Істотно чистий білок, що є тромболітиком, виділена днк, що його кодує, культура яйцеклітин xenopus laevis, трансформованих вектором, спосіб одержання активатора плазміногена, лікарський тромболітичний засіб

Настоящее изобретение относится к новому тромболитическому средству, способам его выделения и фармацевтического применения. Тромбозы обусловлены образованием сгустка крови в кровеносных сосудах. Различают венозные тромбозы, включая эмболию легочной артерии, и артериальные тромбозы, включая острый инфаркт миокарда. Эмболия легких и сердечный инфаркт являются опасными для жизни заболеваниями, требующими неотложного медицинского вмешательства. Кроме различных инвазивных способов, в последние годы развивается популярная форма терапии артериальных и венозных тромбозов, а именно ферментный тромболиз с плазминогенными активаторами. Эти вещества (названные тромболитиками) превращают плазминоген, неактивный профермент системы фибринолиза в крови, в активный протеолитический фермент, плазмин. Плазмин, в свою очередь, растворяет волокнистое вещество, фибрин, которое является основным компонентом кровяного сгустка; это приводит к открытию заблокированных сосудов и восстановлению кровяного потока. Однако плазмин является относительно неспецифической протеазой, т.е. однажды образовавшись в крови, она разрушает путем протеолиза компоненты крови, необходимые для интактного гемостаза (например, фибриноген) и в связи с этим при определенных обстоятельствах вызывает риск появления токсина, вызывающего кровоточивость тканей. Тромболитики первого поколения, стрептокиназа и урокиназа, являются соединениями, которые, будучи однажды введенными в систему кровообращения, систематически превращают плазминоген в плазмин и вызывают общий протеолиз. Поэтому терапевтическое лечение тромболиза с помощью этих веществ часто сопровождается осложнениями, обусловленными кровотечением. Для решения этой дилеммы был предложен фибрин-специфичный тромболиз, в котором применяются рекомбинантные плазминогенные активаторы тканевого типа, названные в целях краткости t-PA. В кровообращении t-PA имеет только низкое сходство с плазминогеном. Однако в присутствии волокнистого вещества, фибрина, с которым t-PA взаимодействует специфичными местами связывания, это сходство возрастает за счет многочисленного, результирующего в плазмине образования на поверхности тромба. Эта концепция может быть проверена in vitro и в экспериментах с животными. Клинические исследования тем не менее показывают, что для достижения быстрого растворения коронарного тромбоза требуются большие количества t-PA. Однако, если введены дозы t-PA такой величины, то это приведет к общему протеолизу, сопровождаемому относительным риском кровотечения, подобно тому, как это происходит в случае со стрептокиназой и урокиназой. Следовательно, сегодня речь идет об относительной фибринной специфичности t-PA. Причина этого заключается в основной характеристике t-PA: эта молекула является активной протеазой, которая при благоприятных условиях (высокая ферментная концентрация, длительная выдержка по времени, высокая концентрация субстрата, оптимальное значение рН и ионного окружения) будет превращать плазминоген в плазмин даже в отсутствии фибрина. Все эти условия имеются при проведении клинической стандартной терапии с t-PA. Во время исследований, для более специфичных плазминогенных активаторов, удовлетворяющих критерию специфичности фибрина, было найдено новое природное соединение, проявляющее фибринолитическую активность, называемое V-PA. Изобретение касается тромболитически активного вещества V-PA, полученного из слюны летучих мышей рода Desmodus spec., отличающегося следующими характерными свойствами: были открыты четыре различных кДНК из банка кДНК, полученных из слюнных желез, которые кодируют четыре различных V-PA белка: (1) V-PA a1: высокомолекулярная форма, состоящая из пальцевой области, области эпидермального фактора роста (EGF) , области Крингеля и области протеазы (пример 18). (2) V-PA a2: высокомолекулярная форма с теми же областями, что и V-PA a1, но отличная от V-PA a1 в нуклеотидной, также как и в аминокислотной последовательности. (3) V-PA b: молекулярная форма, состоящая из области EGF, области Крингеля и области протеазы (пример 18). (4) V-PA g: низкомолекулярная форма, состоящая из области Крингеля и области протеазы. Основная белковая полоска активного вещества V-PA a1 демонстрирует молекулярний вес порядка 43000±2000 (пример 2) при электрофорезе в геле додецилсульфат натрия при невосстановительных условиях. Основная белковая полоска активного вещества V-РА b демонстрирует молекулярный вес порядка 39000±3000 при электрофорезе на геле додецилсульфатнатрия при невосстановительных условиях и молекулярный вес порядка 43000±2000 – при восстановительных условиях (пример 1). – Активность активного вещества V–РА b элюирована из гелевой фильтрационной колонны ("Супероза" 12) с молекулярным весом порядка 40000±3000 (пример 1). – Изоэлектрические точки (рI) активного вещества V–РА b находятся между 6,8 и 8,5. – Активное вещество взаимодействует с 3Н-диизопропил-фторфосфатом и таким образом является протеазой серина (пример 9) . – Активные вещества V–РА a1 и V–РА b гидролизуют хромогенные пептиды: S-2288 (Н-D-Іlе-Рго-АгgpNA) и S-2444 (300 сек. В противоположность этому, признаки разложения фибриногена отсутствуют и в контрольных дозах и в дозах, соединенных с новым активным веществом. Этот опыт показывает значительно более высокую, если не абсолютную, фибринную специфичность нового активного вещества VPA b по сравнению с t-PA. При анализе аликват, проведенном путем гель-электрофореза, можно утверждать, что фибриноген в дозах с активным веществом нельзя отличить от фибриногена в контрольных дозах даже после 6 часов инкубации, поскольку может быть обнаружен только расщепленный фибриноген в дозах с t-PA после периода, равного только 2 часам. Пример 11 Связывание фибрина различных плазмино-генных активаторов и V-PA a1 и V-PA b В препаровальной кювете инкубируют при 37°С в течение 10 минут 100 л не содержащего плазминогена фибриноген (2 мг/мл) в РВS/0,01% "Твин" 80, 10 мл соответствующих плазминогенных активаторов в различных концентрациях и 10 мл тромбина (0,3 ед) . Затем образованный таким образом фибрин удаляют путем центрифугирования в течение 5 минут при 10000 г, а активность остаточного плазминогенного активатора определяют в супернатанте посредством метода чашечного (пластинчатого) тестирования фибрина и приводят в соответствие с исходным объемом. Параллельно с этим, при тех же условиях, готовят растворы плазминогенных активаторов без фибрина (контрольный; нет связывания). Фиг.19. Связывание РА с не содержащим плазминоген фибрином. V-PA a1 демонстрирует похожее хорошее связывание фибрина как и t-PA (фиг.19) . В противоположность этому, V-PA b проявляет существенно более слабое фибринное родство, чем V-PA a1. Это фибринное родство, проявляемое V-PA b, является, кроме того, сильно зависящим от концентрации NaCl (фиг. 19 см. в приложении). Пример 12. Сравнительные кинетики Glu-плазминогенной активации с помощью t-РА и V-PA b (A) В сосуде инкубируют в 20 мМ Трис рН 7,4 и 170 мл 20 мМ Трис рН 7,4/0,01% Твин 80 при 37°С и помешивании 20 мл плазминогенного активатора, 10 мл мономера в фибрине (60 мг/мл) в 20 мМ Трис рН 7,4/600 мМ мочевины, 50 мл плазмин не содержащего плазминогена (возможные концентрации от 0 до 6 мМ в полной реакционной дозе) . (B) В дополнительных трубках при 37°С содержат соответственно 100 мл хромогенного, плазмин-специфичного субстрата S 2251 (3 мМ) в воде и 400 мл 20 мМ Трис рН 7,4/180 мМ NaCl. В различные моменты времени отбирают 20 мл из (А) и переносят в трубку (В), инкубируют в течение следующего часа при 37°С и реакцию останавливают 300 мл 1М лимонной кислоты. Плазмин, образовавшийся в инкубационной дозе, расщепляет пептидную группу хромогенного субстрата S 2251 с высвобождением р-нитроанилина. Указанный р-нитроанилин измеряют фотометрически при 405 нм. Аналогично описанной выше схеме получают градуировочную кривую с чистым плазмином, на основании которой можно непосредственно рассчитать концентрацию образованного плазмина. На фиг.20 (V-PA b и фиг.21 (t-PA) - нанесены полученные данные. Для этой цели скорость образования плазмина нанесена напротив концентрации плазмина. В случае с t-PA получена типичная кинетика Михаэлиса-Ментена. При перенесении указанных данных t-PA на график Лайнвэйвера-Барка (вставка на фиг. 21) получают прямую линию. Совершенно отличная картина получается при нанесении на график данных V-PA b. Плазминогенный активатор V-PA b демонстрирует отличное кинетическое поведение от t-PA. Полученная кривая не следует кинетике Михаэлиса-Ментена, но демонстрирует типичное поведение аллостерического фермента; график Лайнвэйвера-Барка также дает типичную кривую для аллостерического фермента (фиг. 20) . Плазминогенный активатор V-PA b в отличие от t-PA является аллостерическим ферментом. Пример 13 Действие V-PA b на восстановленную систему растворения сгустка (International Clot-Lysis Assay) Очищенный фибриноген человека получен для свертывания с тромбином в присутствии постоянного количества плазминогена человека и различных концентраций плазминогенного активатора. В образованном таким образом сгустке плазминоген затем превращается в плазмин с помощью плазминогенных активаторов. Этот плазмин, в свою очередь, растворяет волокнистое вещество фибрин в сгустке. Замеряют время между добавлением тромбина и полным растворением сгустка и наносят двойным логарифмированием на концентрацию плазминогенного активатора. В соответствии с описанным выше правилом, 12,5100 мл забуференного раствора очищенного активного вещества тестируют и сравнивают с 12,5-100 Иед. t-PA. Результаты приведены на фиг. 22. Новое активное вещество V-PA b, по сравнению с t-PA, дает параллельную кривую концентрация эффект. 100 мл раствора очищенного активного вещества содержат, в соответствии с данными теста, около 40 единиц t-PA - сравнимой активности. Более детальное описание теста: Лиофилизованный контрольный тромбин (Behring, Марбург) растворяют в 1 мл дистиллированной воды. Это составляет 30 ед/мл активности. Плазминоген человека (Kabi, Мюнхен) растворяют в 2 мМ НС1+50% глицерина+5 г/л PEG 6000. Активность в результате составляет 10 Ед/мл. Фибриноген человека (Kabi, Мюнхен) доводят до концентрации 2 мг/мл свертываемого белка в фосфатном буфере, имеющем следующий состав: 1,605 г/л КН2РO4; 8,58 г/л Na2HPO4 x x 2H2O; 100 л/л Твин 80; 500 мг/л сывороточного альбумина человека. Стандартный t-PA разбавляют до активности 1000 Иед/мл. 20 мл плазминогена+100 мл тромбина вносят пипеткой в контрольную трубку и инкубируют при 37°С. 1 мл фибриногена и 12,5-100 мл плазминогенного активатора добавляют одновременно и включают секундомер. Через 2 минуты на сгусток помещают стеклянный шарик (диаметром 6 мм). Как только стеклянный шарик достигнет дна контрольной трубки, секундомер останавливают и записывают время. Пример 14 Связывание V-PA b и t-PA с лизином "Сефароза" 4В Плазминные активаторы доведены до соответствующих значений рН и обработаны при этих условиях лизином "Сефароза". Лизин "Сефароза" тщательно промывают, а активность определяют в комбинированных супернатантах. Опыты по элюции с малыми количествами V-PA можно не проводить. Пример 15 Казеинолизис V-РА b и t-PA Активность плазминогенных активаторов может быть определена с помощью так называемого теста фибриновых пластинок (Astrup Т and Mullertz in Arch Biochem.Biophys. 40:346-351, 1952). Плазминогенные активаторы инкубируют в предварительно пробитых отверстиях при 37°С. В случае присутствия плазминогена образованный таким путем плазмин будет лизировать фибрин, и образуется ореол лизиса, диаметр которого зависит от концентрации примененного плазминогенного активатора. Ожидается, что фибриноспецифичный плазминогенный активатор не будет взаимодействовать с другими белками, а только с фиб рином. Это может быть проверено описанными выше способами, заменяя фибрин казеином с плазминогеном (фиг. 24 ). Как видно из фиг. 24, V-PA b, по сравнению с t-PA, не демонстрирует появление ореолов лизиса гделибо на плазминогенсодержащих казеиновых пластинках. Эти точки подтверждают абсолютную фибринную специфичность V-PA b. Пример 16 Определение Кm значения различных амидолитических субстратов с плазминогенными активаторами t-PA, урокиназой и активных форм V-PA a1 и V-PA b В чашечке (пластинке) с 96 отверстиями инкубируют соответственно 90 мл 100 мМ Трис рН 8,0 (100 мл NaCl) 0,01% Твин 80 и 50 мл соответствующего хромогенного субстрата (все из Стокгольма, Швеция) с конечной концентрацией, равной 0,03/0,06/0,1/0,3/0,6 и 1 мМ с 10 л (3 единицы на отверстие) соответствующего плазминогенного активатора при 37°С, а высвобождаемый таким образом р-нитроанилин определяют фотометрически при 405 нм в различных точках в период времени от 1 до 7 часов. Результирующие данные были обработаны с помощью графика Лайнвэйвера-Барка, а значение Кm определено (Segel, I.M. Enzyme Kinetics, John Weley and Sons, New York). Были использованы следующие хромогенные субстраты: H-D-Val-Leu-Lys-pNa (S-2251) H-D-Ile-Pro-Arg-pNa (S-2288) 80%). Последовательности выделенных белков также демонстрируют высокую идентичность последовательности с частями t-PA человека (>70%). Ни один из клонов не содержит кДНК для полного гена плазминогенного активатора летучей мышивампира. Парциальные последовательности одного из этих клонов служат в качестве пробы для скрининга дополнительного банка генов кДНК из слюнных желез. (Пример 18). Пример 18 Выделение, идентификация и секвенирование полных клонов кДНК плазминогенных активаторов из слюнных желез Desmodus rotundus 1. Получение банка генов кДНК из РНК слюнных желез Desmodus rotundus Выделяют целую РНК из слюнных желез летучих мышей-вампиров (D.rotundus) путем разложения изотиоцианатом гуанидина и последующим ультрацентрифугированием посредством хлоридцезиевой прокладки (I). Из трех миллиграмм лиофилизованной целой РНК получают 80 мг поли А+ РНК путем дважды проведенной аффинной хроматографии на олигодеокситимидиновой целлюлозе (2,3). Пять микрограмм этого препарата использовано для синтеза кДНК согласно методу Габлера и Хоффмана (4) с некоторыми модификациями "LAP-cDNA" Synthesis Kit, Stra-tagene (5,6). Синтез первой нити начинают с помощью олигонуклеотида, содержащего олиго-деокситимидиновую пропорцию и узнавание последовательности рестрикционной эндонуклеазы XhoI (6), и проводят путем обратной транскриптазы вируса лейкемии Moloney mirine с использованием 5-метилдеоксицитина. Вторую нить синтезируют с помощью E.coli ДНК полимеразы I в присутствии E.coli рибонуклеазы Н. Концы образованной таким путем двойной нити кДНК сглаживают Т4 ДНК полимеразой и затем связывают с EcoRI адаптерами с использованием Т4 ДНК липазы. Результирующие концы ДНК фосфолируют с помощью Т4 полинуклеотидной киназы. После гидролиза кДНК с рестрикционным ферментом XhoI, проводят гель-фильтрацию на "Сефарозе" CL-4B (Pharmacia). Комбинируют фракции, содержащие кДНК с минимальным размером 500 пар оснований; масса составляет около 1,2 мг кДНК. Одну треть этого количества получают для связывания с 3 мг EcoRI-XhoI гидролизованными рестрикцией и дефосфолированными ветвями вектора UniLAP(ТМ)ХР бактериофага (дополнительный патент) фирмы Stratagene (La Jolla, USA) (5,7). Дозу лигирования упаковывают в семь отдельных доз с использованием "Gigapack" II Cold Packaging экстрактов (Stratagene) (8). Таким путем получают первичный банк генов кДНК с более чем 4х106 рекомбинантных лямбда-бактериофагов. 2. Идентификация клонов кДНК плазминогенных активаторов из слюны летучей мыши-вампира Desmodus rotundus Пробой, используемой для идентификации клонов полной кДНК, является фрагмент ДНК, полученный рестрикционным разложением AluI-BamHI, длиной 76 пар оснований (нуклеотид 141-216 на рисунке 26с) из 5'-конца клона, выделенного из первого банка гена кДНК (см.пример 17). Этот фрагмент метят радиоактивно никтрансляцией (9) в присутствии [a-32p] трифосфата деоксиаденозина и используют для гибридизации "реплика" фильтров, на которых иммобилизуют ДНК из, общей сложностью, 1,2х105 рекомбинантных бактериофагов первичного банкгенов кДНК. (10). Температура гибридизации и промывания составляет 50°С. Окончательная промывка проводится в буфере 2xSSC (10) . Более чем 200 клонов испускают сигнал при ауторадиографии на "Replika" фильтрах, 50 клонов очищены путем раздельного засева на планшетах и повтора гибридизации на планшетах-фильтрах. Таким путем выделяют 38 клонов, которые при повторном скрининге дают четкий позитивный сигнал. 3. Идентификация и секвенирование клонов кДНК Плазмиду pBluescript SK, содержащуюся в изолированных позитивных клонах бактериофага UnitLAP(ТМ)ХР, являющуюся составной частью фрагмента кДНК, интегрированного в том же сегменте бактериофага, выделяют из бактериофага так называемым "иссечением in vivo" (7,14), получая таким образом в общем 35 различных клонов плазмид pBluescript SK, происходящими из позитивных клонов бактериофага. Плазмиды изолируют в соответствии с методом Бирнбойма и Долли (II), а их кДНК пропорцию делят на четыре различных класса a1, a2, b, g в соответствии с анализом рестрикции с ферментами BamHI и PstI (фиг.25) и ДНК секвенированием 5'-концов. Пропорции кДНК самых длинных кДНК клонов из всех четырех классов субклонируют в векторах М13 mp19 бактериофага (12) и секвенируют дидеоксинуклеотидным методом Зангера (набор "Секвеназа", United States Biochemical Corporation, Кливленд, США). (13, 15) используя, частично, олигонуклеотидные праймеры, которые специально синтезируют для этой цели и которые являются комплементарными последовательностями кДНК пропорций. Полные последовательности кДНК (включая короткий сегмент полиА цепочек, присутствующих на 3'-конце) с выделенными таким путем дебелковыми последовательностями представлены на фиг. 26 а, b, с, d. Фиг.25. Образец рестрикции отобранных клонов плазмиды pBluescript с соответственно самыми длинными пропорциями кДНК из четырех групп альфа I (2 плазмидных клона), альфа 2 (1 плазмидный клон), бета (4 плазмидных клона) и гамма (1 плазмидный клон). Плазмидные ДНК препараты, гидролизованные рестрикционными ферментами BamHI ("В"), PstI ("P") или смесью двух рестрикционных ферментов ("ВР"), были разделены на 1,8% гель-агарозе. Критерий размера представлен плазмидой рВР322 ("М", марке молекулярного веса ДНК 5 фирмы Boehringer-Mannheim), гидролизованной ферментом рестрикции HaeIII. Размер четко видимых фрагментов составляет 587, 540, 504, 458, 434, 267, 234, 213, 192 до 184 и 123 пар оснований (от вершины до основания) . После электрофоретического разделения гель-агароза был окрашен этилиумбромидом и сфотографирован. Из групп альфа I и бета левые наиболее окрашенные клоны были, соответственно, секвенированы. Рис.26а: полная ДНК последовательность встройки кДНК наиболее длинного плазмидного клона в группе альфа-1 с выделенной аминокислотной последовательностью. Кодирующая последовательность начинается с нуклеотида 94 (ATG...) и заканчивается терминирующим кодоном на нуклеотиде 1527 (...ТАА). Выделенная аминокислотная последовательность указана в однобуквенном коде, каждая аминокислота расположена под первым нуклеотидом триплета, которым она кодируется. Фиг.26b: полная ДНК последовательность встройки кДНК плазмидного клона типа альфа-2 с выделенной аминокислотной последовательностью. Кодирующая последовательность начинается нуклеотидом 85 (ATG...) и заканчивается терминирующим кодоном на нуклеотиде 1518 (...ТАА). Выделенная аминокислотная последовательность указана в однобуквенном коде, каждая аминокислота расположена под первым нуклеотидом триплета, которым она кодируется. Фиг.26с: полная последовательность ДНК встройки кДНК наиболее длинного обнаруженного плазмидного клона в группе бета с выделенной аминокислотной последовательностью. Кодирующая последовательность начинается нуклеотидом 117(ATG...) и заканчивается терминирующим кодоном на нуклеотиде 1412 (...ТАА). Выделенная аминокислотная последовательность указана в однобуквенном коде, каждая аминокислота расположена под первым нуклеотидом триплета, который ее кодирует. Фиг. 26d: полная ДНК последовательность встройки кДНК плазмидного клона типа гамма с выделенной аминокислотной последовательностью. Кодирующая последовательность начинается нуклеотидом 180 (ATG...) и заканчивается терминирующим кодоном на нуклеотиде 1364 (...ТАА). Выделенная аминокислотная последовательность указана в однобуквенном коде, каждая аминокислота расположена под первым нуклеотидом триплета, который ее кодирует. Пример 19 Конструирование векторов экспрессии, содержащих последовательности, кодирующие активное вещество V-PA, и тестирование их путем микроинъекции в ооциты Кодирующие последовательности из кДНК клонов форм V-PA a1, a2, b,, и получены путем гидролиза с рестрикционной эндонуклеазой EcoRI, и после обработки фрагментом Кленова E.coli ДНК полимеразы I, а также выделения из агароза-гелей с низкой температурой плавления, вшиты в сайт Xbal вектора pSVLEcoRI, наполненный фрагментом Кленова E.coli ДНК полимеразы I и обработаны фосфатазой кишечника теленка (Boehringer Mannheim). Правильная ориентация проверена BamHI. pSVL-EcoRI поражает производную коммерчески доступной SV40 эксперсионной плазмиды pSVL (Pharmacia) (см. приложение). Полученные таким путем векторы экспрессии очищают на градиенте хлорида цезия и используют для микроинъекции в ооциты. Инъекция ооцитов осуществляется согласно следующим перечисленным статьям. После внедрения культуры ткани в среду ооцитов, инъектированных векторами экспрессии V-PA, на фибриновом планшете, полученном с помощью среды Барта (см. литературу по п.2), образуются ореолы лизиса. Если вместо фибрин-планшета использовать казеин-планшет, то лизис не происходит (a1, a2, b) . Ооциты, инъектированные вектором, не содержащим последовательность V-PA, не дают ореола лизиса. кДНК последовательности V-PA содержат функциональную сигнальную пептидную последовательность, ответственную за вынос белка V-РА за пределы клетки. Эти результаты ясно показывают, что полученные таким путем клоны кДНК V-РА являются полными и после встройки в подходящий вектор экспрессии вырабатывают активное эффективное вещество, которое является абсолютно фибрин-специфичным. Фиг. 1 Фиг. 2 Фиг. 3 Фиг. 4А Фиг. 4В Фиг. 5 Фиг. 6 Фиг. 7 Фиг. 8 Фиг. 9 Фиг. 10 Фиг. 11 Фиг. 12 Фиг. 13 Фиг. 14 Фиг. 15 Фиг. 16А Фиг. 16B Фиг. 17А Фиг. 17В Фиг. 18 Фиг. 19 Фиг. 20 Фиг. 21 Фиг. 22 Фиг. 23 Специфичность фибрина V-PA и t-PA Фиг. 24 Фиг. 25 Фиг. 26а Фиг. 26а (продолжение) Фиг. 26b Фиг. 26b (продолжение) Фиг. 26с Фиг. 26с (продолжение) Фиг. 26d