Спосіб одержання лейкоцитарного інтерферону

Способ получения лейкоцитарного ин терферона, предусматривающий культиоирование биологических культур, выделение и очистку целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве биологических культур используют штамм микроорганизма Escberlchla coll АТСС 31633 или 31634, транс формированный рекомбинатными плазмидными ДНК со вставкой Z-pBR322(Pstl)HclF-11-206 WMZ-pBR322(Pstl)/HclN SN 35-АНЦ6 с нуклеотидной последовательностью ATGGCCTCGCCCTTTGCTTTACTGATGGTC CTGGTGGTG СТ С AG CTG С AAGT С АА GCTGCTCTCTGGGCTGTGATCTCCCTGAGA CCCACAGCCTGGATAACAGGAGGAC CTTGATGCTCCTGGCACAAATGAGCAGAAT CTCTCCTTCCTCCTGTCTGATGGAC AGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAG TTTGATGGCAACCAGTTCCAGAAGG CTCCASCCATCTCTGTCCTCCATGAGCTGA TCCAGCAGATCTTCAACCTCTTTAC CACAAAAGATTCATCTGCTGCTTGGGATGA GGACCTCCTAGACAAATTCTGCACC GAACTCTACCAGCAGCTGAATGACTTGGAA GCCTGTGTGATGCAGGAGGAGAGGG TGGGAGAAACTCCCCTGATGAATGCGGACT CCATCTTGG CTGTGAAGАААТАСТТ CCGAAGAATCACTCTCTATCTGACAGAGAA GAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAG GTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCCCTC TCTTTATCAACAAACTTGCAAGAAA GATTAAGGAGGAAGGAA.TGTGATCTCCCT AGAGACCCAGAGCCTGGATAACAGG AGGACCTTGATGCTCCTGGCACAAATGAGC AGAATCTCTCCTTCCTCCTGTCTGA TGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGG AGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCA GAAGGCTCCAGCCATCTCTGTCCTCCATGA GCTGATCCAGCAGATCTTCAACCTC rTTACCACAAAAGATTCATCTGCTGCTTGG GATGAGGACCTCCTAGACAAATTCT GCACCGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACT TGGAAGCCTGTGTGATGCAGGAGGA GAGGGTGGGAGAAACTCCCCTGATGAATG CGGACTCCATCTTGGCTGTGAAGAAA TACTTCCGAAGAATCACTCTCTATCTGACA GAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCT GGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGAT CCCTCTCTTTATCAACAAACTTGCA AGAAAGATTAAGGAGGAAGGAA, TTACTGGTGGCCCTCCTGGTGCTCAGCTGCA AGTCAAG CTG CTCTGTG GG CTGTG ATCTG С CTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAG GAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAG GAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTG AAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAG GAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAA AGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGA TGATCCAGGAGATCTTCAATCTCTT CAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGA TGAGACCCTCCTAGACAAATTCTAC ACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTG GAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGG GGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAG GACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAA7A CTTCCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAGA GAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGG GAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCT TTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAG AAAGTTTAAGAAGTAAGGAA, TG rGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGC С> со CO oo о О 13380 AGGAGGACCTTGATGCrCCTGGCACAGATG AGG AGAATC rCTCTTTTCTCCTGCT TGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCC AGGAGGAGTT7GGCAACCAGTTCCA AAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGA GATGATCCAGCAGATCTTCAATCTC TTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGG GATGAGACCCTCCTAGACAAATTCT ACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACC TGGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGT GGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGG AGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAA TACTTCCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAG AGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCT GGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGAT CTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCA AGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAA. ATGGCCCTGTCCTTTTCTTTACTGATGGCCG TG CTGGTG CTC AG CTAC A AATCC ATCTGTT CTCTGGGCTGTGATCTGCCTCAGAC CCACAGCCTGGGTAATAGGAGGACCTTGAT ACTCCTGCAACAAATGGGAAGAATC TCTCATTTCTCCTGCCTGAAGGACAGACAT GATTTCGGATTCCCCGAGGAGGAGT TTGATGGCCACCAGTTCCAGAAGACTCAAG CCATCTCTGTCCTCCATGAGATCAT CCAGCAGACCTTCAATCTCTTCAGCACAGA GGACTCATCTGCTGCTTGGGAACAG AGCCTCCTAGAAAAATTTTCCACTGAACTTT ACCAGCAACTGAATGACGTGGAAG CATGTGTGATACAGGAGGTTGGGGTGGAAG AGACTCCCCTGARGAATGTGGACTC CATCCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAG AATCACTCTTTATCTAACAGAGAAG AAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTC AGAGCAGAAATCATGAGATCCCTCT CGTTTTCAACAAACTTGCAAAAAAGATTAA GGAGGAAGGAT, and TGTGATCT GCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAATAGGA GGACCTTGATACTCCTGCAACAAATG GGAAGAATCTCTCATTTCTCCTGCCTGAAG GACAGACATGATTTCGGATTCCCCG AGGAGGAGTTTGATGGCCACCAGTTCCAGA AGACTCAAGCCATCTCTGTCCTCCA TGAGATGATCCAGCAGACCTTCAATCTCTT CAGCACAGAGGACTCATCTGCTGCT TGGGAACAGAGCCTCCTAGAAAAATTTTCC ACTGAACTTTACCAGCAACTGAATG ACCTGGAAGCATGTGTGATACAGGAGGTTG GGGTGGAAGAGACTCCCCTGATGAA TGTGGACTCCATCCTGGCTGTGAGGAAATA CTTCCAAAGAATCDCTCTTTATCTA ACAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGG GAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGA CATCCCTCTCGTTTTCAACAAACTTGCAAA AAAGATTAAGGAGGAAGGAT; или последовательностью, которая гибридизуется со вставкой или указанной последовательностью при следующих условиях гибридизации: предгибридизация нитроцеллюлозного фильтра, несущего ДНК-посл ед оват ель нос ть ил и ДНК вст авку в четырехкратном буфере с 0,1% (мас./об.) фикола, 0,1% поливинилпирролидона, 0,1% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина, 0,5% натрий додецилсульфата с 200 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося при 68°С в течение 7 ч, а гибридизацияс меченой ДНК-вставкой и ДНК-последовательностью в четырехкратном буфере фикола (мас./об.), 0,02 % поливинилпирролидона, 0,02% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина, 0,5% натрий додецил сульфата, 200 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося, при 68°С в течение 16 ч, ополаскивание фильтра при комнатной температуре 0,53 SDS, отмывка при 68°С 2x0.53 SDS с однократной заменой раствора и 3 мл основания Тризма при комнатной температуре в течение 4 ч. Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к получению человеческого лейкоцитарного интерферона. Известен способ получения лейкоцитар- 5 ного интерферона, предусматривающий культивирование штаммов культивируемых клеток животных выделение и очистку целевого продукта. Целью изобретения является повыше- 10 ние чистоты целевого продукта. В данном способе осуществлено обнаружение последовательностей ДНК, кодирующих ЧеИФН- а в клетках E.coll. С помощью данного способа получают полипептид(ы), проявляющие иммунологическую или биологическую активность ЧеИФН-а. Настоящий способ включает обнаружение и выделение последовательностей ДНК и конструирование рекомбинантных молекул ДНК, кодирующих полипептид, обладающий иммунологической или биологической активностью ЧеИФН- а. Получены рекомбинантные ДНК, содержащие ДНК последовательности Z-pBR322/Pst) (HCIF4c, Z-pBR322(Pst)/HclP2h, Z-pBR322/Pst/ HclF-SN 35, Z-pBR322/Pst/HclF-SN42, Z 13380 pRT287/Pst/HclP2h-AH6, а также ДНК последовательности, которые гибридизируются с упомянутыми вставками. Способ иллюстрируется следующими примерами. П р,и м е р 1. Человеческие лейкоциты стимулируют и течение 5 часов при 37°С вирусом Сендай и экстрагируют смесь поли(А)РНК, содержащий мРНК человеческого лейкоцитарного интерферона (ЧеИФН- а мРНК). Стимулированные лейкоциты собирают и 1011 клеток суспендируют в 1 л раствора, содержащего 8 г NaCI, 0,2 г KCI, 1,15 г Na2HPO4 • 2Н2О и 0,2 г КН2РО4, растворенных в 1 л воды ("PBS") и добавляют при интенсивном перемешивании к 17 л 20 мМ Трис-НСІ (рН 7,5), 1 мМ Эдтук ("ТЕ-буфер"), 2% додецилсульфата натрия (ДНС) в делительную воронку емкостью 50 л. Прибавляют проназу к 200 ft г/мл и перемешивают раствор в течение 1 ч при комнатной температуре. Прибавляют 10 6 отсч./мин 1251глобин мРНК в качестве маркера для выделения поли/А/РНК. Прибавляют 2М Трис-НСІ (рН 9) в количестве, равном 1 /20 от общего объема (" 1 /20 обьемн"), и смесь экстрагируют при энергичном перемешивании 15 л повторно перегнанного фенола в течение 10 мин. Прибавляют 3 л хлороформа и смесь перемешивают 5 мин. После 30 мин отстаивания для разделения фаз удаляют водную фазу, всего 19,1 л объединяют с 60 г ДСН. Нуклеиновые кислоты осаждают из водной фазы 1/10 объемн. ЗМ ацетатом натрия (рН 5.5) и 2 объемами этанола. После хранения в течение ночи при 20°С осадок нуклеиновых кислот отфильтровывают через пластиковое чайное сито. Этот материал затем перемешивают с 200 мл THE (50 мМ Трис-НСІ (рН 7,5), 100 мМ NaCI, 5 мМ ЭДТУК), содержащего 0,5% ДСН. Его последовательно растворяют при добавлении еще 350 мл этого раствора. Осадок собирают центрифугированием в бутылях емкостью 1 л в центрифуге Сорволл RC-3 в течение 15 мин при 5000 об/мин и растворяют в 350 мл THE, содержащего 0,5% ДСН. Оба раствора THE объединяют, экстрагируют 3 раза 1 объемом фенола, 3 раза 1/2 объема эфира и 3 раза 1 объемом эфира. Из водной фазы выделяют всего 775 мг РНК. Поли(А) РНК смеси выделяют здсорбцией на олиго(аТ)целлюлозе. Прибавляют 2,7 олиго(с1Т)целлюлозы к 500 мл. После перемешивания в течение часа при комнатной температуре для проведения адсорбции поли(А)РНК на олиго(с1Т)целлюлозе, центрифугируют целлюлозу и смесь мРНК, связанных с ней, промывают один раз 50 мл THE и второй раз 15 мл THE. Затем связанную поли(А)РНК элюируіот пятью поеледоватея ьными промывками 2 мл Н2О. Получают 860 IX г поли(А)РНК. Надосадочный раствор РНК 5 из первой адсорбции подвергают двум последующим циклам адсорбции. При второй и третьей адсорбциях получают 600 ft г и 170 /г г РНК. РНК испытывают на ЧеИФН-« актив10 ность путем инъекции в ооциты Xenous laevls, РНК растворяют в 15 мл Трис-НСІ (рН 7,5), 88 мМ NaCI (ТНК буфер), чтобы получить концентрацию около 1 мг/мл. Инъецируют 50 мл этого раствора в каждые 50 ооцитов, 15 Ооциты инкубируют в течение ночи при комнатной температуре в среде Барта. Инкубированные ооциты затем промывают и гомогенизируют пипеткой Пастера в трубке для центрифуги Эппендорфа емкостью 1.5 20 мл в 0,5 мл 52 мМ трис-глицеринового буфера (рН 8,9). Смесь центрифугируют в течение 2 мин в центрифуге Эппендорфа, надосадочный слой сливают и замораживают при 20°С для испытаний. Одна единица ИФН25 or снижает количество вируса на пластине на 50%. Активность препарата ИФН-а выражается по отношению к известному человеческому ЧеИФН-а 69/19. Экстракт ооцитов имеет активность 300IU ИФН-сгна /иг РНК, 30 при этом ооциты инкубируют в течение 48 ч. Для дальнейшей очистки поли(А)РН К добавляют 0.5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТУК) к поли(А)РНК приготовления А для связывания концентрации 5 мМ ЭДТУК. 35 Полученный раствор экстрагируют дважды равным объемом ТНЕ-насыщенного фенолом и 5 раз - равным объемом эфира. Затем его пропускают через колонку с 0,1 мл, нагретую за 90 с до 100°С, и слоем в 13 мл с 40 градиентом сахарозы 5-23%, содержащей 50 мМ Трис-НСІ (рН 7,5). 1 мМ ЭДТУК, 0,2 М NaCI. В качестве маркера добавляют 10000 спм 5*-концевого 32 р-меченых фрагментов ДНК, произведенных при одновременном 45 усвоении pBR 322 и эндонуклеаз Hind III и Pst I. Центрифугирование проводят в SW 40 роторе при 10°С и 35000 об/мин в течение 16 ч. Фракции (0,6 мл) собирают с градиентом ISCO коллектором при 1 мл/мин. Испы50 тывают фракции на ЧеИФН-а мРНК. их положение по отношению к32 Р-ДНК маркерам. При последующем центрифугировании фракции, содержащие ЧеЙФН- амРНК, идентифицируют относительно маркеров 55 фракции с актвностью Че\ЛФЕ-а мРНК содержат 80/г г поли(А)РНК. Их смешивают с 2 объемами THE, содержащего 0,5% ДСН и 0,02% поливинилсульфата(в последних приготовлениях поливинилсульфат был исклю 13380 чен), при этом применяют колонку с SO fin олиго(оТ)целлюлозы После промывки колонки 40/* г смеси РНК элюируют 4 промывками 0,6 мл дистиллированной воды. После осаждения этанолом РНК растворяют в 1 мг/мл в 0,5 мМ ЭДТУК. Испытание на активность ЧеИФН- а мРНК проводят, как описано выше, на порции осадка поли(А)РНК. Он имеет удельную активность 3600 IU интерферона/// г. Следовательно, градиент сахарозы был обогащен поли(А)РНК примерно 10-кратно по отношению к ЧеИФН- амРНК. Получают приготовление с примерно 40-кратным обогащением. Синтез с ДНК смеси, содержащей ЧеИНФ-а сДНК. Поли(А) РНК, обогащенную ИФН- а мРНК. используют в качестве шаблона (модели) для получения однониточной комплементарной ДНК (сДН К), 800/< л реакционной смеси содержит 40 мМ Трис-HCI (рН 7,5), 30 мМ NaCI, 5 мМ МдСІг. 0,5 мМ ДТТ, 20 мг/мл олиго{оТ)12 - 18,5 мМ dGTP, dCTP и dTTP, 5 мМ 32 P-d ATP (HEH, удельная активность 10000 спм/нмоль), 60 мг/мл поли(А)РНК и 280 ед. обратной транскриптазы. После инкубации в течение 1 ч при 37°С прибавляют 0.5 М ЭДТУК и 20% ДСН (перекристаллизованного) к 10 мМ ЭДТУК и 0.1 % ДСН. Смесь экстрагируют 1 объемом фенола (перегнанного). Фенольную фазу промывают 200 fi л 200 мМ Трис-НСІ (рН 7,5), 1 мМ ЭДТУК и 0.1% СДН. объединяют водные фазы. Их экстрагируют равным объемом эфира и хроматографируют на колонке с 5 мл Сефадекс G-100 в THE. Собирают фракции по 0,1 мл при 0,3 мл/мин. Фракции, показывающие радиоактивность (как измерено по радиации Черенкова), объединяют и прибавляют ЗМ. Нуклеиновые кислоты осаждают 2,5 объемами этанола. После хранения в течение ночи при -20°С образцы центрифугируют, отбрасывают надосадочный слой. Осадок растворяют в 180 jun дистиллированной воды и переносят в силиконизированную трубку Эппендорфа. Прибавляют 20 ft л 5М NaOH и хранят смесь при комнатной температуре в течение 40 мин. Прибавляют 20 мл 5М ацетата натрия, 100 мл дистиллированной воды и 500 мл этанола. После охлаждения в течение ночи при -20°С собирают полученный осадок центрифугированием при силе, эквивалентной 10000-кратной силе тяжести (ЮОООхд) в течение 20 мин при 0°С. ВЫХОД ОДНОНИТОЧНОЙ СДНК составляет 10/4 г. Однониточный продукт сДНК находится в реальной сложной смеси большого числа 8 различных сДНК, транскрибированных из соответствующих мРНК. имеющихся в смеси поли(А)РНК. Только очень немногие из этих сДНК имеют отношение к ИФН- а, на5 пример H(lFN-a с ДНК. Определяют размеры различных однониточных сДНК с помощью электрофореза малого на щелочном 2%-ном геле агарозы с использованием 30 мМ NaOH, 2 мМ ЭДТУК 10 в качестве электролита. ^Р-сДН К имеет длину 600-1000 нуклеотидов, относящихся к однониточному глобину СДНК. 32Р-меченые фрагменты ДНК используют в качестве маркеров размера. 15 П р и м е р 2. Однонитевую сДНК превращают в двунитевую при обработке ДНК полимеразой 1. Осажденную однонитевую сДНК растворяют в 200/* л НгО, нагретой до 100°С, в течение 2 мин и инкубируют в 500 20 /г л 0,1 М нагретого денатурированного калийфосфатного буфера (рН 6,9) 10 мМ МдСІ2, 10 мМ ДТТ, 1 мМ каждого из dATP, dGTP и dCTP, 1 мМ 3H-dTTP (HEH, удельная активность 100000 спм/нмоль) и 150ед./мл E=coll 25 ДНК полимеразы 1. После 6,5 ч при 15°С прибавляют 0,5 ЭДТУК и 20% ДСН к 10 мМ ЭДТУК и 0,1% ДСН. Затем смесь экстрагируют 500 /< л фенола, фенольную фазу повторно экстрагируют 250/г л 20 мМ Трис-НСІ 30 (РН 7.5), 5 мМ ЭДТУК (ТЕ буфер). Обе водные фазы объединяют и хроматографируют на колонке с 5 мл Сефадекс G-100 в тех же самых уровнях. Прибавляют ЗМ ацетат натрия к 0,3 М и 2,5 объемам этанола, смеши35 вают для осаждения ДНК Всего собирают 13/* г ДНК. ДНК обрабатывают нуклеазой S1. Осажденную ДНК растворяют в 250 мл буфера (0,2 М NaCI. 50 мМ ацетата натрия (рН 4,5), 40 Ю мМ сульфата цинка и нагревают при 37°С в течение 30 мин Прибавляют 1,5 ju л Si фермента (11 единиц //* л), смесь инкубируют при 37°С в течение 30 мин. Прибавляют ДСН и-ЭДТУК к 0,1% ДСН и 5 мМ ЭДТУК и 45 экстрагируют смепсь 250 мл фенола. Фенольную фазу промывают 100 ulTE буфера. Объединяют водные фазы и хроматографируют на колонке с Сефадексом G-100 в THE, собирают фракции по 0,1 мл при скорости 50 0,3 мл/мин и определяют радиацию Черенкова для каждой фракции. После осаждения из этанола и ацетата натрия собирают 8 /( г двойной спирали ДНК. П р и м е р 3. Обрабатывают плазмиду 55 (в частности, pBR 322) эндонуклеазой Pstl и добавляют dGMP хвосты концевой трансфера зой. dFMP добавляют к 5' концу плазмиды для регенерации Pstl сайта и лигируют с сДНК фрагментом, несущим комплементар 13380 ные хвосты. Двунитевую сДНК удлиняют при добавлении dCMP хвостов к З1 концевому. Затем плазмиду и сДНК обрабатывают лигазой, чем обеспечивается введение сДНК в подходящий сайт плазмиды и пол- 5 учение гибридной ДНК. П р и м е р 4. Плазмиду pBR322 (20 г) гидролизуют21 единицами Pstl эндонуклеазы в 150 мл 10 мМ Трис-HCI (рН 7,5), 6 мМ МдСІг, 50 мМ NaCI, 6 мМ МдСІ2,50 мМ NaD, 10 6мМ 2-меркаптоэтанола, 200 мг/// л бычьего сывороточного альбумина (БСА). После 2 ч при 37°С смесь экстрагируют 1 объемом фенолхлороформной смеси (1:1) и 1 объемом эфира и осаждают этанолом. 15 Добавление гомополимерных хвостов dGMP с помощью терминальной деоксинуклеазидтрансферазы (TdT) осуществляют в 328 мл реакционного объема, содержащего 100 мМ какодилата натрия (рН 7,2), 10 мМ 20 NaH2PO4, 5 мМ МдСІг, 1 мМ dGTP, 50 мг/мл БСА и 3 - б ед. TdT (очищенного как указано выше) на 1 мг ДНК. Инкубируют при 37°С в течение 20 мин. Прибавляют ЭДТУК к 10 мМ, смесь экстрагируют как указано выше и ди- 25 ализуют два дня против буфера THE. Двунитевую ДНК удлиняют остатками dCMP по стандартной методике. Инкубируют 150 мл двунитевой с/ДНК, описанной выше, а 8 / і л 100 мМ какодилата натрия (рН 30 7,2), 2,5 мМ СоСІг, 50 ju г/мл БСА, 0,2 мМ dCTR, содержащего 3-6 ед. очищенного TdT на мг ДН К, в течение 8 мин при 27°С, а затем замораживают при -20°С. Инокулируют одну колонию Е.соИ Х1776 35 в 100 мл триптоновой среды с добавкой 100 г/мл диаминопимелиновой кислоты, 10 г/мл налидиксовой кислоты и 10 г/мл тетрациклина. Выращивают культуру при 37°С до кажущейся оптической плотности 0,6 при 40 650 нм (ОДб5о) и охлаждают на льду в течение 30 мин. Затем культуру седиментируют при 4000 об/мин в роторе, клетки промывают 50 мл 10 мМ NaCI, отделяют на центрифуге и повторно суспендируют в 20 мл 100 мМ 45 СаСІг. Суспензию охлаждают на льду в течение 30 мин. центрифугируют и снова суспендируют в 4 мл 100 мл 100 мМ СаСІг и хранят на льду в течение ночи для использования. Аликвоты (0,5 мл) храпят замороженными 50 при -70°С. Смешивают Знг dCMP-удлиненной ДНК с 22 нг dCMP-удлиненной Pstl, обработанной pBR322 в 50 мл ТНЕ-буфера. Инкубируют пои четырех последовательных стадиях 55 при 65, 46, 37 и 20°С. Прибавляют 20 /гл 100 мМ ТрисНСІ (рН 7,5), 100 мМ СаСІг, 100 мМ МдС1ги50/глТНЕ буфера, смесь охлаждают на льду 20 мин. 10 Рекомбинантные молекулы РНК добавляют к 100 /г л обработанных Са4**" клеток Е.соИ и смесь охлаждают на льду в течение 20 мин. нагревают до 20°С в течение 10 мин и прибавляют 0,6 мл триптоновой среды. Смесь помещают на 2 пластины с триптоновой агаровой средой, подготовленные как описано ранее. Эффективность трансфекции составляет3,3 • 104 колоний на/* г закаленной pBR322 трансфецированной ДНК, нативная PBR322 дает 3 * 10 колоний на ft г. Так как плазмида pBR322 включает ген устойчивости к тетрациклину, Е.соП реципиент, который был трансформирован плазмидой, будет расти в культуре, содержащей такой антибиотик, в отличие от нетрансформированных таким образом бактерий. Следовательно, рост в тетрациклиновой культуре позволяет провести селекцию организмов-хозяев, трансформированных рекомбинантной молекулой ДНК или рециклизованным вектором. После 48 ч при 37°С пикируют индивидуальные колонии и суспендируют в 100 мл триптоновой среды (подготовленной, как описано выше) в углублениях микротитерных пластин. После инкубации при 37°С в течение ночи в каждом углублении смешивают 100 мл 40%-ного глицерина. Пластины выдерживают при -20°С и готовлят набор из 100000 индивидуальных клонов трансформированной E.coll X1776. П р и м е р 4. Рекомбинантные молекулы ДНК расщепляют, денатурируют и гибридизируют с лейкоцитами поли(А)РНК, содержащими ИФН-амРНК. Гибриды рекомбинантных молекул ДНК-поли(А)РНК отделяют от негибридизированной поли(А)РНК (стадия С). Поли(А)РНК выделяют из гибридов и очищают (стадия Д). Выделенную РНК испытывают на активность ИФН-мРНК(стадия Е). Смесь полученных рекомбинантных молекул ДНК содержит рекомбинантную молекулу ДНК с последовательностью нуклеотидов, способной гибридизироваться с поли(А)РНК в жестких условиях гибридизации, а также вызывает образование ИФН- а в ооцитах. Если группа из 512 клонов дает положительную реакцию, клоны перегруппировывают в 8 партий из 64 и каждую партию испытывают. Этот процесс продолжают до тех пор, пока не будет идентифицирован единичный клон. Однако полученные рекомбинантные клоны не содержат полную последовательность с ДНК ИФН- а. Бактериальные клоны инокулируют на агаровые пластины с триптоновой средой. После инкубации при 37°С каждый клон разрастается в колонию несколько к.иллимет 11 13380 роп й диаметре Все колонии отмывают с ппаггмм и собирают, получают инокулум, испольчованчый Для инокулирования 1 л триптоновой среды, заполнившей, как описано выше ? л колбу Эрленмейера Культуру встряхивают при 37°С до появления ОДб50 примерно 0,8 (оценено визуально). Один обьем триптоновой среды и хлорамфеникола до 170 // г/мл прибавляют к культуре, которую снова встряхивают при 37°С в течение 16 ч. Прибавляют 20 мл хлороформа и культуру снова встряхивают 10 мин при 37°С, чтобы удалить бактерии. Культуру декантируют с хлороформом клетки собирают центрифугированием в течение 15 мин при 6000 об/мин при 4°С. Получают примерно 1-2 г клеток из каждого литра рецептуры. Клетки суспендируют в 30 мл 20 мМ ТрисНСІ (рН 7 5), центрифугируют 20 мин при ЬООО об/мин и 4°С, повторно суспендируют в 30 мл 50 мМ Трис-НСІ (рН 7,5). Прибавляют 0,25 объема раствора лизоцима (10 мг/мл в 50 мМ Трис-НСІ (рН 7,5), после охлаждения в течение 10 мин при 0°С прибавляют 0,33 объема (считая на объем исходной суспензии 50 мМ Трис-НОкультур), 0,5 М ЭДТУК (рН 8,0), осторожно перемешивают без встряхивания. Еще через 10 мин при 0°С прибавляют 1/16 объема (снова считая на первоначальный объем) 2% Тритона Х-100. Через 60 мин образец центрифугируют в течение 60 мин при 1000 об/мин и 0°С в роторе Надосадочный слой переносят в лабораторный стакан с магнитной мешалкой и прибавляют З М NaOH при перемешивании до тех пор, пока не будет достигнут рН 12,5, измеряя при 20°С. используя стеклянный электрод и рН-метр, стандартизированный стандартным карбонатным буфером Бекманн рН 10 (№ 3505). После перемешивания в течение 10 мин при 20°С устанавливают рН 8,5. После еще 3 мин перемешивания прибавляют 1/9 объема 5М NaCI и 1 объем фенола (перегнанного и уравновешенного 9,5 М NaCI) и интенсивно перемешивают еще 5 мин. Разделяют фазы центрифугированием при 10000 об/мин при 0°С в течение 10 мин. Надосадочный слой, содержащий форму 1 ДНК (круговая двуниточная ДНК), осторожно удаляют из промежуточной фазы (которая содержит однониточную ДНК) и 3 раза экстрагируют хлороформом. (Фенол должен быть полностью удален на этой стадии). Фракция 1 ДНК содержит рекомбинантные молекулы ДНК (pBR322-c/lHK вставка), первоначально использованные для трансформации этих клеток организма-реципиента, которые образуют часть 512 клонов, выбранных для испытания. 12 Прибавляют панкреатическую РНКазу А (5 мг/мл), предварительно нагретую в течение 10 мин при 85°С) к форме 1 ДНК до концентрации 20// г/мл и инкубируют смесь 5 в течение 60 мин при 37°С. Прибавляют 1 /5 объема 5 М NaCI и смесь обрабатывают 30% полиэтиленгликолем 6000 до окончательной концентрации 7,5% ПЭГ. После 2-16 ч при -10°С собирают осадок в роторе в течение 20 10 мин при 8000 об/мин и 0°С, растворяют в 0,075 М NaCI, 0,0075 М цитрата натрия до поглощения 20 при 260 нм и доводят до 0,5% ДСН. Раствор инкубируют 30 мин при 37°С с 0,5 мг/мл проназы (20 мг/мл, 2 ч при 37°С) 15 и 3 раза экстрагируют 1 объемом хлороформа. Центрифугируют образец (до 2 мл раствора ДНК на 1 мг/мл) при градиенте сахарозы от 5 до 23% в 50 мМ Трис-НСІ (рН 7,5), 1 мМ ЭДТУК в течение 15 ч при 21000 20 об/мин и 15°С. Собирают фракции и контролируют ОД260. Собирают фракции, содержащие ДНК, и осаждают ДНК ацетатом натрия и этанолом. Собирают центрифугированием 20-100 JH г смеси ДНК. 25 20// г ДНК обрабатывают в 150/* л 10 мМ Трис-НСІ (рН 7,5), 6 мМ МдСІ2, 50 мМ NaCI, 6 мМ 2-меркаптоэтанола, 200// г/мл БСА или желатина и 20 единиц Hind III. Эндонуклеазой Hind III расцепляют плазмиду pBR 322. 30 После 2 часов при 37°С аликвоты (1 %) подвергают электрофорезу на 1 % агарозном геле в 50 мМ трис-ацетате (рН 7,8), 2 мМ ЭДТУК в течение 1 ч при 50 мА, чтобы удостовериться о завершении рестрикции. Если обработ35 ка не закончена прибавляют еще Hind III и продолжают инкубацию еще 2 ч. Когда ДНК полностью расщеплена, прибавляют проназу, ЭДТУК и ДСН в количестве 0,5 мг/мл, 10 мМ и 0,5% соответственно. После 30 мин 40 при 37°С раствор экстрагируют 30 мл смесью фенол/хлороформ (1:1). Промывают 50 // л р-ра 20 мМ Трис-НСІ (рН 7,5), 1 мМ ЭДТУК. объединенные фазы экстрагируют 3 раза эфиром, фильтруют через колонку 0,1 45 мл, обработанную ЭДТУК, и осаждают 1/10 объема ацетата натрия и 2,5 объемами этанола. После хранения в течение ночи при 20°С ДНК собирают центрифугированием. Готовят две гибридизирующие смеси. 50 Смесь I содержит 4// л 10-кратно концентрированного буфера (4М NaCI, 0,1 ПИПС (рН 6.4, 1,4-пиперазиндиэтансульфокислота), 50 мМ ЭДТУК, 0,5 ц л (около 5 нг 125J-HIO6HH мРНК (5000 спм) и 6 мл индуцированной 55 лейкоцитарной поли(А)РНК(2/х г/ // л). Смесь II содержит 10// г обработанной Hind III ДНК и 0.1 /і г Pst-Z-pBR322 (H3)Rc/3 G 4,13 ДНК (производная pBR322, которая содержит последовательность /? -глобина в Hind III сай 13 13380 те). Обе смеси сушат в парах газообразного азота, Прибавляют 40 мл 80% формамида к остатку смеси II и денатурируют раствор в течение 10 мин при 100° С и быстро охлаждают на льду. Денатурированный раствор 5 используют для растворения смеси I, а полученный раствор инкубируют при 5б°С в течение 4 ч. После разбавления до 1 мл холодным 0,9 М NaCI, 0,09 М цитратом натрия и 100%-ным 10 формамидом до 4% (по объему), раствор фильтруют при 0,5 мл/мин через фильтр Миллипор (размер пор 0,45 мм), сначала фильтр испытывают на его способность удерживать гибриды ДНК/РНК, потому что 15 не все фильтры, полученные от производителя, в равной мере эффективны. Погружают указанные выше фильтр с гибридами поли(А)РНК в 1 мл 0,15 М NaCI, 0,015 М цитрат натрия, 0,5% ДСН в течение 20 10 мин при 37°С, промывают 50 мМ Трис-HCI (рН 7,5), 10 мМ MgCI2, 2мМ СаСІ2 и помещают в 0,6 мл свежего буфера. Добавляют Ъ}Л л ДНКазы, обработанной иодацета-том (5 мг/мл). Фильтр инкубируют при 37°С 25 в течение 10 мин. Удаляют фильтр и экстрагируют раствор 1 объемом фенола и 1 объемом эфира и пропускают через колонку с 0,1 мл. Прибавляют к раствору 5/г г РНК-носителя (РНК очищенных дрожжей) и осаждают 30 РНК ацетатом натрия4и этанолом. Осадок собирают центрифугированием при ЮОООхд, растворяют в 100 мл 1 мМ ЭДТУК, нагревают 90 с при 100°С и прибавляют THE и ДСН до 2 THE и 0,5% ДСН. Адсорбируют 35 РНК на колонке с 100/г г олиго dT/целлюло-зы, элюируют четырьмя промывками 0,3 мл дистиллированной воды и осаждают ацетатом натрия и этанолом. После 16 ч при -20°С осажденную РНК отделяют центрифугиро- 40 ванием и растворяют в 2 мл буфера ТНК. Раствор поли(А)РНК. полученный ранее, инъецируют в 40 ооцитов (примерно 5 нл в ооцит). Ооциты инкубируют при 23°С в течение 24-48 ч, гомогенизируют и центрифугиру- 45 ют (или инкубируют собранную среду) и испытывают, как описано ранее для ИФН-а. Проводят большинство последующих опытов с рекомбинантной молекулой ДНК из одного клона с ДНК, связанной с бумагой ДВМ или 50 ДРТ. Бумага ДРТ дает меньший фон. Листы ватмановской бумаги 540 (20 г) перемешивают 16 ч при 20°С со смесью 70 мл 0,5 М NaOH. 2 мг/л NaBH4 и 30 мл 1,4-бутадиен-, диглицидилового эфира. Затем бумагу перено- 55 сят в раствор 10 мл 2-аминотиофенола в 40 мл ацетона и перемешивают 10 ч. Отмывают ацетоном, 0,1 н. HCI. НгО. 0,1 н.НС!, НгО, сушат. Бумагу APT диазотируют до бумаги ДРТ. ДНК (до 15 и г) связывают на 50 мм диазотированной ARM (ДВМ) или диизотированной APT (ДРТ) бумаги. Гибридную плазмиду ДНК гидролизуют Pstl, обрабатывают 500 }Л г проназы на мл 0.5% ДСН и 10 мМ ЭДТУК в течение 30 мин при 37°С, экстрагируют фенолом и эфиром, пропускают через коленку 0,1 мл и осаждают этанолом. Инкубируют денатурированную нагреванием ДНК (до 5 щ г с малыми количествами добавленной 32Р-ДЛНК в качестве метки) при 0°С в течение ночи с 1 см бумаги ДВМ или ДРТ в 200 ju л 25 мМ калийфосфатного буфера (рН 6,5). фильтры промывают 3 раза по 5 мин при комнатной темперагуре 50 мМ калийфосфатным буфером (рН 6,5), 1% глицина и 3 раза 99%-ным перекристаллизованным формамидом. Далее инкубируют в 99% формамиде в течение 2 мин при 68%, потом 3 раза промывают в 50 мМ калийфосфатном буфере (рН 6,5) при 20°С и два раза промывают в 0.4М NaOH при 37°С в течение 10 мин. На фильтрах остается около 40-60% радиоактивности. Фильтры инкубируют 3 ч при 38°С в предварительно гибридизированной среде А, заполненной 1% глицина, используя 330 ft л на фильтр. Среда А содержит 50% формамида, 5хССК, 0,4% поливинилпирролидона, 0.04% фикола, 0,1% ДСН, 25//гполи(А)(Р и Z) и 100 г дрожжевой РНК/ВДН, экстрагированная 6 раз фенолом и осажденная этанолом. Фильтры дважды промывают в среде А, а затем гибридизуют в течение 16 ч при 38°С (поли(А)РНК, как указэно, обычно 5-8 мг) в среде А в парафиновом масле. Прибавляют РНК следующим образом: один влажный фильтр ДНК промокают и кладут в стерильную чашку Петри, 20-40 jii л раствора РНК наносят пипеткой на этот фильтр, а второй фильтр ДНК (ипи дубликат или контроль) кладут на верх и сэндвич покрывают стерильным парафиновым маслом. После гибридизации фильтры последовательно промывают в среде А (2 раза) в растворе, содержащем 1хССК. 0,2% ДСН, 1 мМ ЭДТУК (3 раза, 10 мин при 20°С каждый, среде А (2 ч при 38°С) и в 50% формамиде, 5хССК, 0,1% ДСН (3 раза, 10 мин при 20°С). Гибридизованную РНК элюируют при нагревании в течение 1 мин при 100°С в 200 // л 10 мМ Трис-НСІ (рН 7,4), 1 мМ ЭДТУК и 0,1% ДСН. Отбирают клон Ш-4-С, который содержит рекомбинантную молекулу ДНК, способную гибридизовать ИФН-«и РНК. Рексмбинантная молекула ДНК в этом клоне обозначена: Z-pBR322 (PstilHcIF4c/Hif-4c), а бактериальный штамм, со 19 15 держащий ее: E.coli X1776 (2J НсІГ04С (E.coli Hlf 4c). П р и м е р 6. Так как перв ия трансформированных клетої держат более одного вида река молекул ДНК, Hla-4c выделяй Х1776 (Hif-4C) клонов и очища^ Hif4C и pBR322 гидролизуют зируют электрофорезом на 1 геле. Е coli HB101 трансформигі ДНК. Отбирают 6 клонов трансф ных бактерий, стойких к тетрациі ляют из них ДНК, очищают и анают юк 8), 3 *аив анж ра і 60 м зба» 7°С) 200( іучаі риф НВ 27 28 13380 1 20 10 2 ный вес вещества составляет от 20000 до 30000, 50 9 Экстракт Hlf-35 (1 мл) и экстракт S100 в фракциях контрольного экстракта Hlf-32 E.coli HB101 (Z-pBR322(Pst)(Hc!F-SN32) активности не было обнаружено. ЧеИФН- а ("Hif-32 экстракты") хроматографируют на (специфическая активность 32 мл колонке Сефадекс G-100 при 4°С в 50 5 1,2x106 lu/мг) и Hlf-35-Hif-287-6 S100 эксмиллимолях К-фосфатного буфера (рН 7,4). тракты инкубируют с различными разбав Скорость потока составляет 2 мл/ч и отбира- ленными растворами антисыворотки овцы ют фракции объемом 1,0 мл. Определяют против ЧеИНФ-а (специфическая активность поглощение при 280 нанометров, 405 нано- 450000 единиц/мл) в 100 микролитрах метров (цитохром с) и ИФН-а активность. 10 модифицированной среды Eagles (MCE) с ИФН- а активность Hlf-35 экстрактов элюи- 10% сыворотки теленка в течение 30 мин при руют перед цитохромом с величиной кД 37°С и 45 микролитов анализируют на ИФН путем редукционного анализа 0,45. Следовательно, кажущийся молекуляр- активность цитопатического действия. 15 2h-A Препарат ИФН-а Антитело антилейкоцитарно Остаточная активность (единицы) )МО1 го интерферона ИФН-а (1U) ИФН-а(Ю) 0 5 0,18 9 450 0 0,18 9 450 0 0,18 9 450 0 450 ~0,5 < 0,1