при середній (вдаваній) молекулярній масі в SEC, яка є більш високою, ніж їх ефективна молекулярна маса, коли використовуються глобулярні протеїни як стандарти молекулярної маси для SEC. Переважно, середня молекулярна маса вказаних протеїнових полімерних фрагментів, визначена за допомогою SEC, є в 1,5x, 2x або 2,5x вище, ніж їх ефективна молекулярна маса, розрахована за їх амінокислотною послідовністю. Також переважно, середні молекулярні маси вказаних не протеїнових полімерних фрагментів, визначені за допомогою SEC, є в 2x, 4x або 8x вище, ніж їх ефективна молекулярна маса, розрахована виходячи з їх молекулярного складу. Переважно, більш ніж 50 %, 70 % або навіть 90 % амінокислот вказаного протеїнового полімерного фрагменту не утворюють стабільних вторинних структур при концентрації близько 0,1 мм в PBS при кімнатній температурі, як це визначено шляхом вимірів методом кругового дихроїзму (КД). Найбільш переважно, вказаний протеїновий полімер демонструє типові в ближній УФ КД-спектри випадкової конформації спіралі. Такі аналізи КД добре відомі кваліфікованому спеціалісту в даній галузі з рівня техніки. Також переважними є протеїнові полімерні фрагменти, які складаються з більш ніж 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 або 800 амінокислот. Прикладами протеїнових полімерних фрагментів є XTEN® (зареєстрований торгівельний знак Амунікс, WO 07/103515) поліпептиди або поліпептиди, що містять залишки проліну, аланіну та серину, як описано в WO 08/155134. Такі протеїнові полімерні фрагменти можуть бути ковалентно зв'язані, наприклад, зі зв'язуючим доменом за винаходом шляхом утворення генетичних злитих поліпептидів з використанням стандартних технологій клонування ДНК, з наступною їх стандартною експресією та очисткою. Приклади зв'язуючих протеїнів, які містять домени, що повторюються, які зв'язують VEGF-Axxx, та такий протеїновий полімерний фрагмент, як представлено в SEQ ID NO: 1 та SEQ ID NO: 4. Положення амінокислот з 1 до 159 в SEQ ID NO: 1 відповідають домену, що повторюються, та положення амінокислот з 161 до 1'025 в SEQ ID NO: 1 відповідають протеїновому полімерному фрагменту. положення амінокислот з 1 до 126 в SEQ ID NO: 4 відповідають домену, що повторюються, та положення амінокислот з 131 до 640 в SEQ ID NO: 4 відповідають протеїновому полімерному фрагменту. полімерний фрагмент за винаходом може варіювати в широких межах молекулярної маси (тобто, від приблизно 1 кДа до приблизно 150 кДа). Переважно, полімерний фрагмент має молекулярну масу, щонайменше, 2, 5, 10, 20, 30, 50, 70 або 100 кДа. Переважно, вказаний полімерний фрагмент є зв'язаним за рахунок поліпептидного лінкера зі зв'язуючим доменом. Прикладами таких поліпептидних лінкерів є амінокислоти з 1 до 8 з SEQ ID NO: 8 та SEQ ID NO: 9. 4 UA 111820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Прикладами не протеїнових полімерних фрагментів є гідроксіетилкрохмаль (HES), поліетиленгліколь (ПЕГ), поліпропіленгліколь або поліоксіалкілен. Термін "ПЕГильований" означає, що ПЕГ-фрагмент є ковалентно зв'язаним, наприклад, з поліпептидом даного винаходу. Прикладами протеїнів, що повторюються, які містять поліпептидний лінкер між доменом, що повторюється, та С-термінальним Cys залишком прийнятним для зв'язування не протеїнового полімерного фрагмента, є SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6 и 7. В конкретному втіленні винаходу, ПЕГ фрагмент або будь-який інший не протеїновий полімер може, наприклад, зв'язувати тіол цистеїну за допомогою малеімідного лінкеру з цистеїном, який є приєднаним за допомогою пептидного лінкеру до N- або С-кінця зв'язуючого домену, як описано в даному документі (наприклад, SEQ ID NO: 3). Термін "зв'язуючий протеїн" стосується протеїну, що містить один або більше зв'язуючих доменів та один або більше полімерних фрагментів, як далі буде пояснено. Переважно, вказаний зв'язуючий протеїн містить до чотирьох зв'язуючих доменів. Більш переважно, вказаний зв'язуючий протеїн містить до двох зв'язуючих доменів. Найбільш переважно, вказаний зв'язуючий протеїн містить тільки один зв'язуючий домен. Крім того, будь-який такий протеїн може містити додаткові протеїнові домени, які не є зв'язуючими доменами, мультимеризаційними фрагментами, поліпептидними мітками, поліпептидними лінкерами та/або одним Cys залишком. Прикладами мультимеризаційних фрагментів є константні ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну, які спаровуються, щоб забезпечити функціональні Fc домени імуноглобуліну, та лейцинові зіппери або поліпептиди, що містять вільний тіол, який утворює міжмолекулярні дисульфідні зв'язки між двома такими поліпептидами. Єдиний Cys залишок може бути використаним для кон'югації інших фрагментів з поліпептидами, наприклад, шляхом використання малеімідної хімії, добре відомої кваліфікованому спеціалісту в даній галузі з рівня техніки. Переважно, вказаний зв'язуючий протеїн містить до чотирьох полімерних фрагментів. Більш переважно, вказаний зв'язуючий протеїн містить до двох полімерних фрагментів. Найбільш переважно, вказаний зв'язуючий протеїн містить тільки один полімерний фрагмент. Крім того, переважно, вказаний зв'язуючий протеїн має середню молекулярну масу, щонайменш, 70, 100, 200, 300, 500 або 800 кДа, коли аналізували при концентрації 0,1 мМ в PBS при кімнатній температурі за допомогою SEC, використовуючи глобулярні протеїни, як стандарти молекулярної маси. Термін "зв'язуючий домен" означає протеїновий домен, який демонструє один і той самий "згин" (трьохвимірне розташування), як і в протеїновому скаффолді та має попередньо визначену властивість, як визначено нижче. Такий зв'язуючий домен може бути одержаний шляхом раціональних, або частіше за все, комбінаторних методів протеїнової інженерії, які є відомими кваліфікованому спеціалісту в даній галузі з рівня техніки (Skerra, 2000, в цитованому місці; Binz et al., 2005, в цитованому місці). Наприклад, зв'язуючий домен, що має попередньо визначену властивість може бути одержана способом, який включає наступні стадії: (а) одержання різноманітної колекції протеїнових доменів, що демонструють один й той самий згин, як і протеїновий скаффолд, як далі визначено нижче, та (б) скринінг вказаної різноманітної колекції та/або відбір з вказаної різноманітної колекції, щоб одержати, щонайменш, один протеїновий домен, який має вказану попередньо визначену властивість. Різноманітна колекція протеїнових доменів може бути забезпечена декількома методами у відповідності зі скринінгом та/або системою відбору, яку використовували,та може включати застосування методів, добре відомих кваліфікованому спеціалісту в даній галузі з рівня техніки, таких як відображення фагів або рибосомний дисплей. Термін "протеїновий скаффолд" означає протеїн з відкритими ділянками поверхні, для яких амінокислотні включення, заміщення або видалення є достатньо прийнятними. Прикладами протеїнових скаффолдів, які можуть бути використані для створення зв'язуючих доменів за представленим винаходом, є антитіла або їх фрагменти, такі як одноланцюгові Fv або Fab фрагменти, протеїн А з Staphylococcus aureus, біліновий зв'язуючий протеїн з Pieris brassicae або інші ліпокаліни, анкіринові протеїни, що повторюються, або інші протеїни, що повторюються, та фібронектин людини. Протеїнові скаффолди є відомими кваліфікованим спеціалістам в даній галузі з рівня техніки (Binz et al., 2005, в цитованому місці; Binz et al., 2004, в цитованому місці). Термін "попередньо визначена властивість" стосується властивості, такої як зв'язування з мішенню, блокування мішені, активація мішені опосередкованої реакції, ферментативна активність, та пов'язані з ними додаткові властивості. В залежності від типу необхідної властивості, кваліфікований спеціаліст зможе визначити формат та необхідні стадії для 5 UA 111820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 проведення скринінгу та/або відбору зв'язуючого домену з необхідною властивістю. Переважно, попередньо визначеною властивістю є зв'язування з мішенню. Переважно, зв'язуючий протеїн за даним винаходом не є антитілом або його фрагментом, таким як Fab або ScFv фрагментами. Антитіла та їх фрагменти добре відомі кваліфікованому спеціалісту в даній галузі з рівня техніки. Крім того, переважно, зв'язуючий домен за даним винаходом не містить імуноглобулінову складку, як таку, що є присутньою в антитілах та/або фібронектиновому домені типу III. Імуноглобулінова складка є загальною для всієї-β протеїнової складки, яка складається з 2-х шарового сендвичу близько 7 анти-паралельних β-ниток, розташованих в двох β-листках. Імуноглобулінові складки добре відомі кваліфікованому спеціалісту в даній галузі з рівня техніки. Наприклад, такі зв'язуючі домени, які містять імуноглобулінову складку, описані в WO 07/080392 та WO 08/097497. Крім того, переважно, зв'язуючий домен за даним винаходом не містить імуноглобулінподібний домен, який знайдено в VEGFR-1 або VEGFR-2. Такі зв'язуючі домени описані в WO 00/075319. Переважним зв'язуючим доменом є зв'язуючий домен, що демонструє анти-ангіогенну дію. Анти-ангіогенна дія зв'язуючого домену може бути визначеною шляхом аналізу, який є добре відомим кваліфікованому спеціалісту в даній галузі з рівня техніки, такого як аналіз проростання HUVEC сфероїдів, який є описаним в прикладі 2. Крім того, переважним є зв'язуючий домен, що містить від 70 до 300 амінокислот, а саме, від 100 до 200 амінокислот. Крім того, переважним є зв'язуючий домен, що не містить вільний Cys залишок. Вільний Cys залишок не приймає участі в утворенні дисульфідних зв'язків. Ще більш переважним є зв'язуючий домен, який не містить будь-який Cys залишок. Переважним зв'язуючим доменом за даним винаходом є домен, що повторюється, або сконструйований домен, що повторюється, переважно, як описано в WO 02/20565. Особливо переважним зв'язуючим доменом є сконструйований анкіриновий домен, що повторюється (Binz, H. K. et al., 2004, в цитованому місці), переважно, як описано в WO 02/20565. Приклади сконструйованих анкіринових доменів, що повторюються, наведені в прикладах. В подальшому визначення для протеїнів, що повторюються, ґрунтуються на тих, що наведені в заявці на патент WO 02/20565. Крім того, заявка на патент WO 02/20565 містить загальний опис особливостей протеїну, що повторюється, способів та застосувань. Термін "протеїни, що повторюються" стосується протеїну, що містить один або більше доменів, що повторюються. Переважно, кожен з вказаних протеїнів, що повторюються, містить до чотирьох доменів, що повторюються. Більш переважно, кожен з вказаних протеїнів, що повторюються, містить до двох доменів, що повторюються. Найбільш переважно, кожен з протеїнів, що повторюються, містить тільки один домен, що повторюється. Крім того, вказаний протеїн, що повторюється, може містити додаткові протеїнові домени, що не повторюються, поліпептидні мітки та/або поліпептидні лінкери. Термін "домен, що повторюється, " стосується протеїнового домену, що містить дві або більше послідовні одиниці (модуля), що повторюються, як структурні одиниці, в яких вказані структурні одиниці мають однакову складку, та складуються щільно, щоб створити, наприклад, над-спіральовидні структури, що маютьспільний гідрофобний центр. Термін "сконструйований протеїн, що повторюється, " та "сконструйований домен, що повторюється, " стосується протеїну, що повторюється, або домену, що повторюються, відповідно, які одержані як результат за методиками винаходу, що описані в заявці на патент WO 02/20565. Сконструйовані протеїни, що повторюються, и сконструйовані домени, що повторюються, є синтетичними, а не одержаними природним шляхом. Вони є створеними людиною протеїнами або доменами, відповідно, одержаними шляхом експресії, відповідних сконструйованих нуклеїнових кислот. Переважно, експресію здійснюють в еукаріотних або прокаріотних клітинах, таких як бактеріальні клітини, або шляхом застосування безклітинної in vitro експресійної системи. Термін "структурна одиниця" стосується локально впорядкованої частини поліпептиду, утвореної трьохвимірними взаємодіями між двома або більше сегментами вторинної структури, які знаходяться поблизу одно від одної вздовж поліпептидного ланцюга. Така структурна одиниця демонструє структурний мотив. Термін "структурний мотив" стосується трьохвимірного розташування елементів вторинної структури, яка присутня, щонайменше, в одній структурній одиниці. Структурні мотиви є добре відомими кваліфікованим спеціалістам в даній галузі з рівня техніки. Структурні одиниці самі по собі не є здатними набувати певне трьохвимірне 6 UA 111820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розташування, однак, їх послідовне розташування, наприклад, як модулі, що повторюються, в доменах, що повторюються, призводить до взаємної стабілізації сусідніх одиниць, що в результаті призводить до над-спіральовидної структури. Термін "одиниця, що повторюється, " стосується амінокислотних послідовностей, які містять мотиви, що повторюються, послідовності одного або більше протеїнів, які зустрічаються в природі, в яких вказані "одиниці, що повторюються, " зустрічаються в декількох екземплярах, та які демонструють певну топологію складування загальну для всіх вказаних мотивів, що визначають складку протеїну. Прикладами таких одиниць, що повторюються, є одиниці, що повторюються, панцерника, збагачені лейцином одиниці, що повторюються, анкіринові одиниці, що повторюються, тетра-три-спів-пептидні одиниці, що повторюються, HEAT одиниці, що повторюються, та збагачені лейцином варіантні одиниці, що повторюються. Протеїни, що зустрічаються в природі, які містять дві або більше такі одиниці, що повторюються, називають "протеїном, що повторюється, який зустрічається в природі". Амінокислотні послідовності окремих одиниць, що повторюються, протеїну, що повторюється, можуть мати значну кількість мутацій, заміщень, додавань та/або видалень, коли порівнюються одна з одною, в той самий час суттєво зберігаючи загальну картину, або мотив, з одиниць, що повторюються. Переважно, одиниці, що повторюються, які використовують для віднімання мотивів, що повторюються, послідовності, є гомологічними одиницями, що повторюються, одержаними з доменів, що повторюються, які вибирають на мішені, наприклад, як описано в прикладі 1, та мають таку саму специфічність до мішені. Термін "мотив, що повторюється, послідовності" стосується амінокислотної послідовності, яку виводять з одної або більше одиниць, що повторюються. Переважно, вказані одиниці, що повторюються, є від доменів, що повторюються, які мають специфічність зв'язування для такої ж самої мішені. Термін "топологія складування" стосується третинної структури вказаних одиниць, що повторюються. Топологія складування буде визначатися ділянками амінокислот, що утворюють, щонайменше, частини α-спіралі або β-листків, або амінокислотними ділянками, що утворюють лінійні поліпептиди або петлі, або будь-яку комбінацію α-спіралей, β-листків та/або лінійних поліпептидів/петель. Термін "послідовний" стосується розташування, за яким одиниці, що повторюються, або модулі, що повторюються, розташовуються в тандемі. В сконструйованих протеїнах, що повторюються, існує, щонайменше, 2, як правило, від близько 2 до 6, зокрема, щонайменше, близько 6, частіше 20 або більше одиниць, що повторюються. В більшості випадків, одиниці, що повторюються, будуть демонструвати високий ступень ідентичності послідовностей (ті ж самі амінокислотні залишки у відповідних положеннях) або подібність послідовностей (амінокислотні залишки, будучи різними, але мають подібні фізико-хімічні властивості), та деякі з амінокислотних залишків можуть бути ключовими залишками, які чітко зберігаються в різних одиницях, що повторюються, знайдених в протеїнах, що зустрічаються в природі. Однак, високий ступінь мінливості послідовності шляхом амінокислотних включень та/або видалень, та/або заміщень між різними одиницями, що повторюються, знайденими в протеїнах, які зустрічаються в природі, буде можливим до тих пір, доки зберігається загальна топологія складування. Методи прямого визначення топології складування протеїнів, що повторюються, за допомогою фізико-хімічних методів, таких як рентгенівська кристалографія, ЯМР-спектроскопія або КД-спектроскопія (кругового дихроїзму), добре відомі практикуючому кваліфікованому спеціалісту в даній галузі з рівня техніки. Методи ідентифікації та визначення одиниць, що повторюються, або мотивів, що повторюються, послідовності, або для ідентифікації родин споріднених протеїнів, що містять такі одиниці, що повторюються, або мотиви, що повторюються, такі як пошук гомології (BLAST, тощо), є добре встановленими в галузі біоінформатики, а також є добре відомими практикуючому спеціалісту в даній галузі з рівня техніки. Стадія вдосконалення вихідного мотиву, що повторюється, послідовності може включати процес, що повторюється. Термін "модулі, що повторюються, " стосується амінокислотних послідовностей, що повторюються, сконструйованих доменів, що повторюються, які спочатку є похідними від одиниць, що повторюються, протеїнів, що повторюються, які зустрічаються в природі. Кожен модуль, що повторюється, який входить до складу домену, що повторюється, є похідним від однієї або більше одиниць, що повторюються, родини або підродини протеїнів, що повторюються, які зустрічаються в природі, наприклад, родини протеїнів, що повторюються, броненосців або анкіринових протеїнів, що повторюються, . "Модулі, що повторюються, " можуть включати положення з амінокислотними залишками, які є присутніми у всіх копіях відповідних модулів, що повторюються, ("фіксовані положення"), та 7 UA 111820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 положення з різними або "рандомізованими" амінокислотними залишками ("рандомізовані положення"). Термін "закупорюючий модуль" стосується поліпептиду, який є злитим з N- або Стермінальним модулем, що повторюється, домену, що повторюється, в якому вказаний закупорюючий модуль утворює стійкі третинні взаємодії з вказаним модулем, що повторюється, забезпечуючи тим самим кеп, який захищає гідрофобний центр вказаного модуля, що повторюється, з того боку, який не контактує з послідовним модулем, що повторюється, від розчинника. Вказаний N- та/або C-термінальний закупорюючий модуль може бути або може бути похідним від закупорюючої одиниці або іншого домену, знайденого в протеїні, що повторюється, який зустрічається в природі, розташований рядом з одиницею, що повторюється. Термін "закупорююча одиниця" стосується складчастого поліпептиду, який зустрічається в природі, в якому вказаний поліпептид визначає специфічну структурну одиницю, яка є N- або С-термінально злитою з одиницею, що повторюється, в якій вказаний поліпептид утворює стійкі третинні взаємодії з вказаною одиницею, що повторюються, забезпечуючи тим самим кеп, яких захищає гідрофобний центр вказаної одиниці, що повторюється, з одного боку, від розчинника. Такі закупорюючі одиниці можуть мати подібності послідовності з вказаним мотивом, що повторюється, послідовності. Закупорюючі модулі та закупорюючі одиниці, що повторюються, описані в WO 02/020565. Наприклад, N-термінальний закупорюючий модуль SEQ ID NO: 2 кодується за допомогою амінокислот від положення 1 до 32. Крім того, переважним є такий N-термінальний закупорюючий модуль, що має гліциновий або аспартатний залишок в положенні 5. Термін "мішень" стосується індивідуальної молекули, такої як молекула нуклеїнової кислоти, поліпептид або протеїн, вуглевод, або будь-яка інша молекула, що зустрічається в природі, в тому числі будь-яка частина такої індивідуальної молекули або комплекси з двох або більше таких молекул. Мішенню може бути ціла клітина або зразок тканини, або вона може бути будьякою молекулою або фрагментом, що не зустрічається в природі. Переважно, мішенню є поліпептид, який зустрічається або не зустрічається в природі, або поліпептид, що містить хімічні модифікації, наприклад, модифіковані шляхом природного або неприродного фосфорилювання, ацетилювання або метилювання. В конкретному застосуванні представленого винаходу, мішенню є VEGF-Axxx або VEGFR-2. Термін "узгоджена послідовність" стосується амінокислотної послідовності, в якій вказану узгоджену послідовність одержують шляхом структурного та/або послідовного узгодження декількох одиниць, що повторюються. Використання двох або більше структурних та/або послідовно узгоджених одиниць, що повторюються, та прийняття до уваги гепів при вирівнюванні, робить можливим визначити найбільш частий амінокислотний залишок в кожному положенні. Узгоджена послідовність є такою послідовністю, яка містить амінокислоти, які частіше за все представлені в кожному положенні. У випадку, коли дві або більше амінокислоти представлені частіше в одному положенні за середні показники, то узгоджена послідовність може включати підгрупу таких амінокислот. Вказані дві або більше одиниці, що повторюються, можуть бути взяті з одиниць, що повторюються, які є включеними в один протеїн, що повторюється, або з двох або більше різних протеїнів, що повторюються. Узгоджені послідовності та способи для їх визначення, є добре відомими кваліфікованим спеціалістам в даній галузі з рівня техніки. "Узгоджений амінокислотний залишок" є амінокислотою, виявленою в певному положенні в узгодженій послідовності. Якщо два або більше, наприклад, три, чотири або п'ять, амінокислотних залишки виявляють з аналогічною вірогідністю в вказаних двох або більше одиницях, що повторюються, то узгоджена амінокислота може бути однією з амінокислот, що найбільш часто виявляються, або комбінацією вказаних двох або більше амінокислотних залишків. Далі, переважними є зв'язуючі протеїни, які не зустрічаються в природі, або зв'язуючі домени. Термін "що не зустрічаються в природі" означає синтетичні або не з природи, більш конкретно, термін означає, створені руками людини. Термін "зв'язуючий протеїн, що не зустрічається в природі, " або "зв'язуючий домен, що не зустрічається в природі, " означає, що вказаний зв'язуючий протеїн або вказаний зв'язуючий домен є синтетичним (тобто, одержаним шляхом хімічного синтезу з амінокислот) або рекомбінантним, а не з природи. "Зв'язуючий протеїн, що не зустрічається в природі, " або "зв'язуючий домен, що не зустрічається в природі, " є створеним людиною протеїном або доменом, відповідно, одержаним шляхом експресії відповідно сконструйованих нуклеїнових кислот. Переважно, експресію здійснюють в еукаріотних або бактеріальних клітинах, або шляхом використання безклітинної in vitro 8 UA 111820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 експресійної системи. Крім того, термін означає, що послідовність вказаного зв'язуючого протеїну або вказаного зв'язуючого домену, який не є присутнім при введенні нештучної послідовності в базі даних послідовностей, наприклад, в GenBank, EMBL-банку або Swiss-Prot. Ці бази даних та інші аналогічні бази даних послідовностей є добре відомими кваліфікованим спеціалістам в даній галузі з рівня техніки. Зв'язуючий домен може інгібувати зв'язування VEGF-Axxx з VEGFR-2 або шляхом зв'язування з VEGF-Axxx або шляхом зв'язування з VEGFR-2 до такого ступеню, що удавана 2 константа дисоціації (Kd) між VEGF-Axxx та VEGFR-2, збільшується більше ніж в 10 разів, 3 4 переважно більше ніж в 10 разів, більш переважно, більш ніж в 10 раз, більше переважно, 5 6 більш ніж 10 -раз, и найбільш переважно, більше ніж 10 разів. Переважно, Kd для взаємодії -7 зв'язуючого домену з або VEGF-Axxx або VEGFR-2 складає менше 10 М, переважно, менше 10 8 -9 -10 M, більш переважно, менше 10 М, більш переважно, менше 10 М, та найбільш переважно, -11 менше 10 м. Способи, щоб визначати константи дисоціації протеїн-протеїнових взаємодій, такі як поверхнево-плазмонний резонанс (SPR) на основі технологій, є добре відомими кваліфікованому спеціалісту в даній галузі з рівня техніки. Переважний зв'язуючий домен зв'язується з VEGF-Axxx. Ще більш переважним є зв'язуючий домен, який зв'язує VEGF-A165 людини. Термін "PBS" означає фосфатний буферний водний розчин, який містить 137 мМ NaCl, 10 мМ фосфату та 2,7 мМ KCl, та має рН 7,4. Переважним є зв'язуючий протеїн та/або зв'язуючий домен, який не втрачає своєї нативної трьохвимірної структури при інкубації в PBS, який містить 100 мМ дитіотреїтолу (ДTT) протягом 1 або 10 годин при 37 °C. В одному конкретному втіленні винахід стосується зв'язуючого протеїну, який містить зв'язуючий домен, що інгібує зв'язування VEGF-Axxx з VEGFR-2 та має номінальну або переважну середню температуру денатурації та не агрегуючі властивості, як визначено вище, де вказаний зв'язуючий протеїн інгібує проростання HUVEC сфероїдів зі значеннями IC50 нижче 100 нМ. Термін "HUVEC" означає ендотеліальні клітини алантоїсної вени людини, які можуть бути виділені з нормальної алантоїсної вени людини, та які є чутливими до VEGF-A стимуляції. Аналізи щодо вимірювання проростання HUVEC сфероїдів, такі як описані в прикладі 2, є добре відомими кваліфікованому спеціалісту в даній галузі з рівня техніки. Значення IC50 являють собою концентрацію речовини, такої як зв'язуючий протеїн або зв'язуючий домен, яка є необхідною для 50 % інгібування in vitro параметру, що визначається експериментально, такого як проростання HUVEC сфероїдів. Значення IC 50 можуть бути легко визначені кваліфікованим спеціалістом в даній галузі з рівня техніки (Korff T. and Augustin H.G., J. Cell Biol. 143(5), 1341-52, 1998). Переважним є зв'язуючий протеїн та/або зв'язуючий домен, який інгібує проростання HUVEC сфероїда зі значенням IC50 менше 10 нм, переважно менше 1 нм, більш переважно, менше 0,1 нм, та найбільш переважно, менше 0,05 нм. Крім того, переважним є мономерний зв'язуючий протеїн та/або зв'язуючий домен, який інгібує проростання HUVEC сфероїдів зі значеннями IC50 нижче, ніж відповідні значення IC50 для ранибізумабу (Луцетис®, зареєстрована торгівельна марка компанії Genentech), бевацизумабу (Авастин®, зареєстрована торгівельна марка компанії Genentech), афліберцепту (VEGF Trap®, зареєстрована торгівельна марка компанії Regeneron), або пегаптанібу (Макуген®, зареєстрована торгівельна марка компанії Pfizer). Kd взаємодії переважного зв'язуючого домену з VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PIGF або PDGF складає більше 1 нМ, переважно, більше 10 нм, більше переважно, більше 102 нМ, ще більше переважно, більше 103 нМ та найбільш переважно більше 104 нМ. Переважно, VEGF-Axxx являє собою або VEGF-A164 собаки, або VEGF-A165 мавпи, або VEGF-A165 людини, та VEGF-Axxxb являє собою або VEGF-A164b собаки, або VEGF-A165b мавпи, або VEGF-A165b людини. Іншим переважним втіленням винаходу є рекомбінантний зв'язуючий протеїн, який містить зв'язуючий домен, в якому вказаний зв'язуючий домен інгібує зв'язування VEGF-Axxx з VEGFR2, та в якому вказаний зв'язуючий домен є доменом, що повторюється, або сконструйованим доменом, що повторюється. Такий домен, що повторюється, може містити один, два, три або більше внутрішніх модуля, що повторюються, які будуть приймати участь в зв'язуванні з VEGFAxxx. Переважно, такий домен, що повторюється, містить N-термінальний закупорюючий модуль, від двох до чотирьох внутрішніх модулів, що повторюються, та С-термінальний закупорюючий модуль. Переважно, вказаним зв'язуючим доменом є анкіриновий домен, що повторюється, або сконструйований анкіриновий домен, що повторюється. 9 UA 111820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Переважний рекомбінантний зв'язуючий протеїн містить зв'язуючий домен, як описано в даному документі, кон'югований з поліетиленглікольним (ПЕГ) фрагментом, переважно, в якому вказаний ПЕГ фрагмент є з'єднаним з одним Cys залишком вказаного зв'язуючого домену. Переважно, вказаний Cys залишок є генетично введеним в C-термінальний кінець вказаного зв'язуючого домену. Далі, ПЕГ фрагмент може бути з'єднаним хімічним способом, наприклад, шляхом використання малеімідної хімії, добре відомої кваліфікованому спеціалісту в даній галузі з рівня техніки. Приклади таких зв'язуючих протеїнів, що містять ПЕГ фрагмент, кон'югований з одним Cys залишком, наведені в прикладах. Переважне втілення винаходу містить рекомбінантний зв'язуючий протеїн, який містить зв'язуючий домен, як описано в даному документі, в якому вказаний зв'язуючий домен є кон'югованим на своєму С-кінці за рахунок пептидних зв'язків з SEQ ID NO: 8, який, в свою чергу, є кон'югованим на С-термінальному тіолі цистеїну з малеімід-зв'язаним ПЕГ, таким як α[3-(3-малеімідо-1-оксопропіл)аміно]пропіл-ω-метоксиполіоксіетилен (NOF, Sunbright ME-200MA (20 кДа) або Sunbright ME-400MA (40 кДа)). В одному з втілень α-[3-(3-малеімідо-1оксопропіл)аміно]пропіл-ω-метоксиполіоксіетилен має молекулярну масу, щонайменше, близько 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 70 або 100 кДа. В деяких втіленнях α-[3-(3-малеімідо-1оксопропіл)аміно]пропіл-ω-метоксиполіоксіетилен має молекулярну масу, щонайменше, близько 20 або, щонайменше, близько 40 кДа. Іншим переважним втіленням є рекомбінантний зв'язуючий протеїн, як визначено вище, що містить, щонайменше, один домен, що повторюється, зі специфічністю зв'язування VEGF-Axxx, в якому вказаний домен, що повторюється, конкурує за зв'язування з VEGF-Axxx з доменом, що повторюється, який є вибраним з групи доменів, що повторюються, SEQ ID NO: від 1 до 7. Переважно, домен, що повторюється, конкурує за зв'язування з VEGF-Axxx з доменом, що повторюється, SEQ ID NO: 1 або 3. Більше переважно, вказаний домен, що повторюється, конкурує за зв'язування з VEGF-Axxx з доменом, що повторюється, SEQ ID NO: 3. Термін "конкурує за зв'язування" означає нездатність двох різних зв'язуючих доменів за винаходом зв'язуватися одночасно з однією й тією ж самою мішенню, в той час як обидва здатні зв'язуватися з однією й тією ж самою мішенню по окремості. Таким чином, два таких зв'язуючих домени конкурують за зв'язування з вказаною мішенню. Способи, такі як конкурентні ІФА або конкурентні SPR вимірювання (наприклад, шляхом використання приладу Proteon від BioRad), щоб визначити, як два зв'язуючих домени конкурують за зв'язування з мішенню, є добре відомими практикуючому спеціалісту в даній галузі з рівня техніки. Рекомбінантний зв'язуючий протеїн, який конкурує за зв'язування з VEGF-Axxx з вибраним протеїном, що повторюється, може бути визначений методами, добре відомими кваліфікованому спеціалісту в даній галузі з рівня техніки, такими як конкурентний імуноферментний аналіз (ІФА). Іншим переважним варіантом втілення винаходу є рекомбінантний зв'язуючий протеїн, який містить домен, що повторюється, зі специфічністю зв'язування з VEGF-Axxx, вибраний з групи, що складається з доменів, що повторюються, SEQ ID NO: від 1 до 7. Переважно, вказані домени, що повторюються, є вибраними з доменів, що повторюються, SEQ ID NO: 2 або 3. Більш переважно, вказаний домен, що повторюється, є доменом, що повторюється, SEQ ID NO: 3. Один або більше поліетиленгліколевих фрагментів можуть бути прикріплені в різних положеннях в зв'язуючому протеїні, та таке приєднання може бути досягнуто шляхом реакції з амінами, тіолами або іншими прийнятними реакційноздатними групами. Приєднання поліетиленгліколевих фрагментів (ПЕГилювання) може бути сайт-направленим, за яким прийнятну реакційноздатну групу вводять в протеїн, щоб створити сайт, в якому переважно відбувається ПЕГилювання, або ця група спочатку вже є присутньою в зв'язуючому протеїні. Тіольна група може бути присутньою в залишку цистеїну; та аміногрупа може бути, наприклад, первинним аміном, виявленим на N-кінці поліпептиду або аміногрупою, що є присутньою в бічному ланцюзі амінокислоти, такої як лізин або аргінін. В переважному варіанті втілення зв'язуючий протеїн модифікується таким чином, щоб мати залишок цистеїну в потрібному положенні, що дозволяє сайт-направлене ПЕГилювання на цистеїні, наприклад, шляхом взаємодії з похідною поліетиленгліколя, яка несе малеімідну функцію. Фрагмент поліетиленгліколя може варіювати в широких межах молекулярної маси (тобто від приблизно 1 кДа до приблизно 100 кДа) та може бути розгалуженим або лінійним. Переважно, поліетиленгліколь має молекулярну масу від близько 1 до близько 50 кДа, переважно від близько 10 до близько 40 кДа, ще більш переважно від близько 15 до близько 30 кДа, та найбільш переважно близько 20 кДа. 10 UA 111820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В іншому варіанті втілення винахід стосується молекул нуклеїнових кислот, що кодують конкретні рекомбінантні зв'язуючі протеїни. Крім того, передбачається вектор, що містить вказану молекулу нуклеїнової кислоти. Крім того, передбачається фармацевтична композиція, що містить один або більше з вказаних вище зв'язуючих протеїнів, зокрема, рекомбінантні зв'язуючі протеїни, які містять домени, що повторюються, або молекули нуклеїнової кислоти, які кодують, зокрема, рекомбінантні зв'язуючі протеїни, та, необов'язково, фармацевтично прийнятний носій та/або розріджувач. Фармацевтично прийнятні носії та/або розріджувачі є відомими кваліфікованому спеціалісту в даній галузі техніки з рівня техніки та описаними більш детально нижче. Ще, крім того, передбачається діагностична композиція, що містить один або більше з вказаних вище рекомбінантних зв'язуючих протеїнів, зокрема, зв'язуючих протеїнів, які містять домени, що повторюються. Зв'язуючий протеїн за винаходом пригнічує або попереджує VEGF індукований патологічний ангіогенез, пропотівання рідини крізь судини (набряк), легеневу гіпертензію, утворення пухлин та/або запальні захворювання. Під "пригніченням" слід розуміти, що рекомбінантний протеїн перешкоджає в деякій мірі розвитку вказаної патології, наприклад, до 10 % або 20 %, більш переважно 50 %, зокрема, 70 %, 80 % або 90 %, або навіть 95 %. Термін "набряк" означає стан, який є викликаним пропотіванням рідини крізь судини. Розширення судин та підвищення проникності при запаленні може бути переважаючим патогенетичним механізмом. Наприклад, набряк сприяє розвитку інфаркту після інсульту та може призвести до небезпечної для життя внутрішньочерепної гіпертензії у хворих на рак. Крім того, екстравазація протеїнів плазми сприяє метастатичним розповсюдженням прихованих пухлин, та закупорювання дихальних шляхів може призвести до смертельного результату при астматичних нападах. Підвищене пропотівання рідини крізь судини, яке виникає при запаленні, може призвести до дихальної недостатності, асциту, перітонеальному склерозу (у діалізних пацієнтів), утворенню спайок (абдомінальна хірургія) та розповсюдженню метастаз. Термін "ангіогенез" означає фундаментальний процес, при якому утворюються нові кровоносні судини. Первинний ангіогенний період у людини відбувається протягом перших трьох місяців ембріонального розвитку, але, крім того, ангіогенез відбувається як нормальний фізіологічний процес в періоди росту тканин, таких як збільшення м'язів або жиру, та під час менструального циклу та вагітності. Термін "патологічний ангіогенез" стосується утворення та росту кровоносних судин під час перебігу та прогресування деяких хворобливих станів. Конкретні приклади патологічного ангіогенезу виявлені в кровоносних судинах (атеросклероз, гемангіома, гемангіоендотеліома), кістках та суглобах (ревматоїдний артрит, синовіт, руйнування кістки та хряща, остеомієліт, ріст паннуса, утворення остеофітів, новоутворення та метастази), на шкірі (бородавки, гнійні гранульоми, ріст волосся, саркома Капоши, келоїдні рубці шраму, алергічні набряки, новоутворення), в печінці, нирці, легенях, вусі та інших епітеліальних тканинах (запальні та інфекційні процеси, включаючи гепатит, гломерулонефрит, пневмонію; та астма, поліпи носа, отіти, розлади, пов'язані з трансплантацією, розлади, пов'язані з регенерацією печінки, новоутворення та метастази), матці, яєчниках та плаценті (дисфункціональні маточні кровотечі, пов'язані із застосуванням внутрішньоматочних протизаплідних засобів, формування фоллікулярної кісти, синдром гіперстимуляції яєчників, ендометріоз, новоутворення), мозку, нервах та оці (ретинопатія недоношених, діабетична ретинопатія, хороїдальні та інші внутришньоочні розлади, лейкомаляція, новоутворення та метастази), серцевій та скелетних м'язах в зв'язку з роботою в стані перенавантаження, жировій тканині (ожирінні), ендокринних органах (тиреоїдит, збільшення щитоподібної залози, розлади при трансплантації підшлункової залози), при кровотворенні (синдром Капоши при СНІДі), в гематологічних злоякісних новоутвореннях (лейкози) та лімфатичних судинах (метастази пухлин, лімфопроліферативні захворювання). Термін "ішемічні захворювання сітківки" означає, що постачання сітківки кров'ю та киснем зменшується, периферична частина сітківки втрачає джерело живлення та перестає функціонувати належним чином. Конкретним прикладом ішемічного захворювання сітківки є ретинопатія. Загальними захворюваннями, які призводять до ретинопатії, є діабетична ретинопатія, оклюзія центральної вени сітківки, стеноз сонної артерії та серповидно-клітинна ретинопатія. Діабетична ретинопатія є основною причиною втрати зору у хворих на цукровий діабет. При ішемічних захворюваннях сітківки відбувається ріст нових кровоносних судин (неоваскуляризація). Ці судини часто ростуть на поверхні сітківки, на зоровому нерві або на передній частині ока - на райдужній оболонці. Нові судини не можуть замінити потік необхідних поживних речовин та, навпаки, можуть стати причиною багатьох проблем, таких як крововилив 11 UA 111820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 у склоподібне тіло, відшарування сітківки та неконтрольована глаукома. Ці проблеми виникають через нові судини, які є крихкими та схильними до кровотечі. Якщо її виявили на ранній стадії, то проліферативна діабетична ретинопатія іноді може призупинятися при застосуванні панретинальної фотокоагуляції. Тим не менше, в деяких випадках, хірургічне видалення склоподібного тіла або його частини є єдиним варіантом. Крім цих ретинопатій, судинні захворювання очей також включають очні неоваскуляризаційні захворювання, такі як дегенерація жовтої плями та діабетичний макулярний набряк (DME). Дегенерація жовтої плями в результаті призводить до неоваскулярного росту хоріоїдних судин під жовтою плямою. Існує два типи дегенерації жовтої плями: суха та волога. В той час як волога дегенерація жовтої плями включає тільки 15 % від усіх дегенерацій жовтої плями, майже вся волога дегенерація жовтої плями призводить до сліпоти. Крім того, волога дегенерація жовтої плями майже завжди є результатом сухої дегенерації жовтої плями. Як тільки одне око є ураженим вологою дегенерацією жовтої плями, стан майже завжди впливає на інше око. Волога дегенерація жовтої плями часто називають віковою вологою дегенерацією жовтої плями від вологої AMD, так як це в основному зустрічається у літніх людей. Діабетична ретинопатія (DR) та DME є провідними причинами сліпоти у населення працездатного віку більшості розвинених країн. Зростаюча кількість людей з діабетом у всьому світі припускає, що DR та DME будуть, як і раніше, залишатися основними причинами втрати зору та пов'язаними з діабетом функціональними порушеннями протягом довгих років. Деякі біохімічні механізми, в тому числі активація протеїнкінази C-β, підвищене продукування судинних ендотеліальних факторів росту, окислювальний стрес та накопичення внутрішньоклітинного сорбіту та підвищених кінцевих продуктів глікозилювання, може сприяти виникненню судинних порушень, які характеризують DR/DME. Інгібування даних шляхів стримує обов'язковість розвитку для DR і DME. Термін "легенева гіпертензія" означає захворювання, при якому артеріальний тиск у легеневій артерії є аномально високим. У відсутності інших захворювань серця або легенів вона називається первинною легеневою гіпертензією. Дифузійне звуження легеневих артеріол відбувається в результаті патологічного артеріогенеза з подальшою легеневою гіпертензією у відповідь на підвищену стійкість до кровотоку. Захворюваність становить 8 з 100'000 чоловік. Однак, легенева гіпертензія може, крім того, виникати як ускладнення хронічних обструктивних захворювань легень (ХОЗЛ), таких як емфізема легенів, хронічний бронхіт або дифузний інтерстиціальний фіброз та у пацієнтів з астматичної формою ХОЗЛ. Захворюваність ХОЗЛ складає приблизно 5 на 10'000 людей. Крім того, зв'язуючі протеїни за винаходом можуть бути застосовані для лікування запалення та, зокрема запальних захворювань. Термін "запалення", як використовується в даному документі, означає місцеву реакцію на пошкодження живих тканин, особливо, місцеві реакції дрібних кровоносних судин, їх вміст, та пов'язаних з ними структур. Проходження компонентів крові через стінки судини в тканини є ознакою запалення, і, таким чином, сформоване накопичення рідини в тканинах називається ексудатом або набряком. Будь-який шкідливий процес, який пошкоджує живі тканини, наприклад, інфекція з бактеріями, надмірна спека, холод, механічні пошкодження, такі як роздрібнення, дія кислот, лугів, опромінення або зараження вірусами, може викликати запалення незалежно від того який орган або тканина при цьому бере участь. Повинно бути зрозуміло, що захворювання, що класифікуються як "запальні захворювання" та тканинні реакції, що є вибраними з діапазону від опіків до пневмонії, лепри, туберкульозу та ревматоїдного артриту, всі є "запаленнями". Зв'язуючі протеїні згідно винаходу можуть бути використані для лікування утворення пухлин. Термін "пухлина" означає масу аномальної тканини, яка виникає без видимої причини з вже існуючих клітин тіла, не має цілеспрямованої функції, та характеризується тенденцією до автономного та нестримного росту. Пухлини абсолютно відрізняються від запальних або інших припухлостей, тому що клітини в пухлині є анормальними за своїми зовнішніми ознаками та іншим характеристикам. Аномальні клітини, тобто вид клітин, які зазвичай складають пухлини, відрізняються від нормальних клітин тим, що пройшли одне або декілька з наступних змін: (1) гіпертрофія, або збільшення розмірів окремих клітин, (2) гіперплазія або збільшення числа клітин в даній зоні; (3) анаплазія або регрес фізичних характеристик клітини до більш примітивного або недиференційованого типу. Пухлини можуть бути доброякісними, наприклад, ліпоми, ангіоми, остеоми, хондроми та аденоми. Прикладами злоякісних пухлин є карциноми (наприклад, пухлини молочної залози, карциноми в дихальних шляхах та шлунково-кишковому тракті, ендокринних залоз та сечостатевої системи), саркоми (в сполучній тканині, в тому числі 12 UA 111820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фіброзних тканинах, жирових (жир) тканинах, м'язах, кровоносних судинах, кістках та хрящах), карциносаркомою (як в епітеліальній так і в сполучній тканині), лейкози та лімфоми, пухлини в нервових тканинах (у тому числі головному мозку), та меланоми (рак пігментних клітин шкіри). Використання зв'язуючих протеїнів згідно представленого винаходу проти пухлин також може відбуватися в поєднанні з будь-якою іншою протипухлинною терапією, яка є відомою в даній галузі з рівня техніки, такою як опромінення, фотодинамічна терапія, хіміотерапія або хірургічне втручання. Фармацевтична композиція містіть зв'язуючі протеїні, які описані вище, та фармацевтично прийнятний носій, наповнювач або стабілізатор (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]). Прийнятними носіями, наповнювачами або стабілізаторами, відомими кваліфікованому спеціалісту, є фізіологічний розчин, розчин Рінгера, розчин декстрози, розчин Хенка, жирні олії, етилолеат, 5 % розчин декстрози у фізіологічному розчині, речовини, які збільшують ізотонічність та хімічну стабільність, буфери та консерванти. Інші прийнятні носії включають будь-який носій, який сам по собі не викликає продукування антитіл, шкідливих для індивідуума, який отримує композицію, такі як протеїні, полісахариди, полімолочні кислоти, полігліколеві кислоти, полімерні амінокислоти, спів-полімери амінокислот. Фармацевтична композиція, крім того, може являти собою комбінований препарат, що включає додатковий активний агент, такий як протираковий агент або анти-ангіогенний агент (наприклад, VEGF-Axxxb людини, переважно, VEGF-A165b людини). Переважна фармацевтична композиція для лікування захворювань очей включає зв'язуючі протеїні, які описані вище, та детергенти, такі як неіоногенні детергенти, в тому числі, але не обмежуючись цим, полісорбат 20 (наприклад, близько 0,04 %), буфер, такий як кислотний гістидиновий, фосфатний або молочний, та цукри, такі як сахароза або трегалоза. Переважно, така композиція містіть зв'язуючі протеїні, які описані вище, та PBS. Вказані або будь-які інші фармацевтичні композиції, описані в даному документі, можуть вводити локально, або місцево на частини ока, або вводиться в око у вигляді ін'єкції, наприклад, субкон'юктивально, в периабо ретробульбарний простір або прямо в око. Альтернативно, вказані або такі інші фармацевтичні композиції можуть вводити системно шляхом парентерального введення. Переважно, зазначена або така інша фармацевтична композиція застосовується до ока шляхом ін'єкцій у скловидне тіло. Крім того, переважно, зазначена фармацевтична композиція наноситься на око місцево також і у вигляді очних крапель. Очні краплі можуть бути застосовані до рогівки (прозора частина в центрі ока), тим самим, дозволяючи молекулам проникати в око. Для лікування захворювання, що впливає на задню частину ока, найбільш бажаним може бути те, щоб зв'язуючий протеїн проникав в склеру, коли ін'єкцію вводять під кон'юнктиву або по всій сфері. Введення зв'язуючу протеїну може бути виконане після попередньої стадії модуляції поверхні ока, щоб покращити проникнення молекул. Переважно, епітеліальний шар, такий як епітелій рогівки, модулюється шляхом підвищення проникнення для того, щоб забезпечити достатнє та швидке проникнення молекул, наприклад, як описано вище. Застосування зв'язуючих протеїнів за представленим винаходом проти захворювань очей, крім того, може бути в комбінації з будь-якою іншою терапією, відомою в даній галузі, такою як фотодинамічна терапія. Препарати, які будуть застосовуватися для введення in vivo, повинні бути асептичними або стерильними. Це легко досягається шляхом фільтрації через стерильні фільтруючі мембрани. Препарати з уповільненим вивільненням також можуть бути одержані. В одному з варіантів здійснення винаходу, внутрішньоочний імплантат може бути використаний для доставки зв'язуючого протеїну за винаходом. Прийнятні приклади препаратів з уповільненим вивільненням включають напівпроникні матриці з твердих гідрофобних полімерів, що містять поліпептид за даним винаходом, де матриці знаходяться у вигляді формованих виробів, наприклад, плівок або мікрокапсул. Приклади матриць з уповільненим вивільненням включають поліефіри, гідрогелі (наприклад, полі (2-гідроксіетилметакрилату) або полі(вініловий спирт)), полілактиди, спів-полімери L-глутамінової кислоти та гамма-етил-L-глутамату, етиленвінілацетати, що не розкладаються, спів-полімери молочної кислоти та гліколевої кислоти, що розкладаються, такі як LUPRON DEPOT® (мікросфери для ін'єкцій, що складаються з спів-полімера молочної кислоти та гліколевої кислоти й лейпролідацетату), та полі-D-(-)-3гідроксимасляна кислота. Фармацевтична композиція може бути введена за допомогою будь-якого прийнятного способу, відомого кваліфікованому спеціалісту. Переважним шляхом введення є парентеральний. При парентеральному введенні, лікарський засіб за даним винаходом буде сформульованим в одиничну дозовану ін'єкційну форму, таку як розчин, суспензія або емульсія, в поєднанні з фармацевтично прийнятними наповнювачами, як зазначено вище. Дозування та 13 UA 111820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 спосіб введення буде залежати від конкретного індивідуума, який піддається лікуванню, та конкретного захворювання. Як правило, фармацевтичну композицію вводять так, щоб зв'язуючий протеїн за представленим винаходом знаходився в дозі від 1 мкг/кг до 20 мг/кг, більш переважно, від 10 мкг/кг до 5 мг/кг, найбільш переважно від 0,1 до 2 мг/кг. Переважно надається у вигляді дози кулеподібної маси. Крім того, може бути використана безперервна інфузії, яка включає безперервну підшкірну доставку за допомогою осмотичного мінінасосу. Якщо це так, то фармацевтична композиція може вливатися в дозі від 5 до 20 мкг/кг/хв, більш переважно, від 7 до 15 мкг/кг/хв. Зокрема, фармацевтичну композицію вводять шляхом ін'єкцій в око так, щоб зв'язуючий протеїн за даним винаходом надавався в дозі від 0,1 мг до 10 мг на ін'єкцію, більш переважно від 0,3 до 6 мг на ін'єкцію, найбільш переважно від 1 мг до 4 мг на ін'єкцію. Крім того, фармацевтичну композицію вводять у вигляді очних крапель в очі, так що одна крапля розчину містіть зв'язуючий протеїн за винаходом в концентрації від 10 до 120 мг/мл, більш переважно, від 20 до 100 мг/мл, найбільш переважно від 40 до 80 мг/мл, та застосовується для ока. В іншому варіанті здійснення винаходу зв'язуючий протеїн, який інгібує активність VEGFАххх, як описано вище, може застосовуватися у комбінації зі зв'язуючим протеїном або малою молекулою, що інгібує активність PIGF, з тим же рівнем інгібування PIGF як описано вище для VEGF-Axxx. Даний варіант здійснення ґрунтується на тому факті, що PIGF, як виявлено, є ангіогенним на сайтах, де рівні VEGF-Axxx є збільшеними. Крім того, зв'язуючий протеїн, що інгібує активність VEGF-Аххх, як описано вище, може застосовуватися у комбінації зі зв'язуючим протеїном або малою молекулою, що інгібує активність фактора росту похідних тромбоцитів (PDGF), VEGF-C або інших членів VEGF родини протеїнів, фактора некрозу пухлини альфа (TNFalpha), дельта-ліганду, такого як 4 (Dll4), інтерлейкіну 6 (IL-6), нейроліпіну або ангіопоетіну 2 (Ang2). Крім того, винахід передбачає способи лікування. В одному аспекті спосіб лікування ретинопатії передбачає спосіб, який включає введення пацієнту, що потребує такого лікування, терапевтично ефективної кількості зв'язуючого протеїну за винаходом, зокрема, зв'язуючого протеїну, який інгібує взаємодію між VEGF-Axxx людини та VEGFR-2 людини, але не взаємодію між VEGF-Axxxb людини та VEGFR-2 людини, а також зв'язуючого протеїну, який інгібує опосередкований VEGFR-2 ангіогенез. Крім того, винахід стосується способів застосування зв'язуючого протеїну, як описано, щоб інгібувати біологічну активність VEGF-A в клітині або, щоб інгібувати біологічну активність опосередковану VEGFR-2. Клітина може бути розташована in vivo або ex vivo, та може бути, наприклад, клітиною живого організму, клітиною культури або клітиною в зразку тканини. Спосіб може включати контактування зазначеної клітини з будь-якою взаємодією з VEGF-A/VEGFR-2, інгібуючи зв'язуючі протеїні, описані в даному документі, в кількості та протягом часу, достатнього для інгібування такої біологічної активності. Винахід передбачає спосіб лікування суб'єкта, який перебуває в стані, який реагує на інгібування VEGF-Axxx або VEGFR-2. Такий спосіб включає введення зазначеному суб'єкту ефективного кількості зв'язуючого протеїну, описаного в даному документі. Стан може бути таким, що характеризується порушенням ангіогенезу. Стан може бути гіперпроліферативним станом. Приклади станів (або порушень), придатних для лікування включають автоімунні розлади, запальні розлади, ретинопатії (зокрема, проліферативні ретинопатії) та рак, зокрема, одне з захворювань, описаних вище. Будь-який зі зв'язуючих протеїнів, описаних в даному документі, може бути застосований для виробництва лікарського засобу для лікування такого розладу, зокрема, розладу, вибраного з групи, що складається з: автоімунного розладу, запального розладу, ретинопатії та раку. Переважні стани (або порушення), що підходять для лікування, включають першу лінію метастатичної нирково-клітинної карциноми, рецидив мультиформної гліобластоми, ад'ювантний рак товстої кишки, ад'ювантний HER2-негативний рак молочної залози, ад'ювантний HER2-позитивний рак молочної залози, ад'ювантний недрібноклітинний рак легень, дифузну велику В-клітинну лімфому, першу лінію поширеного раку шлунка, першу лінію HER2-негативного метастатичного раку молочної залози, першу лінію HER2-позитивного метастатичного раку молочної залози, першу лінію метастатичного раку яєчників, шлунково-кишкові стромальні пухлини, високий карциноїдний ризик, гормонорезістентний рак передміхурової залози, нещодавно діагностовану мультиформну гліобластому, метастатичний рак голови та шиї, рецидив чутливого до платині раку яєчників, другу лінію метастатичного раку молочної залози, поширений недрібноклітинний рак легені, неплоскоклітинний, недрібноклітинний рак легені з ЦНС метастазами, що раніше лікувалися, та рецидивну множинну мієлому, рак передміхурової залози, недрібноклітинний рак легенів 14 UA 111820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (NSCLC), колоректальний рак та рак підшлункової залози, прогресуючий рак яєчника (AOC), AOC пацієнти з симптомами злоякісного асциту та неходжкінську лімфому. Рекомбінантній зв'язуючий протеїн згідно винаходу може бути одержаний та/або надалі вдосконалений за допомогою ряду методів, таких як дисплей на поверхні бактеріофагів (WO 90/02809, WO 07/006665) або бактеріальних клітин (WO 93/10214), рибосомний дисплей (WO 98/48008), відображення на плазміді (WO 93/08278) або шляхом використання гібридних конструкцій ковалентного РНК-повторюваного протеїну (WO 00/32823), або внутрішньоклітинна експресія та відбір/скринінг, наприклад, шляхом аналізу комплементації протеїну (WO 98/341120). Такі методи є відомими кваліфікованому спеціалісту в даній галузі з рівня техніки. Бібліотека анкіринових протеїнів, що повторюються, використана для відбору/скринінгу рекомбінантного зв'язуючого протеїну у відповідності з винаходом, може бути одержана згідно з протоколами, відомими кваліфікованому спеціалісту в даній галузі з рівня техніки (WO 02/020565, Binz, HK et al., JMB, 332, 489-503, 2003, and Binz et al., 2004, в цитованому місці). Застосування такої бібліотеки для відбору VEGF-Axxx для конкретних DARPins наведене в прикладі 1. За аналогією, анкіринові мотиви, що повторюються, послідовності, як представлено вище, можуть використовуватися для створення бібліотек анкіринових протеїнів, що повторюються, які можуть бути використані для відбору або скринінгу VEGF-Axxx специфічних DARPins. Крім того, домени, що повторюються, за представленим винаходом можуть бути модульно зібрані з повторюваних модулів, у відповідності з представленим винаходом, та відповідних закупорюючих модулів (Forrer, P., et al., FEBS letters 539, 2-6, 2003) з використанням стандартних технологій рекомбінантних ДНК (наприклад, WO 02/020565, Binz et al., 2003, в цитованому місці та Binz et al., 2004, в цитованому місці). Винахід не обмежується конкретним варіантом втілення, описаним у прикладах. Інші джерела можуть бути використані та оброблені, крім того, нижче описано в загальних рисах. Приклади Всі вихідні речовини та реагенти, що описані нижче, є відомими кваліфікованому спеціалісту в даній галузі, та є комерційно доступними, або можуть бути одержані з використанням добре відомих методів. Матеріали Хімічні речовини були придбані у компанії Fluka (Швейцарія). Олігонуклеотиди були від компанії Microsynth (Швейцарія). Якщо не вказано інше, ДНК-полімерази, ферменти рестрикції та буфери були від компанії New England Biolabs (США) або Fermentas (Литва). Штамом для клонування та продукування протеїну був E. coli XL1-Blue (Stratagene, США). VEGF варіанти були від компанії R & D Systems (Minneapolis, США), або були продуковані в клітинах яєчника китайського хом'ячка або в Pichia pastoris та очищували у відповідності зі стандартними протоколами (Rennel, E. S. et al., European J. Cancer 44, 1883-94, 2008; Pichia експресійна система від Invitrogen). Біотинильовані варіанти VEGF були одержані за допомогою хімічним шляхом за рахунок зв'язування фрагмента біотину з первинними амінами очищених VEGF варіантів з використанням стандартних реагентів та способів біотинілювання (Pierce, США). Молекулярна біологія Якщо не вказане інше, способи здійснюють у відповідності з описаними протоколами (Sambrook J., Fritsch E. F. and Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1989, New York). Бібліотеки сконструйованого анкіринового протеїну, що повторюється Бібліотеки N2C та N3C сконструйованих анкіринових протеїнів, що повторюються, є описаними (WO 02/20565; Binz et al. 2003, в цитованому місці; Binz et al. 2004, в цитованому місці). Цифра в N2C та N3C описує число рандомізованих модулей, що повторюються, які є присутніми між N-термінальним та С-термінальним закупорюючими модулями. Номенклатура, яка використовується для визначення положення всередині одиниць та модулів, що повторюються, ґрунтується на Binz et al. 2004, в цитованому місці, з тією лише відмінністю, що межі модулів, що повторюються, та одиниць, що повторюються, зсунуті на одне положення амінокислоти. Наприклад, положення 1 модуля, що повторюється, Binz et al. 2004 (в цитованому місці) відповідає положенню 2 модуля, що повторюється, за представленим розкриттям та, відповідно, положення 33 модуля, що повторюється, Binz et al. 2004 (в цитованому місці) відповідає положенню 1 наступного модуля, що повторюється, за представленим винаходом. Всі послідовності ДНК були підтверджені шляхом секвенування, та розраховані молекулярні маси всіх описаних протеїнів були підтверджені методом мас-спектрометрії. Приклад 1: Вибір зв'язуючих протеїнів, що містять домени, що повторюються, зі специфічністю зв'язування з VEGF-Axxx15 UA 111820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Використовуючи рибосомний дисплей (Hanes, J. and Plückthun, A., PNAS 94, 4937-42, 1997), багато сконструйованих анкіринових протеїнів, що повторюються, (DARPins) зі специфічністю зв'язування з VEGF-Axxx були відібрані з N2C або N3C DARPin бібліотек, описаних Binz et al. 2004 (в цитованому місці). Зв'язування вибраних клонів зі специфічними (VEGF-Axxx) та неспецифічними (MBP, E. coli мальтозний зв'язуючий протеїн) мішенями оцінювали шляхом сирого екстракційного ІФА, який демонструє, що VEGF-Axxx зв'язуючі протеїни були успішно відібрані (фіг. 1). Домени, що повторюються SEQ ID NO: від 1 до 7 представляють собою амінокислотні послідовності вибраних зв'язуючих протеїнів, які містять домени, що повторюються, зі специфічністю зв'язування з VEGF-Axxx. Аналіз послідовності вибраних зв'язуючих протеїнів показав специфічні анкіринові мотиви, що повторюються, послідовності, притаманні певним вибраним родинам зв'язуючих протеїнів. Вибір VEGF-Axxx специфічних анкіринових протеїнів, що повторюються, шляхом рибосомного дисплею Відбір VEGF-Axxx специфічних анкіринових протеїнів, що повторюються, виконували шляхом рибосомного дисплею (Hanes and Plückthun, в цитованому місці), використовуючи VEGF-A164 собаки або VEGF-A165 людини як протеїни-мішені, бібліотеку сконструйованих анкіринових протеїнів, що повторюються, як описано (WO 02/020565, Binz et al., 2003, в цитованому місці, та Binz et al., 2004, в цитованому місці) та встановлених протоколах (Zahnd, C., Amstutz, P. and Plückthun, A., Nat. Methods 4, 69-79, 2007). Цикли відбору шляхом рибосомного дисплея проводили на варіантах VEGF собаки або людини (в тому числі біотинільованих варіантах, іммобілізованих на нейтравідині або стрептавідині) як з N2C так і N3C DARPin бібліотеками з використанням встановлених протоколів (Binz et al., 2004, в цитованому місці). Число зворотних циклів транскрипції (RT)-PCR після кожного циклу відбору постійно скорочувалась з 40 до 30, регулюючи вихід, в результаті збільшення зв'язуючих. Чотири початкових цикли відбору VEGF собаки дали пули наномолярної афінності DARPins, як показано за допомогою вимірювань одиничних клонів в ІФА та SPR. Для того, щоб знайти DARPins з додатково покращеними афінностями, проводили додаткові вибірки за швидкістю дисоціації на біотинільованих VEGF людини або собаки, іммобілізованих на нейтравідині або стрептавідині, беручі пули, після другого та третього початкових циклів відбору рибосомного дисплею, с наступним циклом відбору за швидкістю дисоціації на VEGF людини. Вибрані клони специфічно зв'язуються з VEGF-Axxx як показано шляхом сирого екстрактного ІФА Конкретно вибраний DARPins специфічно зв'язуючі VEGF-Axxx були визначені шляхом імуноферментного аналізу (ІФА), з використанням сирих екстрактів Escherichia coli, DARPin експресії клітин з використанням стандартних протоколів. Відібрані клони, клонували в pQE30 (Qiagen) векторі експресії, трансформованому в E.coli XL1-Blue (Stratagene), а потім який вирощували протягом ночі при 37 °C в 96-глибоко-луночному планшеті (кожен клон в одній лунці), який містить 1 мл живильного середовища (2YT, що містить 1 % глюкози та 100 мкг/мл ампіциліну). 1 мл свіжого 2YT, що містить 50 мкг/мл ампіциліну інокулювали зі 100 мкл нічної культури в свіжому 96-глибоко-луночному планшеті. Після інкубації протягом 2 годин при 37 °C, експресію індукували IPTG (1 мМ кінцевої концентрації) та продовжували протягом 3 годин. Клітини збирали, знову суспендували в 100 мкл B-PERII (Pierce) та інкубували протягом 15 хвилин при кімнатній температурі при струшуванні. Потім додавали 900 мкл PBS-ТБ (PBS доповнений 0,2 % BSA, 0,1 % твіном 20, рН 7,4), та клітинний детрит видаляли центрифугуванням. 100 мкл кожного лізованого клону, застосовували до лунки з нейтравідином, що покривали пластинкою MaxiSorp, що містить або VEGF-Axxx варіант, або незв'язані MBP, іммобілізовані за рахунок їх біотинового фрагмента, та інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. Після ретельного промивання PBS-T (PBS доповнений 0,1 % твіном 20, рН 7,4) пластина була проявлена з використанням стандартних процедур ІФА, використовуючи моноклональні анти-RGS(His)4 антитіла (34650, Qiagen), як первинні антитіла, та поліклональні анти-мишині антитіла кози, кон'юговані з лужною фосфатазою (A3562, Sigma), як вторинний реагент. Потім, шляхом застосування динатрію 4-нітрофенилфосфату (4NPP, Fluka), як субстрат для лужної фосфатази, виявляли зв'язування. Проявлення кольору вимірювали на 405 нм. Результати прикладу сирого екстрактного ІФА, використані для ідентифікації зв'язування DARPins з VEGF-Axxx, представлені на фіг. 1. Скринінг декількох сотень клонів за рахунок такого сирого клітинного екстрактного ІФА показав більше сотні різних DARPins зі специфічністю до VEGF-Axxx. Дані зв'язуючі протеїни були відібрані для подальшого аналізу. Приклади амінокислотних послідовностей вибраних анкіринових доменів, що повторюються, які специфічно зв'язуються з VEGF-Axxx, представлені в SEQ ID NO: від 1 до 7. 16 UA 111820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Виведення мотивів, що повторюються, послідовності з вибраних доменів, що повторюються, зі специфічністю зв'язування з VEGF-Axxx Амінокислотні послідовності вибраних доменів, що повторюються, зі специфічністю зв'язування з VEGF-Axxx були додатково проаналізовані за допомогою інструментальних методів аналізу послідовності, відомих практикуючому спеціалісту в даній галузі (WO 02/020565; Forrer et al., 2003, в цитованому місці; Forrer, P., Binz, H.K., Stumpp, M.T. and Plückthun, A., ChemBioChem, 5(2), 183-189, 2004). Однак, на відміну від WO 02/020565, де мотиви, що повторюються, які зустрічаються в природі, були використані для виведення повторюваних мотивів послідовності, в даному документі, повторювані мотиви послідовності були виведені з одиниць, що повторюються, вибраних доменів, що повторюються, зі специфічністю зв'язування з VEGF-Axxx. В зв'язку з цим, були визначені родини вибраних доменів, що повторюються, які містять загальний повторюваний мотив послідовності. Високий рівень та розчинна експресія DARPins Для подальшого аналізу відібрані клони, які демонстрували специфічне зв'язування з VEGFAxxx в сирому клітинному екстрактному ІФА, як описано вище, були експресовані в клітинах E.coli XL1-blue та очищені, використовуючи свої His-мітки за допомогою стандартних протоколів. 25 мл культури (LB, 1 % глюкози, 100 мг/л ампіциліну, 37 °C), що простояли протягом ночі, використовували для інокуляції 1 л культури (такого ж самого середовища). При А (600) = 0,7, культури були індуковані 0,5 мМ IPTG та інкубували при 37 °C протягом 4 годин. Культури центрифугували та одержані в результаті пеллети знову суспендували в 40 мл TBS-500 (50 мМ Тріс-HCl, 500 мМ NaCl, рН 8) та піддавали дії ультразвуку. Лізат знову центрифугували, та додавали гліцерин (10 % (об./об.), кінцева концентрація) та імідазол (кінцевої концентрації 20 мМ) до одержаного в результаті супернатанту. Протеїни очищували на колонці з Niнітрилотриоцтовою кислотою (об'єм колонки 2,5 мл) у відповідності з інструкціями виробника (Qiagen, Німеччина). До 200 мг добре розчинного DARPins зі специфічністю зв'язування з VEGFAxxx могло бути очищено з одного літра культури E. coli з чистотою > 95 %, як встановлено з SDS-15 % PAGE. Такі очищені DARPins застосовують для подальшої характеристики. Приклад 2: Визначення значень IC50, вибраних DARPins зі специфічністю зв'язування з VEGF-Axxx в аналізі проростання сфероїда Додавання VEGF-Axxx до HUVEC сфероїдів, що є вбудованими в колагенові матриці призводить до проростання сфероїду. Додавання інгібітору VEGF-Axxx буде блокувати формування відростків, які можуть бути статистично кількісно визначені за кількістю та довжині відростків. При додаванні різних концентрацій інгібітору та постійної кількості VEGF, може бути визначено IC50. Інгібування проростання сфероїду шляхом VEGF-Axxx специфічного DARPins Аналізи проростання сфероїду виконували у відповідності зі стандартними протоколами (Korff et al., в цитованому місці). DARPins зі специфічністю до VEGF-Axxx були відібрані та очищені до > 96 % чистоти, як описано в прикладі 1. В клітинах пупкової вени людини вирощували культуру до злиття в моношар. Після трипсинізації, суспензію клітин розташовували у висячу краплю, щоб сформувати сфероїди, тобто приблизно 500 організованих агрегованих HUVEC. Сфероїди були вбудовані в колагенову матрицю та стимульовані VEGF-A165, щоб ініціювати проростання відростків. Додатково додавали інгібітори проростання, щоб спостерігати їх дію на інгібування проростання. Кількість відростків на сфероїд та довжина відростків були кількісно визначені, використовуючи графічне програмне забезпечення. Результати двох прикладів аналізів проростання сфероїда представлені на фіг. 2а (DARPin # 30 зі специфічністю зв'язування з VEGF-Axxx) та фіг. 2b (DARPin NC, негативний контроль DARPin без специфічності зв'язування з VEGF-Axxx; наприклад, DARPin E3_5 (Binz et al., 2005, в цитованому місці)). Найбільш ефективні DARPins в даному аналізі показали значення IC 50 в діапазоні від 10 до 50 пМ, в той час як Авастин®, Луцетис® та Макуген® показали значення IC50 в паралельних експериментах в діапазоні від 150 до 500 пМ. Приклад 3: Визначення специфіки мішені DARPin #27 в порівнянні з Авастином® за допомогою аналізу поверхнево-плазмонного резонансу VEGF-A164 собаки або VEGF-A164b собаки були іммобілізованими в проточній комірці, та була проаналізованою взаємодія DARPin # 27 (домен, що повторюється, SEQ ID NO: 1, який відповідає амінокислотам від 1 до 159) та Авастину® з іммобілізованими мішенями. Аналіз поверхнево-плазмонного резонансу (SPR) SPR вимірювали, використовуючи прилад Proteon (BioRad). Рухомий буфер представляв собою 20 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl та 0,005 % Твін 20. Близько 1200 умовних одиниць VEGF-A164 собаки або VEGF-A164b собаки були іммобілізовані на чипі GLC (BioRad). 17 UA 111820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Взаємодію вимірювали на швидкості потоку від 60 мкл/хв з 5 хвилинним потоком буферу, 100 секунд ін'єкційного введення Авастину® або DARPin # 27 в концентрації 250 нМ та вимірювали швидкість дисоціації декількох хвилин з буфером потоку. Сигнал непокритої комірки порівняння віднімали від вимірів. Результати є представленими на фіг. 3а (взаємодія Авастину з VEGF-A164 собаки), фіг. 3b (взаємодія Авастину з VEGF-A164b собаки), фіг. 3c (взаємодія DARPin # 27 з VEGF-A164 собаки) та фіг. 3d (взаємодія DARPin # 27 з VEGF-A164b собаки). В той час як Авастин чітко взаємодіє як з іммобілізованими VEGF ізоформами, DARPin # 27 демонструє взаємодію тільки з VEGF-A164, а не з VEGF-A164b. Приклад 4: In vivo ефективність DARPin # 30 щодо інгібування VEGF-A165 пропотівання рідини крізь судини в моделі на кролику. Пегильований DARPin # 30 (домен, що повторюється, SEQ ID NO: 4, який відповідає амінокислотам від 1 до 126) або Луцетис® застосовують шляхом ін'єкції в скловидне тіло в око кролика, щоб перевірити їх ефективність для інгібування пропотівання рідини крізь судини, яке є індукованим шляхом наступної інтравітреальної ін'єкції VEGF-A165 людини. Вимірювання інгібування пропотівання рідини крізь судини у кроликів В 1-й день будь-який з PBS, ПЕГильованого DARPin # 30 (125 мкг) або еквімолярної кількості Луцетису® (162 мкг) застосовують у вигляді ін'єкції в скловидне тіло в одне око кожного кролика (оброблене око). На 4-й день та 30 день в скловидне тіло обробленого ока кожного кролика вводили ін'єкцію 500 нг VEGF-A165 людини. Обидва ока всіх тварин оцінювали через 48 годин після ін'єкції VEGF-A165 шляхом вимірювання вмісту флуоресцеїну в усіх очах через 1 годину після внутрішньовенного ін'єкційного введення флуоресцеїну натрію (50 мг/кг маси тіла тварини, 10 % (маса/об'єм) в 0,9 % (маса/об'єм) сольового розчину). Співвідношення кількості флуоресценції в оброблених та необроблених очах були розраховані для кожної тварини. Співвідношення, що дорівнює одиниці, відповідає відсутності додаткового витоку флуоресценції в обробленому оці, співвідношення більше одиниці вказує на більший витік флуоресценції в обробленому оці, ніж в необробленому контрольному оці. Одержання ПЕГильованого DARPin ПЕГилювання протеїну за рахунок використання одного Cys залишку та малеімідної хімії є добре відомим кваліфікованому спеціалісту в даній галузі з рівня техніки та може бути виконано у відповідності з встановленими протоколами (наприклад, від Pierce). DARPin # 30, що містить додатковий C-термінальний лінкер (GGGSGGGSC, SEQ ID NO: 8) очищували майже до однорідності, використовуючи стандартні хроматографічні методи. Даний протеїн повністю відновлюють, використовуючи ДТТ, та очищують за допомогою гель-фільтрації для видалення ДТТ, та замінюють буфер PBS. ПЕГ-малеімід (метоксиполі(етиленгліколь)оксопропіламінопропілмалеімід; NOF, № Sunbright ME-200MA), розчинений в PBS змішують з DARPin в PBS при близько 15 % молярному надлишку ПЕГмалеіміду протягом 2-4 годин при кімнатній температурі. ПЕГильований DARPin потім відокремлюють від нереакційноздатного DARPin та нереакційноздатних фрагментів ПЕГ шляхом застосування стандартної аніонобмінної хроматографії. Результати показані на фіг. 4. Як ПЕГильований DARPin # 30, так і Луцетис® були здатні захищати очі кролика від VEGF-A165 індукованого пропотівання рідини крізь судини через 4 дні після того, як їх застосовували шляхом ін'єкцій в скловидне тіло. Тим не менше, тільки ПЕГильований DARPin # 30, а не Луцетис®, був здатним захищати очі кролика від VEGF-A165 індукованого пропотівання рідини крізь судини аж до 30 днів після ін'єкції в скловидне тіло. В інших експериментах термінальний напіврозпад різних зв'язуючих протеїнів за винаходом в скловидному тілі були виміряні після ін'єкції в скловидне тіло ока кроликів. DARPin # 30, що містить додатковий C-термінальний лінкер (GGGSGGGSC, SEQ ID NO: 8), був кон'югований з 20 кДа та 40 кДа не протеїновим ПЕГ фрагментом, використовуючи відповідні ПЕГ малеіміди від NOF (дивись приклад 5). Визначено, що термінальний напіврозпад складав 3,5 дні (+/- 0,3 дні), 6,1 днів (+/- 1,0 день) та 5,4 днів (+/-0,8 днів) для DARPin # 30, DARPin # 30, кон'югованого з 20 кДа фрагментом ПЕГ, та DARPin # 30, кон'югованого з 40 кДа фрагментом ПЕГ. Несподівано, збільшення молекулярної маси не протеїнового фрагменту ПЕГ від 20 кДа до 40 кДа в результаті не призводило до збільшення термінального напіврозпаду. Така сама тенденція спостерігалась у відповідних експериментах, в яких використовували зв'язуючі протеїни, які містять домен, що повторюється, SEQ ID NO: 1 (амінокислоти від 1 до 159) або SEQ ID NO: 3 (амінокислоти від 1 до 126), замість домену, що повторюється SEQ ID NO: 4. Приклад 5: Рекомбінантні зв'язуючі протеїни Прикладами рекомбінантних зв'язуючих протеїнів, які містять домени, що повторюються, зв'язуючого VEGF-Axxx та протеїновий полімерний фрагмент є SEQ ID NO: 1 та 4. Домен, що 18 UA 111820 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 повторюється, SEQ ID NO: 1 відповідає амінокислотам з 1 до 159 та протеїновий полімерний фрагмент SEQ ID NO: 1 відповідає амінокислотам від 160 до 1'024. Домен, що повторюється, SEQ ID NO: 4 відповідає амінокислотам від 1 до 126 та протеїновий полімерний фрагмент SEQ ID NO: 4 відповідає амінокислотам з 127 до 536. Зв'язуючі протеїни SEQ ID NO: 1 та 4 були експресовані в цитоплазмі Escherichia coli, використовуючи стандартні методики, відомі кваліфікованому спеціалісту в даній галузі з рівня техніки (дивись, наприклад, рQE система експресії від Qiagen (Німеччина)). Met залишок, який додатково кодується за допомогою вектора експресії, ефективно відщеплювався в цитоплазмі E. coli від експресованого поліпептиду, до того як початковий Met стає надалі невеликим Gly залишком (тобто амінокислота в положенні 1 SEQ ID NO: 1 та 4). Клітини лізували (наприклад, шляхом використання французького пресу) та зв'язуючі протеїни очищували майже до однорідності з сирого екстракту клітин шляхом використання стандартних хроматографічних методів, відомих кваліфікованому спеціалісту в даній галузі з рівня техніки. Приклади рекомбінантних зв'язуючих протеїнів, які містять один домен, що повторюється, зв'язуючий VEGF-Axxx та один не протеїновий полімерний фрагмент, були одержані, використовуючи протеїни, що повторюються, SEQ ID No: 2, 3, 5, 6 та 7. Дані протеїни, що повторюються, містять N-термінальний домен, що повторюється, з наступним поліпептидним лінкером та С-термінальний Cys. Відповідні домени, що повторюються, відповідають амінокислотам від 1 до 159 для SEQ ID NO: 2 та 7, й амінокислотам від 1 до 126 для SEQ ID NO: від 3 до 6. Протеїни, що повторюються, SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6 та 7 були експресовані в цитоплазмі Escherichia coli, використовуючи стандартні методики, відомі кваліфікованому спеціалісту в даній галузі з рівня техніки (дивись, наприклад, Expressionist від Qiagen (Німеччина)). Met залишок, який додатково кодується за допомогою вектора експресії, ефективно відщеплювався в цитоплазмі E. coli від експресованого поліпептиду, до того як початковий Met стає надалі невеликим Gly залишком (тобто амінокислота в положенні 1 SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6 та 7). Клітини лізували (наприклад, шляхом використання французького пресу) та зв'язуючі протеїни очищували майже до однорідності з сирого екстракту клітин шляхом використання стандартних хроматографічних методів, відомих кваліфікованому спеціалісту в даній галузі з рівня техніки. Очищені протеїни, що повторюються, які містять один Cys залишок, потім, були кон'юговані з не протеїновим полімерним фрагментом, використовуючи стандартну малеімідну хімію, як описано в прикладі 4. Таким чином, були одержані зв'язуючий протеїн за винаходом, який містить протеїн, що повторюється, SEQ ID NO: 2 та 40 кДа не протеїновий ПЕГ фрагмент (наприклад, 40 кДа малеімід-ПЕГ-(α-[3-(3-малеімідо-1-оксопропіл)аміно]пропіл-ωметоксиполіоксіетилен) від NOF, продукт № Sunbright ME-400 МА), протеїн, що повторюється, SEQ ID NO: 3 та 20 кДа не протеїновий ПЕГ фрагмент (наприклад, 20 кДа малеімід-ПЕГ-(α-[3-(3малеімідо-1-оксопропіл)аміно]пропіл-ω-метоксиполіоксіетилен) від NOF, продукт № Sunbright ME-200 МА), протеїн, що повторюється, SEQ ID NO: 5 та 12 кДа не протеїновий ПЕГ фрагмент (наприклад, 12 кДа малеімід-ПЕГ-(α-[3-(3-малеімідо-1-оксопропіл)аміно]пропіл-ωметоксиполіоксіетилен) від NOF, продукт № Sunbright ME-120 мА), протеїн, що повторюється, SEQ ID NO: 6 та 5 кДа не протеїновий ПЕГ фрагмент (наприклад, 5 кДа малеімід-ПЕГ-(α-[3-(3малеімідо-1-оксопропіл)аміно]пропіл-ω-метоксиполіоксіетилен) від NOF, продукт № Sunbright ME-050MA) та протеїн, що повторюється, SEQ ID NO: 7 та 2 кДа не протеїновий ПЕГ фрагмент (наприклад, 2 кДа малеімід-ПЕГ-(α-[3-(3-малеімідо-1-оксопропіл)аміно]пропіл-ωметоксиполіоксіетилен) від NOF, продукт № Sunbright ME-020MA). ПЕГильовані протеїни, що повторюються, потім були відокремлені від непегильованих протеїнів, що повторюються, та надлишку ПЕГ стандартними хроматографічними методами, відомими кваліфікованому спеціалісту в даній галузі з рівня техніки. Таким чином, SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6 та 7 були кон'юговані з тіолом їх C-термінального цистеїну до малеіміду ПЕГ (α-[3-(3-малеімідо-1-оксопропіл)аміно]пропіл-ωметоксиполіоксіетилену). Таким чином була одержана наступна структура: , в якій Х представляє собою SEQ ID NO:2, 3, 5, 6 або 7, та n є позитивним цілим числом. 19 UA 111820 C2 20 UA 111820 C2 21 UA 111820 C2 22 UA 111820 C2 23 UA 111820 C2 24 UA 111820 C2 25 UA 111820 C2 26 UA 111820 C2 27 UA 111820 C2 5 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 15 20 25 30 35 1. Рекомбінантний зв'язуючий протеїн, який містить анкіриновий домен, що повторюється, та поліетиленгліколевий фрагмент, в якому вказаний анкіриновий домен, що повторюється, зв'язується з VEGF-A165 та інгібує зв'язування VEGF-A165 з VEGFR-2, та в якому вказаний анкіриновий домен, що повторюється, містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з: (1) амінокислот 1-159 SEQ ID NО: 1, (2) амінокислот 1-159 SEQ ID NО: 2, (3) амінокислот 1-126 SEQ ID NО: 3, (4) амінокислот 1-126 SEQ ID NО: 4, (5) амінокислот 1-126 SEQ ID NО: 5, (6) амінокислот 1-126 SEQ ID NО: 6 і (7) амінокислот 1-159 SEQ ID NО: 7, та в якому вказаний поліетиленгліколевий фрагмент має молекулярну масу від 1 кДа до 100 кДа. 2. Зв'язуючий протеїн за пунктом 1, в якому вказаний анкіриновий домен, що повторюється, є кон'югованим на своєму С-кінці за рахунок пептидного зв'язку з поліпептидним лінкером та Стермінальним залишком Cys, в якому тіол вказаного С-термінального Cys є кон'югованим з вказаним поліетиленгліколевим фрагментом, та в якому вказаний поліетиленгліколевий фрагмент є малеімід-зв'язаним поліетиленгліколем. 3. Зв'язуючий протеїн за пунктом 2, в якому вказаний малеімід-зв'язаний поліетиленгліколь являє собою α-[3-(3-малеімідо-1-оксопропіл)аміно]пропіл-ω-метоксиполіоксіетилен. 4. Зв'язуючий протеїн за пунктом 1, в якому вказаний зв'язуючий протеїн містить анкіриновий протеїн, що повторюється, вибраний з групи, що складається з анкіринових протеїнів, що повторюються, з SEQ ID NО: 2, 3, 5, 6 або 7. 5. Зв'язуючий протеїн за будь-яким з пунктів 2-4, в якому вказаний поліетиленгліколевий фрагмент має молекулярну масу від 10 до 40 кДа. 6. Зв'язуючий протеїн за пунктом 1, який містить анкіриновий протеїн, що повторюється, з SEQ ID NО: 3, в якому тіол С-термінального Cys вказаного анкіринового протеїну, що повторюється, є кон'югованим з вказаним поліетиленгліколевим фрагментом, та в якому вказаний поліетиленгліколевий фрагмент є малеімід-зв'язаним поліетиленгліколем. 7. Зв'язуючий протеїн за пунктом 6, в якому вказаний малеімід-зв'язаний поліетиленгліколь являє собою α-[3-(3-малеімідо-1-оксопропіл)аміно]пропіл-ω-метоксиполіоксіетилен, і в якому поліетиленгліколевий фрагмент має молекулярну масу щонайменше 10 кДа. 28